Name: Isolatie van Drosophila melanogaster Testes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Leer een snelle methode om testes te isoleren van mannelijke Drosophila melanogaster met behulp van dissectienaalden en koude PBS. Deze techniek ondersteunt RNA- en eiwitanalyse voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Vasia Vagin voor de invoering van deze techniek in ons laboratorium.

<ol><li> Maak een glazen microscoopglaasje met een zwarte achtergrond: Cut 20 # wit papier van hetzelfde formaat als de microscoop dia. Kleur de ene kant van de slide-formaat papier zwart met behulp van een permanent marker (bijv. Sharpie). Van toepassing zijn witte lijm (Elmer's) naar de zwarte kant en houden het papier aan de dia. De glijbaan kan worden hergebruikt. Met behulp van ¾ "label tape (Fisherbrand), tot het veilig microscoopglaasje, glas kant, om de CO 2 vliegen pad om het te bevestigen op zijn plaats. </li><li> Verzamel 0-3 dagen oud mannetje vliegt. </li><li> Maak een emmer met ijs, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), ontleden naalden. </li><li> Verdoof 50-100 vliegt met behulp van een stroom van CO 2 en overbrengen van de fles of flacon om de vliegen pad in de buurt van het objectglaasje. </li><li> Pipetteer ~ 50 ul ijskoud PBS in een daling in het midden van de microscoop dia. </li><li> Voorzichtig pick-up een mannelijke vliegen met de ontleden naald-dip het ontleden naald in PBS, zachte aanraking van de ventrale zijde (dat wil zeggen, in de buurt van de vleugels) van het vliegen met de naald-plaats deze in de val van PBS. </li><li> Plaats een naald op het midden van de vlieg, tussen de borstkas en de buik, naar beneden te duwen stevig. Plaats de andere naald tussen de zesde (A6) en zevende (A7) buik segmenten (de tweede en derde strepen van onderen), trek de buik weg van de thorax. </li><li> Plagen van de testes, afgezien van andere organen, in het bijzonder de darm. Vooral in witte mutanten, testes en darmen lijken. De belangrijkste verschillen zijn dat testikels altijd in paren, elk testis heeft een spiraal patroon en is meer wit van kleur dan de darm. </li><li> Bewaar de testes in ijskoud PBS in een polypropyleen microcentrifugebuis. </li></ol> Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Dorsaal zicht van het mannelijke voortplantingssysteem, uit flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase attributie:... 'Na figuur 38 A op pagina 508 van Miller (1950) A. Miller De interne anatomie en histologie van het imago van Drosophila melanogaster In M. Demerec, redacteur, Biologie van Drosophila, hoofdstuk 6, pagina's 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, facsimile-uitgave, 1994. Copyright 1994 door Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gebruikt met vriendelijke toestemming van Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Druk op. Zie <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> . "

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Wij bieden een protocol om teelballen te isoleren van volwassen mannelijke Drosophila melanogaster. Omdat de techniek vereist een coördinerende de twee handen, vaardigheid komt alleen met de praktijk.

<table><tbody><tr><td>Dissectienaald</td><td>Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Objectglazen, blanco</td><td>Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopverlichting</td><td>Instrument</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; kussen</td><td>Instrument</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Flowbuddy Complete Systeem</td><td>Instrument</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Bellenbevochtiger</td><td>Instrument</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Ball filler naald</td><td>Instrument</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#190;&amp;#8221; Labeltape</td><td>Benodigdheid</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van drosophila melanogaster testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

