Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Het algemene doel van deze procedure is om monsters van enkelvoudige cellen voor te bereiden voor transcriptoomanalyse. Dit wordt bereikt door eerst een cel te vinden die geschikt is voor isolatie. De micropipet wordt vervolgens naast de te isoleren cel geplaatst.

Vervolgens wordt er zuiging uitgeoefend op de spuit totdat de cel in de punt van de micropipet wordt getrokken. De laatste stap van de procedure is het afbreken van de punt van de micropipet in de opvangbuis en het uitstoten van de resterende inhoud van de micropipet in de buis. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verschillen in mRNA-populaties tussen cellen aantonen via microarray-analyse van materiaal dat is geamplificeerd met de arna-amplificatiemethode, die ook in het protocol wordt beschreven, of voor andere toepassingen zoals PCR of next generation sequencing.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de verschillen tussen individuele cellen, kan deze ook worden toegepast op subcellulaire compartimenten, zoals dendrieten of klassen van dendrieten, en belangrijke informatie verschaft over de functie van dendrieten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jennifer Singh, een postdoc in mijn lab. Voorafgaand aan de start van dit protocol werden primaire neuronen van rattenhippo-campi op embryonale dag 18 geplaatst op dekglasjes van 12 millimeter in een schaal van 35 millimeter en onderhouden zoals beschreven in het geschreven protocol. Om pipetten voor de oogst voor te bereiden, gebruik een micropipetten-trekker om autoclaafglas-pipetten te trekken tot een diameter die geschikt is voor elektrofysiologie.

Bij gebruik van het vooraf ingestelde programma van de fabrikant is de boringmaat niet kritisch, aangezien de tip zal worden afgebroken vóór de celcollectie. Bewaar de pipetten zorgvuldig in een stofvrije omgeving, zoals een bewaarpot voor micropipetten, zodat de tips intact blijven wanneer ze klaar zijn voor het oogsten van de cellen. Bereid het gewenste aantal Eppendorf-buisjes van 1,7 milliliter voor door twee microliters PBS toe te voegen voor de opslag van het geoogste materiaal.

Verwijder één 35 millimeter schaal met dekglasjes uit de incubator in een steriele werkbank voor celkweek. Verplaats snel één dekglasje uit deze schaal naar het deksel van een nieuwe 35 millimeter schaal met HBSS. Het is van cruciaal belang om de dekglasjes die niet worden bewerkt direct terug in de incubator te plaatsen, omdat de cellen anders in slechte conditie raken.

Indien gedurende langere tijd buiten de incubator gelaten. Een omgekeerde lichtmicroscoop met een 40 x objectief, uitgerust met een micromanipulator, is noodzakelijk voor het oogsten van cellen. Gebruik een pipethouder met flexibele slang die van de houder afloopt; bevestig de slang aan een stabiel oppervlak om ongewenste beweging van de pipet tijdens de collectie te voorkomen.

Plaats aan het uiteinde van de slang een naald, zodat een spuit van 1 mL met een luer-lockverbinding kan worden bevestigd en tussen gebruikers kan worden gewisseld. Bereid de micropipet voor door de tip op een gecontroleerde manier af te breken; houd hiervoor een Kimwipe strak tussen de vingers van één hand en strijk de tip van de pipet zeer voorzichtig één tot twee keer over het papier. De opening moet ongeveer 75 tot 100% van de grootte van de doelcel bedragen.

Zet de micropipet vast in de micropipethouder en bevestig de micropipethouder aan de houder van de micromanipulatoren. Stel vervolgens het 40x objectief in. Plaats de schaal op de microscooptafel en zoek een gebied met cellen dat geschikt is voor oogst.

In het geval van primaire neuronale culturen moet de cel relatief geïsoleerd zijn van zijn buren. Om te voorkomen dat omliggende cellen en/of uitlopers worden geoogst, plaatst u de te oogsten cel in het centrum van het gezichtsveld. Gebruik de micromanipulator om de micropipet richting de oplossing in de schaal en in het lichtpad te bewegen.

