Name: Transcriptoom Analyse van de individuele cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer transcriptoomanalyse van individuele neuronen uit primaire ratcultures met behulp van micropipet-isolatie en aRNA-versterking. Deze methode onthult genexpressievariabiliteit en ondersteunt PCR- en sequencing-toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dank aan Kevin Miyashiro voor plating en onderhouden van celculturen, Dr Terri Schochet voor het leveren van celculturen voor de foto&#39;s opgenomen in dit document. Daarnaast dank aan Kevin Miyashiro, dr. Peter Buckley, en Tiina Pertiz voor input op de ARNA procedure. De financiering voor dit werk was van het National Institute on Aging, het National Institute on Mental Health en de Human Resources Fact Finder fondsen van het Gemenebest van Pennsylvania.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
<li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li>
<li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li>
<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr Eberwine is een uitvinder op de ARNA patent dat is in licentie gegeven aan LBS technologieën waarin Dr Eberwine is een aandeel-houder.

Opmerkingen en problemen oplossen <ul><li> U kunt willen nemen voor en na foto&#39;s waaruit blijkt dat de doelcel werd geïsoleerd en dat de resterende penumbra bleef onaangeroerd. </li><li> Als er te veel oplossing is het invoeren van de pipet zoals je bent oogsten, kunt u 3-weg Luer-Lock fittingen en de zuiger van de spuit om positieve druk in de slang vast te houden. Het gewenste volume zal variëren met de aard van de verwerking, maar tot en met 5 pi moet fijn zijn voor de meeste toepassingen. </li></ul> Algemene tips over moleculaire biologische technieken <ul><li> Vortex alle voorraad slangen en spinnen ze naar beneden voor het toevoegen aan een reactie. NOOIT vortex enzymen. </li><li> Meng grondig reacties voor het toevoegen van het enzym om ervoor te zorgen dat de buffer is op de juiste concentratie. </li><li> Houden enzym voorraden bij -20 ° C indien mogelijk met behulp van een stratacooler. Anders, verwijder vlak voor gebruik, blijven op het ijs, en terug te keren onmiddellijk tot -20 ° C. </li><li> Altijd mastermengsels bij het voorbereiden van meer dan een reactie op de pipetteren fouten te verminderen. Bereken het volume nodig is op basis van het aantal monsters en voeg 10-20%. </li><li> Bewaar RNA bij -80 ° C te vertragen degradatie. RNA is het meest stabiel is opgeslagen in de buffer te vertragen apurination van RNA dat zich voordoet in zure omstandigheden. </li></ul> Algemeen overzicht van de ARNA Procedure Figuur 4A illustreert de eerste ronde van de ARNA procedure. In het eerste onderdeel reactie, de poly-T gedeelte van de T7-oligo (dT) primer selecteert voor mRNA soorten (lange witte rechthoek) door te binden aan de polyA staarten. Sommige microRNA&#39;s zijn ook gepolyadenyleerde en worden gevangen genomen door deze procedure. Nog belangrijker is echter de meest voorkomende RNA in de cel, ribosomaal RNA&#39;s, niet. Dit oligo fungeert als een primer voor reverse transcriptaseremmers naar een complementaire streng van de cDNA (lange grijze rechthoek) te synthetiseren met behulp van de mRNA als een sjabloon. De T7 gedeelte van de T7-oligo (dT) primer voorzien van de T7 RNA polymerase promotor in frame met de volgorde antisense mRNA naar het startpunt. Dit is later in de in vitro transcriptie reactie gebruikt. Vervolgens het mRNA in het mRNA / DNA hybride gemaakt in de vorige stap is gedeeltelijk gehydrolyseerd door RNase H het creëren van RNA &quot;primers&quot; (kleine witte rechthoeken), vergelijkbaar met de Okazaki fragmenten die in achterblijvende streng DNA-synthese. DNA-polymerase I maakt gebruik van de RNA-fragmenten aan premier DNA-synthese met behulp van de DNA complementair aan het mRNA als een sjabloon. Wanneer het de volgende RNA fragment, zijn vijf bereikt &#39;naar 3&#39; nuclease activiteit verwijdert de ribonucleotiden en vervangt ze door desoxyribonucleotiden. DNA-ligase wordt toegevoegd aan alle strengen waarbij de vervanging van de leidende streng is niet compleet afbinden. T4 DNA-polymerase wordt toegevoegd in te vullen in de gebieden waar de RNA-fragmenten dienden als eerste primers voor DNA-polymerase I het creëren van een stompe dubbelstrengs cDNA dat vervolgens wordt gezuiverd voordat u de IVT reactie. In de IVT reactie, T7 RNA-polymerase bindt aan de T7 promoter opgenomen in het dubbelstrengs cDNA en synthetiseert antisense-RNA-moleculen (lange zwarte rechthoeken) met behulp van