Name: Genereren van Composite Planten in Medicago truncatula Gebruikt voor nodulatie Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Leer hoe je haarwortelcomposietplanten genereert in Medicago truncatula voor nodulatieonderzoek. Deze Agrobacterium-methode levert snel transgene wortels zonder weefselkweek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Chris Taylor (Ohio State University) bedanken voor de invoering van harige wortel-technologie om ons lab en Drs. Senthil Subramanian (South Dakota State University), Juan Zhang (Ludong University, Shandong China) voor het verbeteren van het protocol. We danken ook Dr Hao Cheng (Nanjing Landbouw Universiteit) voor het helpt bij het maken van deze video. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) en de USDA (2010-65116-20514) om OY

Het volgende protocol is gebruikt om harige wortel composiet planten te genereren in een modelgewas soort M. truncatula. Soortgelijke protocollen zijn aangepast voor ten minste acht plantensoorten 1-4. We gebruikten M. truncatula harige wortel composiet planten gen functies in de wortel en nodule ontwikkeling te bestuderen. Het protocol werd gescheiden in vier delen: 1) het bereiden van plantaardige materialen, 2) het genereren van harige wortel samengestelde planten; 3) symbiotische rhizobia infectie en 4) transgene wortel identificatie. We gebruikten de binaire vector die het groen fluorescerend eiwit (GFP) gen als verslaggever voor het screenen van transgene wortel in samengestelde planten 3. In vergelijking met antibiotica op basis van selectie, GFP-gebaseerde screening is snel, eenvoudig en goedkoop. In ons bouwen, is de ER-expressie-geoptimaliseerde GFP-gen aangestuurd door de super ubiquitine-promoter, die een sterke constitutieve GFP-signalen in transgene wortels heeft, zodat u gemakkelijk onderscheid te maken tussen transgene en niet-transgene wortels. 1. Voorbereiden Plant Materialen <ol><li> M. truncautla zaden worden geoogst van planten gekweekt in een kas (50% relatieve vochtigheid, 16 / 8 uur licht / donker, 22/18 ° C dag / nacht temperatuur). Rijpe zaden kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Ongeveer 100 zaden worden scarified in 10 ml geconcentreerd zwavelzuur (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) gedurende 10 minuten met periodieke schudden. </li><li> De zaden zijn 5-7 keer gespoeld met steriel water onder zacht schudden. </li><li> De zaden worden dan geweekt in water bij kamertemperatuur gedurende 6 uur en bewaard bij 4 ° C voor 36-48 uur om ontkieming synchroniseren. </li><li> Ongeveer 20-30 zaden worden verspreid op een vochtige papieren filters geplaatst in een petrischaal. Ze worden gehouden bij 22 ° C, met 16 / 8 uur licht / donker-cyclus, en 40 μmol.m -2. S-1 lichtintensiteit, gedurende 5-6 dagen. </li><li> Gekiemde zaailingen worden overgedragen in de bodem en in kas voor een maand. </li></ol> 2. Het genereren van Hairy Root Composite Planten <ol><li> Binaire constructies dragen genen van belang zijn omgezet in A. rhizogenes met behulp van standaard protocollen. Wij hebben een reeks van binaire vectoren die het GFP-gen als een marker die screening van transgene weefsels te vergemakkelijken. Deze vectoren bevatten verschillende promotoren en hebben allemaal Gateway kloneringsplaatsen (Invitrogen, Carlsbad, CA) voor de over-expressie of silencing van gerichte genen 3,5. </li><li> A. rhizogenes is gekweekt in 50 ml LB-medium met een geschikte antibiotica selectie bij 28 ° C gedurende 16-24 uur. </li><li> De bacteriën worden verzameld en opnieuw gesuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van OD 600 = 0,3 in een stikstof-vrije plantenvoeding oplossing (tabel 1 en 6). </li><li> Ter ondersteuning van harige wortel regeneratie, een gesteriliseerde ondersteunende matrix ("Rock Wol", Hummert International, Earth City, MO) is gesneden in stekkers van ongeveer 3 cm 3. We plaatsen 4 pluggen in een petrischaal. </li><li> Een gat is prikte op elkaar aansluiten met behulp van een pipet tip om het inbrengen van explantaten te vergemakkelijken. A. rhizogenes (5 ml) wordt toegevoegd aan elke stekker. </li><li> Een shoot gedeelte met 2-3 okselknoppen is uitgesneden door een schuine snede. De Explantatie wordt dan in de stekker, en gegroeid bij 22 ° C voor ongeveer drie weken. We houden de Medicago explantaten zonder water voor de eerste 10 dagen, daarna, geef ze water met 5 ml stikstof-vrije oplossing wanneer dat nodig is. We vonden dat het verwijderen van het apicale meristeem kan de vorming van onvoorziene wortels verminderen. </li></ol> 3. Symbiotische rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) Infectie <ol><li> Na drie weken, zullen sommige onvoorziene wortels komen uit de steenwol. De harige