Laat de pipetpunt in de oplossing zakken. Wanneer u door het oculair kijkt, moet de pipet als een schaduw in het gezichtsveld verschijnen. Oefen vanaf dit punt een positieve druk uit door voorzichtig door de spuit te blazen, ruim boven het vlak van de cellen.

Pas de positie van de pipetpunt aan totdat deze zich binnen het gezichtsveld bevindt en stel scherp op de pipetpunt met behulp van de grove focusknoppen. Beoordeel op dit punt of de boring van de pipet te groot of te klein is. Als de boring onjuist is, vervang deze dan door een andere micropipet totdat de juiste boring is gevonden om breuk van de pipet in het verzamelgebied te voorkomen.

Gebruik de grove focus om het brandvlak te verplaatsen voordat u de pipetpunt met behulp van de micromanipulatoren naar de cellen toe beweegt. Naarmate de cellen dichterbij komen, gebruikt u de fijne focus totdat zowel de cellen als de pipetpunt scherp zijn. Stop met het uitoefenen van positieve druk voordat de doelcellen zijn bereikt om te voorkomen dat ze van het dekglas worden geblazen.

Positioneer de pipetpunt met de micromanipulatoren zodanig dat deze het cellichaam dat geoogst moet worden, raakt. Gebruik de spuit om met de mond een lichte zuigkracht uit te oefenen totdat de cel in de pipetpunt komt. Als de cel niet in de pipet komt, beweeg de punt dan voorzichtig dichter bij de cel en naar beneden totdat deze van het dekglas tilt.

Gebruik de micromanipulator om de pipet onmiddellijk omhoog en uit de oplossing te bewegen. Verwijder de pipet uit de houder. Houd de voorbereide 1,7 ml Eppendorf-buis in één hand en breek voorzichtig de punt van de pipet af tegen de zijkant van de buis, richting de bodem.

Richt u op de markering van 0,1 milliliter met de gebroken punt gecentreerd in de buis en voer een naald die is verbonden met een spuit van één milliliter in via de bovenste opening van de pipet. Druk de zuiger snel in, waardoor de oplossing in de pipet in de buis wordt gespoten. Let erop dat de punt geen vloeistof aan de wanden van de buis raakt.

Omdat capillaire werking de vloeistof terug in de pipette zal trekken, moet de cel in de uiterste punt van de pipette achterblijven, wat voldoende zou moeten zijn om de cel correct uit te stoten. Centrifugeer de inhoud van de buis snel in een desktop-microcentrifuge en vries deze in op droogijs of plaats deze op ijs voor verdere verwerking of voor andere toepassingen zoals PCR of next generation sequencing. Hier wordt een voorbeeld getoond van een succesvolle oogst van een geïsoleerd neuron.

Om te beginnen werd een gebied met een relatief lage celstichtheid geselecteerd. De pipetpunt werd vervolgens naar de gewenste cel bewogen. Hier wordt het gezichtsveld getoond nadat de cel was geoogst.

Let op dat de omliggende processen op het dekglas blijven. Omgekeerd toont deze figuur twee afbeeldingen van pipetpunten die een ongepaste grootte hebben voor een effectieve oogst. Deze punt zal leiden tot een onvolledige oogst, terwijl de hier getoonde punt zal resulteren in het oogsten van het omliggende milieu.

Na de oogst en RNA-amplificatie wordt een analyse met een bioanalyzer aanbevolen om de distributie en hoeveelheid van het geamplificeerde RNA te onderzoeken. Een succesvolle amplificatie uit materiaal van een enkele cel levert totale hoeveelheden op in de lage microgrammen en vertoont een gladde en brede distributie. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele minuten worden voltooid mits correct uitgevoerd; bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een RNA-vrije techniek toe te passen.