de sense streng als een sjabloon. Dit dient als de amplificatiestap waarin duizenden antisense-RNA-moleculen worden geproduceerd uit elk dubbelstrengs cDNA-molecuul (figuur 4A). De tweede ronde, zoals afgebeeld in figuur 4B, begint met een reverse transcriptie reactie die is iets anders dan die van de eerste ronde sinds de start RNA is antisense (massief zwart rechthoek) en mist de gepolyadenyleerde staart, dat was het doelwit van de T7-oligo (dT) primer in de eerste ronde. Daarom wordt deze reactie gevuld met random primers (kleine grijze rechthoeken) en het RNA vervolgens gedenatureerd. De tweede streng reactie wordt dan gevuld door de T7-oligo (dT) primer, die voor de poly-A sequentie bindt aan het 3 &#39;einde van de sense RNA aangemaakt in de voorgaande reverse transcriptie reactie. Een andere IVT reactie wordt uitgevoerd op dezelfde wijze als in de eerste ronde. Deze tweede ronde is meestal minstens een keer herhaald om drie rondes van de versterking halen uit een enkele cel. Toepassingen De technieken die we hebben in dit artikel kan worden vertaald in een groot aantal toepassingen. De single celisolatie protocol kan worden aangepast voor gebruik in acute plakjes. 14 Hoewel technisch meer uitdagende, dezelfde principes toe te passen in deze alternatieve voorbereiding. Bovendien, als de grootte van de pipet is licht aangepast, kunnen opnamen van de fysiologie van de cellen worden gemaakt voor de oogst waardoor een goed gecontroleerde onderzoek van de moleculaire mechanismen achter de fysiologische uitgangen. Een andere kleine wijziging is om processen te isoleren uit de cel soma. 15 Voor deze toepassing, verzamel cellichamen met een pipet en gaan dan terug met een frisse pipet en het verzamelen van 100-300 geïdentificeerd Dendrites of axonen per collectie buis. 16 Zodra cellen zijn geoogst, vergelijkingen van mRNA dichtheden en composities kunnen worden gemaakt tussen verschillende en zelfs binnen dezelfde cel populaties. Het opnemen van gebiotinyleerde-UTP in de derde ronde ARNA zorgt voor microarray analyse om deze relatieve abundanties mRNA te bepalen. De samenstelling van de originele mRNA bevolking kan ook worden bepaald na de ARNA procedure met behulp van de volgende generatie sequencing. De versterkte ARNA kan ook worden gebruikt om de cel fenotype conversie studies waarin een volledige set van mRNA&#39;s van het ene celtype worden getransfecteerd in een ander celtype in om de overgang van het fenotype van de laatste celtype te induceren in die van de voormalige bevestigen, een procedure ontwikkeld door het lab en bekend staat als TIPeR. 17 Deze studies zijn vooral handig voor het bestuderen van de ziekte van staten en cel fenotypes en dergelijke studies zijn momenteel aan de gang in het lab. RT-PCR of qPCR kunnen worden uitgevoerd op het versterkte materiaal om de expressie van cel-specifieke genen te bevestigen. Daarnaast kan evaluaties van de efficiëntie van de transfectie of transductie worden gemaakt in de enkele cel niveau. Voordelen en beperkingen Zoals vermeld in het abstracte, isolatie van enkele cellen voor analyse elimineert de gemiddelde effecten gezien met een analyse van heterogene celpopulaties. Deze gemiddelde effecten verkeerd mRNA abundanties binnen een enkele cel door meer dan-die overvloedig transcripties en het gemiddelde uit en het voorkomen van detectie van een groot aantal low-overvloed transcripten. Flowcytometrie kan worden gebruikt om individuele cellen te sorteren, maar deze methode vereist kennis van cel-specifieke markers en dure apparatuur. 18 Laser capture microdissectie zowel met UV-of IR-laser capture microdissectie-systemen zorgen voor een cel en zelfs subcellulaire vast te leggen, maar vereist cellen van belang voor worden gevestigd op het oppervlak van zeer dunne secties. 19 Net als bij flowcytometrie, laser capture microdissectie vraagt ​​ook dure apparatuur. Een van de grote voordelen van de elektrode op basis collectie techniek hierboven beschreven is dat waardevolle elektrofysiologische gegevens kunnen worden verkregen uit de cel van belang voor de oogst, waardoor functionele en transcriptoom analyse worden uitgevoerd op dezelfde cel. 20 Een nadeel van onze techniek is dat het vereist ervaring met micromanipulators. Onderzoekers bekend zijn met micromanipulators vindt deze techniek zeer intuïtief, maar mensen met geen ervaring zal moeten vertrouwd raken met de vereiste fijne bewegingen. Inherent zijn aan elke amplificatietechniek is de preferentiële versterking van een aantal transcripties gebaseerd op grootte en nucleotide samenstelling. 