De testes van Drosophila melanogaster bieden een belangrijk model voor de studie van stamcellen onderhoud en differentiatie, meiose, en soma-kiembaan interacties. Testes zijn meestal geïsoleerd uit volwassen mannetjes 0-3 dagen na Eclosion uit de popstadium geval. De testes van wild-type vliegen zijn gemakkelijk te onderscheiden van andere weefsels, omdat ze zijn geel, maar de testes van de witte mutant vliegen, een gemeenschappelijke genetische achtergrond voor laboratoriumexperimenten zijn vergelijkbaar in beide vorm en kleur aan het vliegen darm. Het uitvoeren van dissectie op een glazen microscoopglaasje met een zwarte achtergrond maakt het identificeren van de testes een stuk eenvoudiger. Testes worden verwijderd uit de vliegen met behulp van ontleden naalden. Vergeleken met de protocollen die forceps gebruiken voor testes dissectie, onze methode is veel sneller, waardoor een goed geoefend individu om testes ontleden 200-300 wild-type vliegt per uur, waardoor 400-600 testes. Testes van witte vlieg of mutanten die testes te verkleinen zijn moeilijker te ontleden en levert doorgaans 200-400 testes per uur.

Drosophila melanogaster testes kunnen snel en efficiënt geïsoleerd van volwassen mannen met behulp van het ontleden van naalden. Met de praktijk, kan men gemakkelijk isoleren in een of twee dagen een bedrag van testes voldoende is voor de analyse van DNA of RNA door hoge throughput sequencing of meer traditionele methoden of moleculaire biologie van eiwitten voor antilichaam-of enzym-gebaseerde testen.

Isolatie van Drosophila melanogaster Testes

De testikels van Drosophila melanogaster vormen een belangrijk model voor de studie van stamcelonderhoud en -differentiatie, meiose en de interactie tussen soma en kiemlijn ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van de testes van mannelijke Drosophila melanogaster van nul tot drie dagen oud. Dit wordt bereikt door mannelijke vliegen te anesthetiseren en hun testes te dissekeren in een druppel ijskoud PBS onder een microscoop met behulp van twee dissectienaalden; trek daarbij het abdomen van de vlieg weg van het thorax.Scheid tot slot de testikels van het overige weefsel en verzamel deze voor gebruik in diverse analytische technieken, zoals immunofluorescentie, kleuring of totale RNA- en proteïne-isolatie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het identificeren van de gedissecteerde testikels lastig te leren kan zijn omdat ze moeilijk te onderscheiden zijn van het darmkanaal. De procedure zal worden gedemonstreerd door shemei ma, een technicus uit mijn laboratorium.Bereid eerst een emmer met ijs, dissectienaalden en ongeveer 100 milliliters fosfaatgebufferde zoutoplossing voor. Plaats de PBS in de ijsemmer om deze te koelen. Maak een microscoopglaasje met een zwarte achtergrond door wit papier van 20 pond op maat te knippen zodat het op het glaasje past.Kleur vervolgens één zijde zwart. Gebruik een permanente marker, plak het papier op de plaats op het objectglas en bevestig het objectglas aan het CO2-kussen. Narcoseer onder een dissectiemicroscoop een flesje vliegen van nul tot drie dagen oud met een stroom CO2 en giet ze leeg op het kussen.Identificeer bij het bevestigde microscoopglas mannelijke vliegen aan hun kenmerkende donkergekleurde paringshaken en pipetteer ongeveer 50 µL ijskoud PBS op het midden van het microscoopglas, zodat er een druppel wordt gevormd. Pak een mannelijke vlieg op door een dissectienaald in de PBS-druppel te dopen en voorzichtig de ventrale zijde van de vlieg aan te raken, waardoor deze aan de naald blijft plakken.Plaats de vlieg in de druppel PBS en druk één naald stevig tussen het thorax en het abdomen van de vlieg. Druk de andere naald tussen het zesde en zevende abdominale segment en trek vervolgens het abdomen weg van het thorax. Scheid de testes van de overige organen, in het bijzonder de darm, die er vergelijkbaar uit kan zien, om de testes van de darm te kunnen onderscheiden.Houd er rekening mee dat testikels altijd in paren voorkomen, een karakteristieke spiraalvorm hebben en witter zijn dan darmweefsel. Verzamel de testikels in een microcentrifugebuisje met ijskoud PBS en bewaar deze op ijs, waar ze gedurende enkele uren kunnen worden bewaard. Eenmaal geoefend, kan één vlieg in minder dan één minuut worden gedissekeerd volgens deze procedure.Andere methoden, zoals deep sequencing van kleine silencing RNA's of microRNA's, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe het repertoire van RNA's verandert in een specifieke mutante vlieg?

isolation-of-drosophila-melanogaster-testes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video beschrijft de dissectie van de accessoire klieren van mannelijke vliegen en toont een voorbeeld waarin de geïsoleerde klier zal worden gescheiden in een eencellige suspensie.