wortel composiet planten worden overgebracht naar zand of vermiculiet (gesteriliseerd), met of zonder de steenwol. Ze worden gekweekt in de kas bij 22 ° C, 16 / 8 uur licht / donker-cyclus, en 300 μmol.m -2. S -1 lichtintensiteit voor een week. </li><li> Voorafgaand aan de rhizobia infectie, S. meliloti 1201 is gekweekt in 50 ml gistextract-mannitol medium voor 7 dagen bij 30 ° C (tabel 2, en 6,7). </li><li> Geresuspendeerd rhizobia cellen worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van OD 600 = 0,08 met behulp van stikstof gratis voeding oplossing. Een 10-ml vers surseance van S. meliloti werd toegepast voor elke samengestelde plant tot de vorming van knobbeltjes induceren. </li></ol> 4. Transgene Root Identificatie <ol><li> Twee weken na de rhizobia inoculatie, de samengestelde planten up-geworteld door wassen in water. De wortels kunnen gemakkelijk worden gescheiden van zand of perliet in water. </li><li> We plaatsen de harige wortels onder een UV-microscoop (Nikon SMZ1500, excitatie 460-500nm, 505nm Dichroic, Barrier meer dan 510nm). De transgene wortels zijn GFP positieve en de onvoorziene wortels GFP negatief. We dan verzamelen de wortels according het GFP-signaal, en tel de knobbel getallen, het meten van de wortel lengte, en bereken laterale wortel dichtheid. De GFP negatieve wortels worden gebruikt als controle. </li></ol> 5. Vertegenwoordiger van Result In ons experiment, de nieuwe haarwortels geregenereerd uit de explantaten in 2-3 weken na het A. rhizogenes inoculatie. Onder de UV-microscoop, transgene wortels het dragen van de GFP-gen vertonen sterke groene fluorescentie (Fig 1). De hoeveelheid van geregenereerd wortels en het deel van de GFP positieve wortels hangt af van de voorwaarden van explantaten en de groei omgeving van composiet plants.On gemiddeld 25% van de geproduceerde wortels werden transgene harige wortels 3. Om de transformatie efficiëntie, 1) te verhogen de plastic afdekking ondergang, zoals te zien op de video, is genoeg om de vochtigheid in de groei lade voor de eerste paar dagen te behouden, en planten vereisen slechts weinig water in de eerste paar dagen. Overmatig water is schadelijk voor harige wortelvorming, 2) de concentratie van Agrobacterium innoculant is belangrijk voor de transformatie. Overmatige hoeveelheid cellen niet nuttig om harige wortel vorming of de vorming van knobbeltjes. Voor de vorming van knobbeltjes, de gieter oplossing moet worden stikstof-vrij, anders zal weinig knobbeltjes vormen. De harige wortel composiet planten kunnen worden gegenereerd met behulp van zaadlobben of entact zaailingen als het uitgangsmateriaal. Slechts geringe wijzigingen van de bovengenoemde protocol ncessary te harige wortels van andere weefsels 8 te genereren. Belangrijk is dat iedere harige wortel is een onafhankelijke modificatie. Daarom is de fenotypes waargenomen in een composiet plant zijn de som van de verschillende transforamtion gebeurtenissen die moest worden bevestigd door de herhalingen in meerdere samengestelde planten <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. A. Transgene wortels kunnen worden gesorteerd uit harige wortels. B. Knobbeltjes werden gevormd in de harige wortel composiet planten. We plaatsten 4-weken oude M. truncatula harige wortel planten onder de UV-microscoop en het GFP-positieve wortels gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. (Rode pijl: GFP wortel; Gele pijl: niet-GFP root) <table border="1"><tbody><tr><td> Voorraad </td><td> g/200ml </td><td> ml bouillon / liter </td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 12,3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> 14,7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 0.3 H 2 O </td><td> 6.8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Fe Cl 3 0.6 H 2 O </td><td> 0.49 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Micronutriënten </td><td> Zie hieronder </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Micronutriënten </td><td> g per liter </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0.142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0.077 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 0.1725 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O </td><td> 0.037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td> CoCl 2. H 2 O </td><td> 0.0025 </td></tr><tr><td> NiSO 4 </td><td> 0.001 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Nitogen-vrije voeding oplossing <table border="1"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Gist Extract </td><td> 0.4g </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 10g </td></tr><tr><td> pH = 6,8 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 2. Gistextract mannitol medium (per liter)