4,6,7 Polymerase Chain Reaction (PCR) gebaseerde technieken, zoals reverse-transcriptie polymerase chain reaction (RT-PCR) en snelle amplificatie van cDNA einden (RACE) resulteren in exponentiële amplificatie van transcripten, terwijl de ARNA versterking procedure resulteert in een lineaire versterking. Zo is een van de belangrijkste voordelen van de ARNA procedure ligt in het vermogen om beter de relatieve abundanties van mRNA transcripten te behouden door alleen lineair versterken eventuele fouten of vooroordelen die optreden in het proces van versterking, in tegenstelling tot exponentieel versterken zei fouten en vooroordelen. Het Arna procedure in combinatie met microarray analyse maakt voor de vergelijking van de mRNA dichtheden tussen de enkele cellen van gelijksoortige of verschillende morfologie, behandeld of onbehandeld. Bovendien kan versterkt materiaal worden ingediend voor de volgende generatie sequencing. 5,8 echter zorg moeten worden genomen in dergelijke analyses omdat in tegenstelling tot het gebruik van willekeurige primers voor de procedure, de oligo-dT primer hierboven beschreven procedure vooroordelen versterking van de 3 &#39;einden van mRNA en leidt doorgaans tot een lichte verkorting van de latere versterkt materiaal met elke ronde. Voorzichtigheid is geboden bij de analyse van microarray resultaten met standaard methoden zoals sommige valse afwezig gesprekken kunnen het gevolg zijn van iets ingekort versterkt materiaal. Daarnaast, terwijl sequencing resultaten ook daadwerkelijk de volledige 5 geven &#39;volgorde van de meeste van de oorspronkelijke mRNA, de 5&#39; kan sequenties van sommige mRNA worden gemist. Om deze redenen moet het aantal ronden van de aanvullingen worden beperkt.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>dekglaasjes van spiegelglas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 35x10 mm kweekschaaltjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Water voor celkweek</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Voor het maken van oplossingen voor celkweek en het spoelen van dekglasjes</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminine, ultrapuur</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM met Earle&amp;rsquo;zouten en glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Voor het uitplaten van cellen</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine bèta-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM met Earle&amp;rsquo;zouten en L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Voor het kweken van cellen</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27 serumvrij supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas capillaire buisjes (1,5 mm b.o., 100 mm lengte)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Elke borosilicaatglaspipet is bruikbaar, mits de juiste boringdiameter wordt bereikt. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Elke oplossing zal werken, zolang de componenten niet&amp;rsquo;om eventuele toekomstige verwerking niet te belemmeren (d.w.z. geen Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; of Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>spuit van 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Naald</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>De gauge is afhankelijk van de diameter van de pipetten</td></tr><tr><td>dNTP-mix</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Op maat gemaakt</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>Buffer voor de tweede streng (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Geleverd met tweede-streng buffer</td></tr><tr><td>E. coli DNA-ligase</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA-polymerase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7-kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Willekeurige primers</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>De kit (18080-044) bevat first strand buffer (Y02321) en DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipetpuller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter heeft nog veel andere modellen, waarvan er vele in het kookboek worden besproken</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Veel andere micromanipulatoren zullen ook werken, zoals de nieuwere Eppendorf-modellen</td></tr><tr><td>Pipethouder</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Dit zal variëren afhankelijk van de micromanipulator en de buitendiameter van de pipet.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptoom analyse van de individuele cellen

