Transcriptoom Analyse van de individuele cellen
25 april 2011
In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.
Het algemene doel van deze procedure is om monsters van enkele cellen voor te bereiden voor transcriptoomanalyse. Dit wordt bereikt door eerst een cel te vinden die geschikt is voor isolatie. De micropipet wordt vervolgens naast de te isoleren cel gepositioneerd.
Vervolgens wordt zuiging toegepast op de spuit totdat de cel in de punt van de micropipet wordt getrokken. De laatste stap van de procedure is om de punt van de micropipet in de opvangbuis te breken en de resterende inhoud van de micropipet in de buis te dejecteren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verschillen in mRNA-populaties tussen cellen laten zien door microarray-analyse van materiaal dat is versterkt met behulp van de arna-amplificatiemethode, ook beschreven in het protocol of voor andere toepassingen zoals PCR of next generation sequencing.
Hoewel deze methode inzicht kan geven en de verschillen tussen enkele cellen, kan het ook worden toegepast op subcellulaire compartimenten zoals dendrieten of klassen van dendrieten, en belangrijke informatie verstrekken over dendrietfunctie. Het demonstreren van de procedure zal Jennifer Singh zijn, een postdoc in mijn lab Voorafgaand aan het begin van dit protocol, werden primaire neuronen van embryonale dag 18, rat Hippo Campi geplaatst op 12 millimeter deksels in een 35 millimeter schaal en onderhouden zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Om pipetten voor oogst voor te bereiden, gebruik een micropipet puller om autoclaaf glazen pipetten te trekken tot een diameter die geschikt is voor elektrofysiologie.
Met behulp van het vooraf ingestelde programma van de fabrikant, is de boringsgrootte niet kritisch omdat de punt voorafgaand aan celverzameling zal worden gebroken. Bewaar de pipetten zorgvuldig in een stofvrije omgeving, zoals een micropipet opslagomgeving, waar de punten intact blijven wanneer klaar om cellen te oogsten. Bereid het gewenste aantal 1,7 milliliter einor buisjes voor door twee microliters PBS toe te voegen voor opslag van het geoogste materiaal.
Verwijder 1 35 millimeter schaal met deksels uit de incubator in een weefselkweekkap. Breng snel een deksel over van deze schaal naar het deksel van een nieuwe 35 millimeter schaal met HBSS. Het is van cruciaal belang om deksels die niet worden gemanipuleerd terug te brengen naar de incubator omdat de cellen ongezond worden.
Als ze voor langere tijd worden achtergelaten. Een omgekeerde lichtmicroscoop met een 40 x objectief voorzien van een micromanipulator is noodzakelijk voor celoogst. Gebruik een pipethold met flexibele buisleidingen die van de houder afgaan, bevestig de buisleidingen aan een stabiel oppervlak om ongewenste beweging van de pipet tijdens verzameling te voorkomen.
Aan het einde van de buisleidingen, steek een naald in zodat een spuit van één milliliter met een verbinding kan worden bevestigd en verwisseld tussen gebruikers. Bereid de micropipet voor door de punt op een gecontroleerde manier te breken door een Kim doek strak tussen de vingers van één hand te houden en de punt van de pipet één tot twee keer heel voorzichtig over het papier te borstelen. De opening moet ongeveer 75 tot 100%van de doelcelgrootte zijn.
Beveilig de micropipet in de micropipet houder en bevestig de micropipet houder aan de inzet op de micro manipulators. Stel tenslotte het 40 x objectief in. Plaats de schaal op de microscooptafel en zoek een regio van cellen die geschikt is voor oogst.
In het geval van primaire neuronale culturen, zou de cel relatief geïsoleerd moeten zijn van zijn buren. Om oogst van omringende cellen en/of processen te voorkomen, plaats de cel die moet worden geoogst in het midden van het gezichtsveld. Gebruik de micro manipulator om de micropipet richting de oplossing in de schaal in het lichtpad te brengen.
Laat de pipet punt in de oplossing zakken. Door het oculair te kijken, zou de pipet als een schaduw in het gezichtsveld moeten verschijnen. Pas vanaf dit punt positieve druk toe door lichtjes door de spuit boven het vlak van cellen te blazen.
Pas de positie van de pipet punt aan totdat deze zich binnen het gezichtsveld bevindt en focus op de pipet punt met behulp van de grove focus knoppen. Op dit punt, beoordeel of de boringsgrootte van de pipet te groot of te klein is. Als de boringsgrootte onjuist is, vervang met een andere micropipet totdat de juiste boringsgrootte is gevonden Om pipetbreuk in het verzamelingsgebied te voorkomen.
