Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo's
April 29th, 2011
Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.
Het algemene doel van deze procedure is om E 8.5 muis-embryo's te isoleren voor gebruik in chromatine, immunoprecipitatie of chip-assays. Dit wordt bereikt door eerst de muis-embryo's te isoleren en enkele cel suspensies te bereiden. De tweede stap van de procedure is het chemisch cross-linken van DNA-gebonden eiwitten aan het genomische DNA, gevolgd door sonicatie om het DNA te fragmenteren.
De derde stap van de procedure is om eiwit-chromatinecomplexen immunoprecipiteer te maken en gezuiverd DNA te isoleren. De laatste stap van de procedure is om het gezuiverde immunoprecipiteerd DNA te analyseren door conventionele PCR of door kwantitatieve real-time PCR. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die eiwitinteracties met regulatorische sequenties van differentiatie-specifieke genen tonen tijdens de initiatie van het differentiatieprogramma in ontwikkelende weefsels en organen.
Dit semester kan helpen om goede vragen te beantwoorden over de initiatie van het differentiatieprogramma tijdens embryogenese door de identificatie van regulerende factoren die interageren met de regulatorische sequenties van differentiatie-specifiek gen wanneer ze transcriptioneel competent worden. Om deze procedure te starten, worden de baarmoederhoorns verwijderd van een muis die wordt geofferd op embryonale dag 8.5. Volgens een goedgekeurd protocol wordt het weefsel in een petrischaal geplaatst met vers sectiemedia met behulp van schaar.
Snijd elke implantatieplaats afzonderlijk en plaats ze in een petrischaal met vers dissectiemedia om overtollig bloed te voorkomen. Verwijder met acht krachttang de baarmoederlaag van elke implantatieplaats om de de sidu te isoleren, gebruik krachttang om individuele embryo's te isoleren. In dit ontwikkelingsstadium worden de embryo's omringd door de pariëtale dooierzak, die contact maakt met het deum-weefsel, de viscerale dooierzak en het amnion.
Het amnion is een transparant membraan dat in direct contact staat met het embryo. De viscerale dooierzak bevindt zich tussen het amnion en de pariëtale dooierzak en is gemakkelijk te onderscheiden in de 8.5 tot 9.5 embryo's door de aanwezigheid van prominente bloedvaten die het embryo voeden. Verwijder elk embryo uit zijn omringende membranen en breng ze afzonderlijk over in een nieuwe plaat met dissectiemedia om overtollig bloed te verwijderen.
Breng vervolgens elk embryo over in een 1,5 milliliter einor-buisje met 200 microliters dissectiemedia. Homogenisatie van het geïsoleerde embryo begint met de toevoeging van 200 microliters collagenase. Type twee oplossing aan elke einor-buis met de embryo's.
Schud de monsters voorzichtig in een 37 graden Celsius shaker op 100 RPM gedurende 20 minuten. Resuspendeer vervolgens de monsters door te petten om klonters cellen te verstoren. Breng de celsuspensie aan op de bovenkant van een steriele celstrainer met een maaswijdte van 40 micron, geplaatst over een 1,5 milliliter eend rph-buis.
Breng onmiddellijk 600 microliters kamertemperatuurs X-D-P-B-S aan op de bovenkant van de celstrainer om de scheiding te voltooien. Zodra de suspensie is gezeefd, gooi de celstrainer weg en centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 4.000 G op vier graden Celsius. Na centrifugatie gooi de supernatanten weg en hergebruik.
Suspen deer elke pellet in een milliliter kamertemperatuurs X-D-P-B-S. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende één minuut bij 4.000 G op kamertemperatuur. Gooi na het tweede weggooien van de snat, elk palet opnieuw op in 200 microliters kamertemperatuurs dissectiemedia. Cross-link het chromatine door 5,6 microliters 37% formaldehyde toe te voegen aan de 200 microliter monsters voor een uiteindelijke concentratie van 1% formaldehyde.