Transcriptome Analysis of Single Cells

Veel gen-expressie analyse technieken baseren zich op materiaal geïsoleerd uit heterogene populaties van cellen van weefsels of cellen homogenaten in cultuur. 1,2,3 In het geval van de hersenen, regio&#39;s zoals de hippocampus een complex geheel van verschillende celtypen bevatten, elk met verschillende mRNA profielen. De mogelijkheid om enkele cellen oogst zorgt voor een meer diepgaand onderzoek naar de moleculaire verschillen tussen en binnen celpopulaties. We beschrijven een eenvoudige en snelle methode voor het oogsten van cellen voor verdere verwerking. Pipetten vaak gebruikt in elektrofysiologie worden gebruikt om te isoleren (met behulp van aspiratie) een cel van belang en gemakkelijk te storten in een eppendorfbuisje voor verdere verwerking met een aantal van de moleculair-biologische technieken. Ons protocol kan worden aangepast voor de oogst van de dendrieten van celkweek of zelfs individuele cellen van acute plakjes. We beschrijven ook de ARNA amplificatie methode als een belangrijke downstream toepassing van enkele cel isolaties. Deze methode werd eerder ontwikkeld door ons lab als een alternatief voor andere gen-expressie analyse technieken, zoals reverse-transcriptie of real-time polymerase chain reaction (PCR). 4,5,6,7,8 Deze techniek zorgt voor lineaire versterking van de gepolyadenyleerde RNA te beginnen met slechts femtograms van materiaal en dat resulteert in microgram hoeveelheden van antisense-RNA. De lineair versterkte materiaal zorgt voor een nauwkeuriger schatting dan PCR-exponentiële amplificatie van de relatieve overvloed van onderdelen van het transcriptoom van de geïsoleerde cel. De basis bestaat uit twee rondes van de amplificatie. In het kort, is een T7 RNA polymerase promoter website opgenomen in de dubbel-strengs cDNA gemaakt op basis van het mRNA transcripten. Een overnachting in vitro transcriptie (IVT) reactie wordt vervolgens uitgevoerd waarbij T7 RNA polymerase veel antisense transcripten produceert uit het dubbelstrengs cDNA. De tweede ronde herhaalt dit proces, maar met enkele technische verschillen, omdat het uitgangsmateriaal is antisense-RNA. Het is standaard om de tweede ronde te herhalen, wat resulteerde in drie rondes van versterking. Vaak wordt de derde ronde in vitro transcriptie reactie uitgevoerd met behulp van gebiotinyleerd nucleosidetrifosfaten, zodat het geproduceerde antisense-RNA kan worden gehybridiseerd en gedetecteerd op een microarray. 7,8

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige methode voor het verzamelen van enkele cellen van rat primaire neuronale culturen en de daaropvolgende transcriptoom analyse met behulp van ARNA versterking. Deze aanpak is generaliseerbaar naar een willekeurige cel type.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Veel technieken voor genexpressieanalyse zijn afhankelijk van materiaal dat is geïsoleerd uit heterogene celpopulaties uit weefselhomogenaten of cellen in ...

