Genereren van Composite Planten in Medicago truncatula Gebruikt voor nodulatie Assays

Hallo, mijn naam is Oliver Yu van het Dan Plant Science Center. Vandaag gaan we laten zien hoe u Ute Compote-planten genereert via Agrobacterium Ogn. Deze techniek is naar het Dan Center gebracht door Dr. Chris Taylor, momenteel verbonden aan de Ohio State University.

Verschillende van mijn voormalige groepsleden hebben deze technieken in de loop der jaren verbeterd en vandaag de dag hebben mijn huidige groepsleden, Dr. Stone en Mao, deze video samengesteld om te laten zien hoe Harry Root Composite Plants worden geproduceerd. Agrobacterium ZOS lijken sterk op Agrobacterium tumefaciens in dat ze vreemd DNA in planten introduceren, maar ZOS kunnen een hogere wortelvorming van wild-type weefsels induceren, waardoor composietplanten zoals deze ontstaan. Bij deze composietplanten zijn sommige van de wortels dus transgeen, terwijl de scheuten nog wild-type zijn.

Daarom zal deze technologie geen transgene zaden produceren. Er zijn echter drie belangrijke voordelen van planten met een hoge wortelcompetentie die deze technologie zeer nuttig maken. Ten eerste kunnen veel plantensoorten, met name dicotyle soorten, worden getransformeerd door Agrobacterium.

Ten tweede hoeven we geen weefselkweek op te zetten voorafgaand aan de transformatie. We kunnen diverse plantendelen gebruiken, zoals zaailingen, scheuten en wortels, om direct transgene planten te genereren. En tot slot kunnen we binnen enkele weken transgene wortelweefsels verkrijgen.

Voor transgene soja- en medicago-wortels kunnen we binnen drie weken transgene wortels verkrijgen, wat sneller is dan een OPIS-transformatie. Over het algemeen is de technologie voor wortelcelplanten een zeer nuttig instrument om genfuncties en wortelgerelateerde fenotypes te bestuderen. Hallo, mijn naam is Ong.

Hallo, mijn naam is, dit is mijn cameraman Bill. Vandaag introduceren we het Harry root Composite Plant-protocol. Ja, we gebruiken dit protocol in verschillende van onze projecten.

Ik heb al, we zijn begonnen, ja. Ja. Voor onze demonstratie gebruiken we meta cargo Tula als voorbeeld. Dit zijn meta cargo volwassen pods.

Plaats de peulen op een maalbak en maal de peulen vervolgens met een lange, stevige beweging. Scheid de zaden van de peulen door voorzichtig te schudden en plaats de zaden in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter geconcentreerd zwavelzuur toe.

Zeer voorzichtig scannen. Dit duurt ongeveer 10 minuten. Vortex de buis twee tot drie keer.

Tijdens de zuurbehandeling zal de zaadhuid veranderen naar een gele kleur. Verwijder het zwavelzuur uit de buis en spoel de zaden minstens vijf keer af met steriel water. Week de zaden zes uur lang in gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens twee dagen bij 4 °C.

Om de kieming te synchroniseren: verdeel 20 tot 30 zaden op vochtig filterpapier in de Petri-schaal. Na vijf tot zes dagen worden de kiemende zaden overgebracht naar de bodem en vervolgens vier weken lang opgekweekt in de kas.

Voor samengestelde planttransformatie gebruiken we gewoonlijk de agrobacteriumstam Zony K 5 99. De shuttlevector of binaire vector kan in de K 5 99 worden getransformeerd volgens het standaardprotocol voor agrobacterium tumor facit-transformatie. Inoculeer de agrobacterium en kweek deze gedurende 16 tot 24 uur bij 30 °C. Verzamel de cellen door de cultuuroplossing in een centrifugebuis van 50 mL te plaatsen.

Centrifugeer dit bij 5, 000 G gedurende 30 minuten. Resuspendeer de pellet met stikstofvrije voedingsoplossing. Zorg ervoor dat de agrobacteriumcellen worden verdund tot 0.3 bij OD 600.

Deze concentratie is belangrijk voor een maximale transformatie. We gebruiken rotswand als ondersteunende matrix. Het gebruik van dit materiaal is essentieel voor een hoge transformatiefrequentie.

Snijd de steenwol op de juiste maat. Plug. Maak aan de bovenkant een gat van ongeveer anderhalf tot twee centimeter in diameter. Voeg met behulp van een pipetpunt vijf milliliter Resuspended Agrobacterium Zony-oplossing toe aan elke plug.

Selecteer een stengelstuk met twee tot drie axillaire knoppen en maak een schuine snede. Steek de plantstukken in het gat in de rotswand. Plaats de gesneden planten gedurende drie weken in een groeikamer of op een laboratoriumtafel.

Voeg elke 10 dagen vijf milliliters voedingsoplossing toe aan elke plug. Na drie weken zijn de wortels geregenereerd vanaf de snijkant. Week de plant in water.

Verwijder de geweekte rotswand voorzichtig en beschadig de wortels niet. Zorg ervoor dat de volledige rotswand wordt verwijderd. De harige wortel-composietplanten kunnen worden overgeplaatst naar zand of perliet. Voor symbiosis-experimenten dient de rhizobium zeven dagen lang bij 30 °C te worden gekweekt in een gistextract-mannitol medium.

Verzamel de zoia-cellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in de stikstoffrije voedingsoplossing. Verdun de oplossing tot een OD 600 van 0,08.

Voeg 10 milliliters ZOA-oplossing toe aan elke gecombineerde plantencultuur en laat de plant nog twee tot drie weken groeien om de vorming van wortelknolletjes mogelijk te maken. Verwijder het zand van de gecombineerde planten door ze uit te graven en te wassen. Gebruik de expressie van het groen fluorescerend eiwit om de transgene wortel te controleren.

Hiervoor gebruikt u een fluorescentiemicroscoop. Al onze hairy root-constructen bevatten een constitutieve GFP-cassette voor het screenen van transgene lijnen. Deze afbeelding toont de GFP-transgene hairy root-composietplanten waargenomen in de fluorescentiemicroscoop.

De transgene wortels met de helderdere groene fluorescentie zijn gemakkelijk te onderscheiden van de niet-transgene wortels. Er vormen zich wortelknolletjes in de haarwortel van de samengestelde planten. Hier volgt het volledige protocol.

Nogmaals, het genereren van composite planten met haarwortels is een snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden transgeen weefsel te verkrijgen, vooral voor dipcotyle soorten. Hoewel deze methode geen transgene zaden kan opleveren, kan het binnen enkele weken transgeen materiaal produceren. Het is bijzonder geschikt voor planten bij welke het vestigen van weefselkweek en transformatie problematisch is.

Door de jaren heen hebben we deze technologie gebruikt om genfuncties, promoterfuncties, microRNA's, de ontwikkeling van wortels en zijwortels, verdediging en antibiotische stressrespons, nodulatie en andere symbiotische processen te bestuderen. We hebben hormoonrespons, metabole profilering, genprofilering en proteomische analyse bestudeerd met behulp van samengestelde planten met een hoger wortelstelsel. We hopen dat deze video u zal helpen dit systeem aan te passen aan uw favoriete soort.

Neem gerust contact met ons op voor vragen over deze technologie en veel succes.