Drosophila Mannelijke accessoire klier dissectie: een methode om secundaire cellen te isoleren

Deze video beschrijft de algemene anatomie van de Drosophila-eierstok en bevat een methode om eierstokken te ontleden voor levende of vaste beeldvorming.

Melanogaster van Drosophila Eierstokdissectie: een techniek voor ex vivo weefselpreparaat

Deze video beschrijft de Drosophila ringklier, een complexe endocriene structuur die belangrijk is voor biosynthese en afscheiding van ecdysteroïden en andere hormonen. Het aanbevolen protocol demonstreert de dissectie, fixatie en immunostaining.

Larvale ringklierdissectie: isolatie van ontwikkelingsedocriene organen van Drosophila

Stage-specifieke isolatie van midden tot late Drosophila follikels is bruikbaar voor verschillende doeleinden. Deze follikels ontwikkelen cultuur, die zorgt voor genetische en / of farmacologische manipulaties worden gecombineerd met in vitro assays en levende ontwikkeling beeldvorming. Bovendien kan follikels worden gebruikt voor moleculaire studies, zoals het isoleren van mRNA en eiwit.

Het nut van Stage-specifieke mid-to-late<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Dit protocol beschrijft de dissectie en cultivatie van intacte testikels en kiembaan-cysten uit Drosophila melanogaster poppen. Deze methode maakt microscopisch waarnemen van spermatogenese ex vivo mogelijk. Verder beschrijven we een farmacologisch assay van het effect van remmers op specifieke stadia van kiembaan-celontwikkeling in de testikels van de pop.

Ex vivo cultuur van Drosophila Pupal testis en Single Man Germ-lijn Cysten: Dissection, Imaging, en farmacologische behandeling

Hier presenteren we een protocol om een specifieke celpopulatie te ontkoppelen en te sorteren op de mannelijke accessoireklieren Drosophila (secundaire cellen) voor RNA-SEQUENCING en Rt-qPCR. Celisolatie wordt bereikt door middel van FACS zuivering van GFP-uitdrukken van secundaire cellen na een multistep dissociatie proces waarbij dissectie, proteasen spijsvertering en mechanische dispersie.

Een op FACS gebaseerd protocol om RNA te isoleren van de secundaire cellen van de mannelijke Accessoireklieren van Drosophila

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Het doel van dit protocol is om celdeling in intact weefsel te analyseren door levende en vaste celmicroscopie met drosophila meiotic spermatocyten. Het protocol laat zien hoe hele, intacte teelballen van Drosophila larven en vroege poppen te isoleren, en hoe ze te verwerken en te monteren voor microscopie.

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

We presenteren hier een verbeterd protocol voor de hele montering van drosophila-teelballen, geschikt voor confocale microscopie en ook reproduceerbaar en betrouwbaar labelen mogelijk. We illustreren dit protocol door 3D-representatie en kwantificering van colocalisatie-experimenten op de grote S4-S5 spermatocyten.

Immunostaining van Whole-Mount Drosophila Testes voor 3D Confocale Analyse van Grote Spermatocyten

Het protocol beschrijft de single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) -methode om ribosomale RNA-transcripten te onderscheiden die zijn afgeleid van de X- of Y-chromosoom ribosomale DNA-locus in Drosophila melanogaster.

Single Nucleotide Polymorfisme-gevoelige FISH-detectie van Locus-specifieke ribosomale RNA-transcriptie in Drosophila melanogaster

Leer een snelle methode om testes te isoleren van mannelijke Drosophila melanogaster met behulp van dissectienaalden en koude PBS. Deze techniek ondersteunt RNA- en eiwitanalyse voor genetisch onderzoek.

Isolatie van Drosophila melanogaster Testes

Meer video's verkennen