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

Het genereren van harige wortel composiet plant is een snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden van transgeen materiaal voor vele dicotyle soorten te verkrijgen. Hoewel deze methode kan geen transgene zaden kan produceren transgene materialen in een paar weken. De methode is vooral geschikt voor planten die moeilijk tot oprichting van weefsel culturen of het genereren van stabiele transformanten te hebben. In de loop der jaren, hebben we gebruik gemaakt van deze technologie om genfuncties, promoter functies, microRNA, wortel en laterale wortel ontwikkeling, defensie en abiotische stress respons, nodulatie en andere symbiotische processen, hormonale reacties, metabool profiel, gen profilering, proteoomanalyse, en studie andere biologische processen. Het protocol is robuust en herhaalbaar.

genereren van composite planten in medicago truncatula gebruikt voor nodulatie assays

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Net als bij Agrobacterium tumerfaciens, kan Agrobacterium rhizogenes overbrengen vreemde DNA in plantencellen gebaseerd op de autonome root-inducerende (Ri) plasmide. A. rhizogenes kan harige wortelvorming op plantaardige weefsels en vorm composiet planten na transformatie. Op deze samengestelde planten, een deel van de geregenereerde wortels zijn transgeen, het dragen van de wild type T-DNA en de kunstmatige binaire vector, terwijl de scheuten nog steeds niet-transgene, dienen om energie en de groei te ondersteunen. Deze harige wortel samengestelde planten zullen niet produceren transgene zaden, maar er zijn een aantal belangrijke kenmerken die deze samengestelde planten zeer nuttig te maken in plant-onderzoek. Eerste, met een breed gastheerbereik, A. rhizogenes kan transformeren vele plantensoorten, vooral tweezaadlobbigen, waardoor genetische manipulatie in een verscheidenheid van soorten. Ten tweede, A. rhizogenes direct infecteren weefsels en explantaten, geen weefselculturen voorafgaand aan de transformatie is nodig om composiet planten te verkrijgen, waardoor ze ideaal zijn voor de transformatie van recalcitrante plantensoorten. Bovendien kan transgene wortelweefsels worden gegenereerd in een kwestie van weken. Voor Medicago truncatula, kunnen we krijgen transgene wortels in zo kort drie weken sneller dan normaal floral dip Arabidopsis transformatie. Over het geheel genomen de harige wortel composiet plant-technologie is een veelzijdig en nuttig instrument om genfuncties studie en wortel-gerelateerde fenotypes. Hier laten we zien hoe de harige wortel composiet planten kunnen worden gebruikt om de plant-Rhizobium interacties en nodulatie studie in het moeilijk te transformeren soorten M. truncatula.

Laten we zien hoe harige wortel composiet planten kunnen worden gebruikt om de plant-Rhizobium interacties en nodulatie studie in het moeilijk te transformeren soorten<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

Genereren van Composite Planten in Medicago truncatula Gebruikt voor nodulatie Assays

Net als Agrobacterium tumefaciens kan Agrobacterium rhizogenes vreemd DNA overbrengen naar plantencellen op basis van het autonome wortelinducerende (Ri) ...