Het algemene doel van deze procedure is om monsters van enkelvoudige cellen voor te bereiden voor transcriptoomanalyse. Dit wordt bereikt door eerst een cel te vinden die geschikt is voor isolatie. De micropipet wordt vervolgens naast de te isoleren cel geplaatst.Vervolgens wordt er zuiging uitgeoefend op de spuit totdat de cel in de punt van de micropipet wordt getrokken. De laatste stap van de procedure is het afbreken van de punt van de micropipet in de opvangbuis en het uitstoten van de resterende inhoud van de micropipet in de buis. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die verschillen in mRNA-populaties tussen cellen aantonen via microarray-analyse van materiaal dat is geamplificeerd met de arna-amplificatiemethode, die ook in het protocol wordt beschreven, of voor andere toepassingen zoals PCR of next generation sequencing.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de verschillen tussen individuele cellen, kan deze ook worden toegepast op subcellulaire compartimenten, zoals dendrieten of klassen van dendrieten, en belangrijke informatie verschaft over de functie van dendrieten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Jennifer Singh, een postdoc in mijn lab. Voorafgaand aan de start van dit protocol werden primaire neuronen van rattenhippo-campi op embryonale dag 18 geplaatst op dekglasjes van 12 millimeter in een schaal van 35 millimeter en onderhouden zoals beschreven in het geschreven protocol. Om pipetten voor de oogst voor te bereiden, gebruik een micropipetten-trekker om autoclaafglas-pipetten te trekken tot een diameter die geschikt is voor elektrofysiologie.Bij gebruik van het vooraf ingestelde programma van de fabrikant is de boringmaat niet kritisch, aangezien de tip zal worden afgebroken vóór de celcollectie. Bewaar de pipetten zorgvuldig in een stofvrije omgeving, zoals een bewaarpot voor micropipetten, zodat de tips intact blijven wanneer ze klaar zijn voor het oogsten van de cellen. Bereid het gewenste aantal Eppendorf-buisjes van 1,7 milliliter voor door twee microliters PBS toe te voegen voor de opslag van het geoogste materiaal.Verwijder één 35 millimeter schaal met dekglasjes uit de incubator in een steriele werkbank voor celkweek. Verplaats snel één dekglasje uit deze schaal naar het deksel van een nieuwe 35 millimeter schaal met HBSS. Het is van cruciaal belang om de dekglasjes die niet worden bewerkt direct terug in de incubator te plaatsen, omdat de cellen anders in slechte conditie raken.Indien gedurende langere tijd buiten de incubator gelaten. Een omgekeerde lichtmicroscoop met een 40 x objectief, uitgerust met een micromanipulator, is noodzakelijk voor het oogsten van cellen. Gebruik een pipethouder met flexibele slang die van de houder afloopt; bevestig de slang aan een stabiel oppervlak om ongewenste beweging van de pipet tijdens de collectie te voorkomen.Plaats aan het uiteinde van de slang een naald, zodat een spuit van 1 mL met een luer-lockverbinding kan worden bevestigd en tussen gebruikers kan worden gewisseld. Bereid de micropipet voor door de tip op een gecontroleerde manier af te breken; houd hiervoor een Kimwipe strak tussen de vingers van één hand en strijk de tip van de pipet zeer voorzichtig één tot twee keer over het papier. De opening moet ongeveer 75 tot 100% van de grootte van de doelcel bedragen.Zet de micropipet vast in de micropipethouder en bevestig de micropipethouder aan de houder van de micromanipulatoren. Stel vervolgens het 40x objectief in. Plaats de schaal op de microscooptafel en zoek een gebied met cellen dat geschikt is voor oogst.In het geval van primaire neuronale culturen moet de cel relatief geïsoleerd zijn van zijn buren. Om te voorkomen dat omliggende cellen en/of uitlopers worden geoogst, plaatst u de te oogsten cel in het centrum van het gezichtsveld. Gebruik de micromanipulator om de micropipet richting de oplossing in de schaal en in het lichtpad te bewegen.Laat de pipetpunt in de oplossing zakken. Wanneer u door het oculair kijkt, moet de pipet als een schaduw in het gezichtsveld verschijnen. Oefen vanaf dit punt een positieve druk uit door voorzichtig door de spuit te blazen, ruim boven het vlak van de cellen.Pas de positie van de pipetpunt aan totdat deze zich binnen het gezichtsveld bevindt en stel scherp op de pipetpunt met behulp van de grove focusknoppen. Beoordeel op dit punt of de boring van de pipet te groot of te klein is. Als de boring onjuist is, vervang deze dan door een andere micropipet totdat de juiste boring is gevonden om breuk van de pipet in het verzamelgebied te voorkomen.Gebruik de grove focus om het brandvlak te verplaatsen voordat u de pipetpunt met behulp van de micromanipulatoren naar de cellen toe beweegt. Naarmate de cellen dichterbij komen, gebruikt u de fijne focus totdat zowel de cellen als de pipetpunt scherp zijn. Stop met het uitoefenen van positieve druk voordat de doelcellen zijn bereikt om te voorkomen dat ze van het dekglas worden geblazen.Positioneer de pipetpunt met de micromanipulatoren zodanig dat deze het cellichaam dat geoogst moet worden, raakt. Gebruik de spuit om met de mond een lichte zuigkracht uit te oefenen totdat de cel in de pipetpunt komt. Als de cel niet in de pipet komt, beweeg de punt dan voorzichtig dichter bij de cel en naar beneden totdat deze van het dekglas tilt.Gebruik de micromanipulator om de pipet onmiddellijk omhoog en uit de oplossing te bewegen. Verwijder de pipet uit de houder. Houd de voorbereide 1,7 ml Eppendorf-buis in één hand en breek voorzichtig de punt van de pipet af tegen de zijkant van de buis, richting de bodem.Richt u op de markering van 0,1 milliliter met de gebroken punt gecentreerd in de buis en voer een naald die is verbonden met een spuit van één milliliter in via de bovenste opening van de pipet. Druk de zuiger snel in, waardoor de oplossing in de pipet in de buis wordt gespoten. Let erop dat de punt geen vloeistof aan de wanden van de buis raakt.Omdat capillaire werking de vloeistof terug in de pipette zal trekken, moet de cel in de uiterste punt van de pipette achterblijven, wat voldoende zou moeten zijn om de cel correct uit te stoten. Centrifugeer de inhoud van de buis snel in een desktop-microcentrifuge en vries deze in op droogijs of plaats deze op ijs voor verdere verwerking of voor andere toepassingen zoals PCR of next generation sequencing. Hier wordt een voorbeeld getoond van een succesvolle oogst van een geïsoleerd neuron.Om te beginnen werd een gebied met een relatief lage celstichtheid geselecteerd. De pipetpunt werd vervolgens naar de gewenste cel bewogen. Hier wordt het gezichtsveld getoond nadat de cel was geoogst.Let op dat de omliggende processen op het dekglas blijven. Omgekeerd toont deze figuur twee afbeeldingen van pipetpunten die een ongepaste grootte hebben voor een effectieve oogst. Deze punt zal leiden tot een onvolledige oogst, terwijl de hier getoonde punt zal resulteren in het oogsten van het omliggende milieu.Na de oogst en RNA-amplificatie wordt een analyse met een bioanalyzer aanbevolen om de distributie en hoeveelheid van het geamplificeerde RNA te onderzoeken. Een succesvolle amplificatie uit materiaal van een enkele cel levert totale hoeveelheden op in de lage microgrammen en vertoont een gladde en brede distributie. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele minuten worden voltooid mits correct uitgevoerd; bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een RNA-vrije techniek toe te passen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