Gebruik de grove focus om het brandpunt vlak te verhogen voordat u de pipet punt richting de cellen beweegt met behulp van de microm manipulators. Terwijl de cellen dichterbij komen, gebruik de fijne focus totdat zowel de cellen als de pipet punt in focus zijn. Stop met het toepassen van positieve druk voordat de eiser cellen wordt bereikt om te voorkomen dat ze van de deksel worden geblazen.
Gebruik de micro manipulator om de pipet punt met de manipulators zo te positioneren dat deze de cel soma aanraakt die moet worden geoogst. Gebruik de spuit om lichte zuiging toe te passen door de mond totdat de cel de pipet punt binnenkomt. Als de cel de pipet niet binnenkomt, beweeg de punt voorzichtig dichter bij de cel en naar beneden totdat deze van de deksel wordt opgetild.
Gebruik de micro manipulator om de pipet onmiddellijk uit de oplossing te verplaatsen. Verwijder de pipet uit de houder. Houd de voorbereide 1,7 milliliter einor buis in één hand en breek voorzichtig de punt van de pipet aan de zijkant van de buis richting de bodem.
Met het oog op de 0,1 milliliter markering met de gebroken punt gecentreerd in de buis, steek een naald aangebracht op een spuit van één milliliter in de bovenste opening van de pipet. Druk snel op de plunjer, waardoor de oplossing in de pipet wordt verstoten in de buis. Zorg ervoor dat u de punt niet aanraakt met vloeistof aan de zijden van de buis.
Aangezien capillaire actie de vloeistof terug in de pipet zal brengen, zou de cel in de punt van de pipet moeten blijven, en dit zou voldoende moeten zijn om de cel goed te verdrijven. Draai snel de inhoud van de buis neer met behulp van een desktop micro fuge en bevries op droogijs of plaats op ijs voor verdere verwerking of voor andere toepassingen zoals PCR of next generation sequencing. Hier is een
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het verzamelen van enkele cellen uit primaire neuronale kweek van ratten voor transcriptoomanalyse met behulp van aRNA-amplificatie. De techniek is aanpasbaar aan verschillende celtypen, waardoor een gedetailleerde studie van genexpressie op single-celniveau mogelijk wordt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Transcriptomics
Achtergrond
- Single-celanalyse biedt inzicht in cellulaire heterogeniteit.
- Begrip van verschillen in genexpressie is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Primaire neuronale culturen zijn essentieel voor het bestuderen van neuronale functie.
- Verzameltechnieken zijn vitaal voor nauwkeurige transcriptoomanalyse.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van enkele neuronen.
- Om transcriptoomanalyse van individuele cellen mogelijk te maken.
- Om het begrip van genexpressievariaties in neuronen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van enkele cellen met behulp van micropipettechnieken.
- Toepassing van aRNA-amplificatie voor transcriptoomanalyse.
- Gebruik van omgekeerd lichtmicroscopie voor celvisualisatie.
- Micro manipulator voor nauwkeurige pipetpositionering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van enkele neuronen uit primaire culturen.
- Demonstratie van verschillen in mRNA-populaties tussen geïsoleerde cellen.
- Mogelijke toepassingen in PCR en next-generation sequencing.
- Inzichten in dendritische functie door middel van gerichte verzameling.
Conclusies
- De methode maakt gedetailleerde transcriptomische analyse op single-celniveau mogelijk.
- Het kan worden aangepast voor verschillende celtypen buiten neuronen.
- Deze benadering verbetert ons begrip van cellulaire diversiteit in neurale weefsels.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptome analysis enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and uncover gene expression differences that are masked in bulk tissue assays. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and prioritizing disease-relevant cell populations in early discovery. Integrating robust single-cell workflows strengthens predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression at the resolution of individual cells, clarifying pathway activity and target engagement.
- Supports biological de-risking by distinguishing molecular signatures between cell types and subcellular compartments.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing heterogeneity within disease-relevant tissues.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell samples for downstream transcriptomic assays.
- Enables reproducible isolation and amplification of RNA from individual cells, supporting quantitative assay development.
- Provides scalable input material for microarray, PCR, or next-generation sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neuronal subtypes or compartments, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling single-cell resolution analyses.
- Reduces risk of advancing non-representative targets by confirming expression in relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell isolation and aRNA amplification workflow bridges early discovery and preclinical research, providing high-resolution transcriptomic data for target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling gene expression analysis at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs suitable for downstream high-throughput assays.
- Analytics: Generates amplified RNA for microarray or sequencing, enabling robust comparison of gene expression across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neuronal subtypes or compartments.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for diverse cell types and experimental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and amplification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated cellular relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling and RNA-free technique to prevent contamination.
- Needs access to micro-manipulation instrumentation and analytical platforms for RNA quantification and analysis.
- Demands cross-team standardization of isolation and amplification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and subcellular compartments with protocol modifications.
- Sample integrity and RNA yield are sensitive to handling and timing, requiring careful workflow management.
