Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo's

Het hoofddoel van deze procedure is het isoleren van muisembryo's van E 8.5 voor gebruik in chromatine-immunoprecipitatie- of ChIP-assays. Dit wordt bereikt door eerst de muisembryo's te isoleren en enkelcel-suspensies voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het chemisch crosslinken van DNA-gebonden eiwitten aan het genomisch DNA, gevolgd door sonicatie om het DNA te fragmenteren.

De derde stap van de procedure is het immunoprecipiteren van proteïne-chromatinecomplexen en het isoleren van gezuiverd DNA. De laatste stap van de procedure is het analyseren van het gezuiverde, geimmunoprecipiteerde DNA via conventionele PCR of via kwantitatieve real-time PCR. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die proteïne-interacties met regulatoire sequenties van differentiatiespecifieke genen aantonen tijdens de initiatie van het differentieprogramma in ontwikkelende weefsels en organen.

Dit semester kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de initiatie van het differentiatieprogramma tijdens de embryogenese, door de identificatie van regulatoire factoren die interageren met de regulatoire sequenties van differentiatiespecifieke genen op het moment dat deze transcriptioneel competent worden. Om deze procedure te starten, worden de uterine hoorns verwijderd uit een muis die is geofferd op embryonale dag 8,5. Volgens een goedgekeurd protocol wordt het weefsel met een schaar in een Petrischaal geplaatst die vers sectiemedium bevat.

Snijd elke implantatieplaats individueel uit en plaats deze in een Petrischaal met vers dissectiemedium om overmatig bloedverlies te voorkomen. Verwijder met een pincet de baarmoederlaag van elke implantatieplaats om de embryo's bloot te leggen; isoleer de individuele embryo's met behulp van pincetten. In dit stadium van de ontwikkeling zijn de embryo's omringd door de pariëtale dooierzak, die contact maakt met het decidua-weefsel, de viscerale dooierzak en het amnion.

Het amnion is een transparant membraan dat in direct contact staat met het embryo. De viscerale dooierzak bevindt zich tussen het amnion en de pariëtale dooierzak en is bij embryo's van 8,5 tot 9,5 dagen gemakkelijk te onderscheiden aan de aanwezigheid van prominente bloedvaten die het embryo voeden. Verwijder elk embryo uit de omringende membranen en breng ze individueel over naar een nieuwe plaat met dissectiemedium om overtollig bloed te verwijderen.

Breng vervolgens elk embryo over naar een eppendorfbuisje van 1,5 milliliter met 200 microliters dissectiemedium. De homogenisatie van het geïsoleerde embryo begint met de toevoeging van 200 microliters collagenase type 2-oplossing aan elk buisje met embryo's.

Schud de monsters voorzichtig in een shaker bij 37 °C op 100 RPM gedurende 20 minuten. Resuspendeer de monsters vervolgens door middel van pipetteren om celklonters te verbreken. Breng de celsuspensie aan op een steriele celzeef met een maaswijdte van 40 µm, geplaatst over een 1,5 ml eppendorfbuis.

Breng onmiddellijk 600 µL kamertemperatuur 1X-DPBS aan op de bovenkant van de celzeef om de scheiding te voltooien. Zodra de suspensie is gezeefd, wordt de celzeef weggegooid en worden de monsters gecentrifugeerd bij 4.000 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Gooi na centrifugatie de supernatten weg.

Suspendeer elke pellet in één milliliter 1X DPBS op kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters vervolgens gedurende één minuut bij 4.000 G op kamertemperatuur. Na het voor de tweede keer verwijderen van het supernatant, wordt elke pellet opnieuw gesuspendeerd in 200 µL dissectiemedium op kamertemperatuur; crosslink het chromatine door 5,6 µL 37% formaldehyde toe te voegen aan de monsters van 200 µL voor een eindconcentratie van 1% formaldehyde.

Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters na incubatie 3 minuten bij 4.000 G en 4 °C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in koud 1X DPBS met 80 µL/mL protease-inhibitorcocktail (PIC). Centrifugeer de monsters vervolgens 3 minuten bij 4.000 G en 4 °C.

Nadat het supernatant is weggegooid, kunnen de monsters worden ingevroren bij -80 °C en zijn deze enkele maanden stabiel vóór sonicatie. Ontdooi het bevroren celpellet op ijs of plaats het pellet uit de vorige stap op ijs. Resuspendeer het celpellet in 100 µL SDS-lysisbuffer op kamertemperatuur. Voeg vervolgens nog eens 100 µL SDS-lysisbuffer op kamertemperatuur toe en resuspendeer het monster door middel van pipetteren en omkeren.

Incubeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op ijs. Stel na de incubatie de apparatuur in om het gecrosslinkte DNA af te scheren tot fragmenten van tussen de 200 en 500 basenparen. In deze demonstratie wordt een DIO geno bio rupture UCD 200 gebruikt.

Sonicate het monster omgeven door een ijsmengsel. Zorg ervoor dat het niet opwarmt boven 4 °C of bevriest. Centrifugeer het gesonicate monster bij 14.000 G gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Overbreng de supernatant naar een nieuwe, op ijs voorgekoelde DPH-buis. Verdeel het gesoneerde monster in maximaal vijf aliquoten. Bewaar één aliquot bij -20 °C om deze input te reserveren voor het ongedaan maken van de cross-linking.