RNA polymerase II transcriptionele kinetiek worden gemeten op specifieke genen in levende cellen. mRNA getranscribeerd van het gen van belang zijn fluorescent gelabeld en het gebruik van Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) de in vivo kinetiek van transcriptionele rek worden verkregen.

Het meten van de kinetiek van mRNA transcriptie in Single levende cellen

Enkele cel expressie profilering maakt een gedetailleerde analyse van genexpressie van individuele cellen. Beschrijven we methoden voor de isolatie van cardiomyocyten, en het voorbereiden van de daaruit voortvloeiende lysaten voor zowel hele transcriptoom microarray of qPCR van specifieke doelen.

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Dit protocol legt uit hoe je enkele neuronen, microglia's en astrocyten verzamelt uit de centrale kern van de amygdala met hoge nauwkeurigheid en anatomische specificiteit met behulp van lasercapture microdissectie. Daarnaast leggen we ons gebruik van microfluïdeRT-qPCR uit om een subset van het transcriptome van deze cellen te meten.

Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

Deze publicatie beschrijft een protocol voor de isolatie van kernen van volwassen adipocyten, zuivering door fluorescentie-geactiveerde sortering en transcriptie op eencellig niveau.

Isolatie van vetweefselkern voor eencellige genomische toepassingen

Dit document presenteert methoden voor het kweken van cardiale myocyten met verschillende vormen, die verschillende pathologieën vertegenwoordigen, en het sorteren van deze aanhangende cardiale myocyten op basis van hun morfologie op een celniveau. Het voorgestelde platform biedt een nieuwe benadering van hoge doorvoer en drug screening voor verschillende soorten hartfalen.

Een benadering om vormafhankelijke transcriptie te bestuderen op een enkelcellig niveau

Het huidige protocol beschrijft een eencellige methode voor iteratieve epigenomische analyses met behulp van een herbruikbare enkele cel. De herbruikbare enkele cel maakt analyses van meerdere epigenetische markeringen in dezelfde enkele cel en statistische validatie van de resultaten mogelijk.

Herbruikbare eencellige cel voor iteratieve epigenomische analyses

Dit artikel presenteert een protocol voor het uitvoeren van uitgebreide ruimtelijke transcriptomische profilering van gastheer-, viraal-, schimmel- en microbioom-RNA uit formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties met behulp van Stereo-seq, waarmee verschillende transcriptomen met hoge resolutie in kaart kunnen worden gebracht met behoud van weefselarchitectuur.

Uitgebreide ruimtelijke profilering van soortagnostische transcriptomen via stereo-seq

Leer transcriptoomanalyse van individuele neuronen uit primaire ratcultures met behulp van micropipet-isolatie en aRNA-versterking. Deze methode onthult genexpressievariabiliteit en ondersteunt PCR- en sequencing-toepassingen.

Transcriptoom Analyse van de individuele cellen

Meer video's verkennen