Hallo, mijn naam is Oliver Yu van het Dan Plant Science Center. Vandaag gaan we laten zien hoe u Ute Compote-planten genereert via Agrobacterium Ogn. Deze techniek is naar het Dan Center gebracht door Dr. Chris Taylor, momenteel verbonden aan de Ohio State University.Verschillende van mijn voormalige groepsleden hebben deze technieken in de loop der jaren verbeterd en vandaag de dag hebben mijn huidige groepsleden, Dr. Stone en Mao, deze video samengesteld om te laten zien hoe Harry Root Composite Plants worden geproduceerd. Agrobacterium ZOS lijken sterk op Agrobacterium tumefaciens in dat ze vreemd DNA in planten introduceren, maar ZOS kunnen een hogere wortelvorming van wild-type weefsels induceren, waardoor composietplanten zoals deze ontstaan. Bij deze composietplanten zijn sommige van de wortels dus transgeen, terwijl de scheuten nog wild-type zijn.Daarom zal deze technologie geen transgene zaden produceren. Er zijn echter drie belangrijke voordelen van planten met een hoge wortelcompetentie die deze technologie zeer nuttig maken. Ten eerste kunnen veel plantensoorten, met name dicotyle soorten, worden getransformeerd door Agrobacterium.Ten tweede hoeven we geen weefselkweek op te zetten voorafgaand aan de transformatie. We kunnen diverse plantendelen gebruiken, zoals zaailingen, scheuten en wortels, om direct transgene planten te genereren. En tot slot kunnen we binnen enkele weken transgene wortelweefsels verkrijgen.Voor transgene soja- en medicago-wortels kunnen we binnen drie weken transgene wortels verkrijgen, wat sneller is dan een OPIS-transformatie. Over het algemeen is de technologie voor wortelcelplanten een zeer nuttig instrument om genfuncties en wortelgerelateerde fenotypes te bestuderen. Hallo, mijn naam is Ong.Hallo, mijn naam is, dit is mijn cameraman Bill. Vandaag introduceren we het Harry root Composite Plant-protocol. Ja, we gebruiken dit protocol in verschillende van onze projecten.Ik heb al, we zijn begonnen, ja. Ja. Voor onze demonstratie gebruiken we meta cargo Tula als voorbeeld. Dit zijn meta cargo volwassen pods.Plaats de peulen op een maalbak en maal de peulen vervolgens met een lange, stevige beweging. Scheid de zaden van de peulen door voorzichtig te schudden en plaats de zaden in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter geconcentreerd zwavelzuur toe.Zeer voorzichtig scannen. Dit duurt ongeveer 10 minuten. Vortex de buis twee tot drie keer.Tijdens de zuurbehandeling zal de zaadhuid veranderen naar een gele kleur. Verwijder het zwavelzuur uit de buis en spoel de zaden minstens vijf keer af met steriel water. Week de zaden zes uur lang in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens twee dagen bij 4 °C.Om de kieming te synchroniseren: verdeel 20 tot 30 zaden op vochtig filterpapier in de Petri-schaal. Na vijf tot zes dagen worden de kiemende zaden overgebracht naar de bodem en vervolgens vier weken lang opgekweekt in de kas.Voor samengestelde planttransformatie gebruiken we gewoonlijk de agrobacteriumstam Zony K 5 99. De shuttlevector of binaire vector kan in de K 5 99 worden getransformeerd volgens het standaardprotocol voor agrobacterium tumor facit-transformatie. Inoculeer de agrobacterium en kweek deze gedurende 16 tot 24 uur bij 30 °C. Verzamel de cellen door de cultuuroplossing in een centrifugebuis van 50 mL te plaatsen.Centrifugeer dit bij 5, 000 G gedurende 30 minuten. Resuspendeer de pellet met stikstofvrije voedingsoplossing. Zorg ervoor dat de agrobacteriumcellen worden verdund tot 0.3 bij OD 600.Deze concentratie is belangrijk voor een maximale transformatie. We gebruiken rotswand als ondersteunende matrix. Het gebruik van dit materiaal is essentieel voor een hoge transformatiefrequentie.Snijd de steenwol op de juiste maat. Plug. Maak aan de bovenkant een gat van ongeveer anderhalf tot twee centimeter in diameter. Voeg met behulp van een pipetpunt vijf milliliter Resuspended Agrobacterium Zony-oplossing toe aan elke plug.Selecteer een stengelstuk met twee tot drie axillaire knoppen en maak een schuine snede. Steek de plantstukken in het gat in de rotswand. Plaats de gesneden planten gedurende drie weken in een groeikamer of op een laboratoriumtafel.Voeg elke 10 dagen vijf milliliters voedingsoplossing toe aan elke plug. Na drie weken zijn de wortels geregenereerd vanaf de snijkant. Week de plant in water.Verwijder de geweekte rotswand voorzichtig en beschadig de wortels niet. Zorg ervoor dat de volledige rotswand wordt verwijderd. De harige wortel-composietplanten kunnen worden overgeplaatst naar zand of perliet. Voor symbiosis-experimenten dient de rhizobium zeven dagen lang bij 30 °C te worden gekweekt in een gistextract-mannitol medium.Verzamel de zoia-cellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in de stikstoffrije voedingsoplossing. Verdun de oplossing tot een OD 600 van 0,08.Voeg 10 milliliters ZOA-oplossing toe aan elke gecombineerde plantencultuur en laat de plant nog twee tot drie weken groeien om de vorming van wortelknolletjes mogelijk te maken. Verwijder het zand van de gecombineerde planten door ze uit te graven en te wassen. Gebruik de expressie van het groen fluorescerend eiwit om de transgene wortel te controleren.Hiervoor gebruikt u een fluorescentiemicroscoop. Al onze hairy root-constructen bevatten een constitutieve GFP-cassette voor het screenen van transgene lijnen. Deze afbeelding toont de GFP-transgene hairy root-composietplanten waargenomen in de fluorescentiemicroscoop.De transgene wortels met de helderdere groene fluorescentie zijn gemakkelijk te onderscheiden van de niet-transgene wortels. Er vormen zich wortelknolletjes in de haarwortel van de samengestelde planten. Hier volgt het volledige protocol.Nogmaals, het genereren van composite planten met haarwortels is een snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden transgeen weefsel te verkrijgen, vooral voor dipcotyle soorten. Hoewel deze methode geen transgene zaden kan opleveren, kan het binnen enkele weken transgeen materiaal produceren. Het is bijzonder geschikt voor planten bij welke het vestigen van weefselkweek en transformatie problematisch is.Door de jaren heen hebben we deze technologie gebruikt om genfuncties, promoterfuncties, microRNA's, de ontwikkeling van wortels en zijwortels, verdediging en antibiotische stressrespons, nodulatie en andere symbiotische processen te bestuderen. We hebben hormoonrespons, metabole profilering, genprofilering en proteomische analyse bestudeerd met behulp van samengestelde planten met een hoger wortelstelsel. We hopen dat deze video u zal helpen dit systeem aan te passen aan uw favoriete soort.Neem gerust contact met ons op voor vragen over deze technologie en veel succes.