Verdun de overige aliquots tienvoudig in chip-verdunningsbuffer met vers toegevoegde PIC in een verhouding van 1 µL per 800 µL buffer. Bepaal eerst welke aero-snelheden zullen worden gebruikt voor de pre-clearing op basis van het antilichaam dat voor het chip-assay-eiwit wordt gebruikt. Er wordt hier gebruikgemaakt van A-beads omdat het antilichaam voor de chip konijn-afgeleid is.

Voorzuiver het verdunde supernatant door 75 µL van een 50% oplossing van DNA en proteïne uit zalmsperma toe te voegen. Incubeer het mengsel gedurende één uur bij 4 °C onder rotatie. Centrifugeer na incubatie de monsters gedurende één minuut bij 2.500 ×g bij 4 °C. Draag het supernatant over naar een nieuwe, vooraf gekoelde Eppendorf-buis.

Voeg vier microgram antilichaam per monster toe aan de vooraf geklaarde Eloqua en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius onder rotatie. Begin met het toevoegen van 60 microliter van de zalm-sperm DNA-eiwit-agarosebeadsuspensie aan elk monster en incubeer een uur bij vier graden Celsius onder rotatie. Centrifugeer de monsters bij 1000 G gedurende één minuut bij vier graden Celsius.

Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatant en gooi deze weg, terwijl het DNA-proteïne-beadcomplex op ijs wordt bewaard. Resuspendeer en was de pellets zoals beschreven in het geschreven protocol met buffers één tot en met vier.

Elke wasbeurt bestaat uit een incubatieperiode van vijf minuten onder rotatie, gevolgd door centrifugatie bij 1000 G gedurende één minuut en het verwijderen van het supernatant na het wassen. Elueer het chromatin-antilichaamcomplex door het gewassen chromatin-proteïne-beadcomplex te resuspenderen in 250 µL vers bereide elutiebuffer. Vortex elk monster krachtig gedurende vijf seconden en incubeer de monsters vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur onder rotatie, gevolgd door centrifugatie bij 2.500 G gedurende één minuut. Breng elk eluaat bij kamertemperatuur over naar een nieuwe Eppendorf-buis.

Herhaal het elutieproces en combineer het eluaat voor elk monster in dezelfde Eppendorf-buis. Om de crosslinks te verbreken, voegt u 20 µL 5 M natriumchloride toe aan elk eluaat van 500 µL. Voeg aan de eerder gereserveerde inputcontrole 40 µL 5 M natriumchloride per milliliter toe.

Verwarm de EIT's gedurende vier uur in een waterbad van 65 °C. Laat 10 µL van elk monster in de inputcontrole overnacht lopen op een 2% agarosegel, naast een groottemarkering die varieert van 0,1 tot 1 kilobasepaar, om de grootte van de DNA-fragmenten te controleren. Het DNA zal verschijnen als een smear en niet als een scherpe band.

Herstel het DNA uit elk monster van 500 µL met behulp van een kaya quick gel extraction kit. Begin met het toevoegen van 600 µL qg buffer aan een kaya quick spin column om de DNA-absorptie aan het silicamembraan te optimaliseren en voeg vervolgens 200 µL isopropanol toe voordat de kolom wordt geladen. Controleer het mengsel om vast te stellen of er SDS-precipitaat aanwezig is.

Indien er SDS-precipitatie is opgetreden, moeten de monsters worden verwarmd in een waterbad van 42 °C totdat het precipitaat verdwijnt. Breng de monsters vervolgens aan op de kolommen en elueer het DNA volgens de instructies van de fabrikant. SDS kan de activiteit van PCRT-polymerase beïnvloeden en moet daarom volledig worden verwijderd voordat de PCR wordt uitgevoerd.

Incubeer elk DNA-monster op ijs om eventueel resterend SDS te laten neerslaan en centrifugeer gedurende één minuut bij 14, 000 G bij vier graden Celsius. Breng de SANE over naar nieuwe eppendorfbuisjes. De DNA EITs kunnen worden aangetoond via conventionele PCR of via kwantitatieve real-time PCR of QPCR met primers die specifiek zijn voor elke te analyseren sequentie. Gebruik voor één PCR- of QPCR-reactie vijf tot 10 µL van de totale DNA IIT; de PCR- en QPCR-condities zullen variëren.

Vanwege de beperkte hoeveelheid startmateriaal zijn echter extra PCR-cycli nodig voor conventionele PCR-detectie; begin met 40 cycli en pas dit indien nodig aan. Met dit protocol zijn chips uitgevoerd op embryo's van zowel E 8.5 als E 9.5. De met chips gezuiverde DNA's werden geanalyseerd via conventionele PCR en via kwantitatieve realtime PCR.

De resultaten tonen aan dat de myogene en regulatoire factor aanwezig is op de myogene en promotor in embryo's van E 8.5 en E 9.5. In contrast hiermee was er geen aanwijzing voor myogene en binding aan de myogene en promotor in de eikenzak waar myogene niet tot expressie komt. De interferon gamma promotor, die sequenties bevat die overeenkomen met de myogene bindingsplaats, werd gebruikt als negatieve sequentiecontrole; zoals verwacht was myogene niet gebonden aan de interferon gamma promotor in een van de geteste weefselmonsters.

De resultaten geven aan dat Myogenic gebonden is aan de Myogenic-promotor in de somieten van E 8.5 en E 9.5 embryo's, aangezien myo Genin specifiek in de somieten wordt tot expressie gebracht in deze stadia. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u E 8.5 muizembryo's isoleert en voorbereidt voor chromatine-precipitatie-assays waarmee regulatoire factoren kunnen worden geïdentificeerd die gebonden zijn aan weefselspecifieke genen in ontwikkelende weefsels.