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een cel dood-gebaseerde test voor het PTI in Nicotiana benthamiana planten is beschreven.

Test voor Pathogeen-geassocieerde Moleculaire Pattern (PAMP)-Triggered Immuniteit (PTI) in Planten

Twee verschillende manieren om het scherm planten met wortelknobbelaaltjes worden beschreven. De beschreven benaderingen omvatten high-throughput schermen met nematoden in een niet-destructieve manier vergemakkelijkt het gebruik van deze planten in fokprogramma's.

High and Low Throughput Schermen met wortelknobbelaaltjes Meloidogyne spp.</em

Groei van Medicago truncatula planten in symbiose met de stikstofbindende bacteriën Sinorhizobium meliloti in individuele, steriele microkosmossen gemaakt van standaard laboratorium platen maakt veelvuldig onderzoek van het wortelstelsel en knobbeltjes, zonder afbreuk te doen aan de steriliteit. Planten kunnen in deze groeikamers worden gehandhaafd tot 9 weken.

Single-plant, Steriel Microcosmi voor nodulatie en groei van de peulvrucht installatie<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Met de stikstofbindende Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Het doel is om te illustreren dat het model-legume Medicago truncatula gemakkelijk kan worden gebruikt om de regulatie van vroege plantenembryogenese te onderzoeken als aanvulling op het niet-legume Arabidopsis-model. De morfologie van peulen is gekoppeld aan stadia van zygotische embryogenese en er wordt ook een protocol gegeven om embryo's te verzamelen met behulp van weefselkweek.

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo&#39;s voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume<em&gt; Medicago truncatula</em

Promotor expressie analyses zijn cruciaal voor de verbetering van het begrip van genexpressie en de spatio uitdrukking van de doelgenen. Hierin presenteren wij een protocol om te identificeren, isoleren en klonen van een plant promotor. Verder, beschrijven we de karakterisatie van de knobbel-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels.

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

Dit protocol biedt experimentele stappen en informatie over reagentia, apparatuur en analysetools voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het hele genoom arraygebaseerd vergelijkende genomic hybridisatie (CGH) analyse van kopie nummer variaties in uit te voeren planten.

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.

Patroon-geactiveerde oxidatieve burst en zaailing groeiremming assays in Arabidopsis thaliana

Parasponia andersonii is een snelgroeiende tropische boom die behoort tot de cannabis familie (Cannabaceae) en kan stikstof fixerende wortel knobbeltjes vormen in samenwerking met de Rhizobium. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor omgekeerde genetische analyses in P. andersonii op basis van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde stabiele transformatie en op crispr/Cas9 gebaseerde genoom bewerking.

Transformeren, genoom bewerking en Fenotyping de stikstoffixatie tropische Cannabaceae boom Parasponia andersonii

Hier bieden we het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om samengestelde planten te produceren.

Een efficiënte en reproduceerbare methode voor het produceren van samengestelde planten door Agrobacterium rhizogenes-gebaseerde harige worteltransformatie

Leer hoe je haarwortelcomposietplanten genereert in Medicago truncatula voor nodulatieonderzoek. Deze Agrobacterium-methode levert snel transgene wortels zonder weefselkweek.

Genereren van Composite Planten in Medicago truncatula Gebruikt voor nodulatie Assays

Meer video's verkennen