Incubeer de monsters gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Na incubatie centrifugeer de monsters gedurende drie minuten bij 4.000 G op vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen met koude X-D-P-B-S bevattende 80 microliters per milliliter proteaseremmercocktail of PIC. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende drie minuten bij 4.000 G op vier graden Celsius.
Na het weggooien van het supernatant kunnen de monsters worden bevroren bij minuus 80 graden Celsius en zijn ze enkele maanden stabiel vóór sonicatie. Ontdooi het bevroren cellenpellet op ijs of plaats het pellet van de vorige stap op ijs. Re suspendeer het celpalette in 100 microliters kamertemperatuurs SDS-lysebuffer na resuspensie. Een extra 100 microliters kamertemperatuurs SDS-lysebuffer wordt toegevoegd en het monster wordt opnieuw gesuspendeerd door middel van pipetteren en inversie.
Incubeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op ijs. Na incubatie stelt u de ator in om het cross-link DNA te scheren tot tussen de 200 en 500 basenparen. In deze demonstratie wordt een DIO geno bio rupture UCD 200 gebruikt.
Soniceer het monster dat is omgeven door een ijsslurry. Laat het niet opwarmen boven de vier graden Celsius of bevriezen centrifugeer. Soniceer het monster gedurende 10 minuten bij 14.000 G op vier graden Celsius.
Breng het supernatant over in een nieuwe eend DPH-buis, vooraf gekoeld op ijs. Verdeel het gesoniceerde monster in maximaal vijf aliquoten. Bewaar een aliquot bij minuus 20 graden Celsius om de invoer voor de cross-link-omkering te reserveren.
Verdun de andere aliquoten tienvoudig in chipverdunningsbuffer die vers toegevoegde PIC bevat bij een microliter per 800 microliters buffer. Bepaal eerst welke aero-snelheden zullen worden gebruikt voor voorzuivering op basis van het antilichaam dat zal worden gebruikt voor de chip-assay-eiwit. A-beads worden hier gebruikt omdat het antilichaam dat voor de chip wordt gebruikt, rabid is.
Voorzuiver de verdunde superin door 75 microliters van een 50% van zalmsperma, DNA en proteïne toe te voegen. A-beads worden geïncubeerd bij vier graden Celsius met rotatie gedurende één uur na incubatie. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende één minuut bij 2.500 G op vier graden Celsius. Breng de supine over in een nieuwe voorgekoelde eend DPH-buis.
Voeg vier microgram antilichaam per monster toe aan de voorgezu
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) methode om factorinteracties bij weefselspecifieke genen in muis embryonaal weefsel te bestuderen. Het protocol is ontworpen om genactivering tijdens normale embryonale ontwikkeling te analyseren.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) is een techniek die wordt gebruikt om eiwit-DNA-interacties te bestuderen.
- Weefselspecifieke genexpressie is cruciaal voor een goede embryonale ontwikkeling.
- Het begrijpen van deze interacties kan inzichten geven in differentiatieprocessen.
- Deze studie richt zich op muis embryonaal weefsel in een specifiek ontwikkelingsstadium (E 8.5).
Doel van de studie
- Om E 8.5 muis embryo's te isoleren voor ChIP-assays.
- Om eiwitinteracties met regulatorische sequenties van differentiatie-specifieke genen te identificeren.
- Om genactivering te analyseren tijdens het begin van differentiatie in zich ontwikkelende weefsels.
Gebruikte methoden
- Isolatie van E 8.5 muis embryo's en voorbereiding van enkele celsuspensies.
- Chemische cross-linking van DNA-gebonden eiwitten aan genomisch DNA.
- Sonicatie om het DNA te fragmenteren.
- Immunoprecipitatie van eiwit-chromatine complexen en isolatie van gezuiverd DNA.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van DNA-eiwit complexen uit embryonaal weefsel.
- Identificatie van eiwitinteracties met regulatorische sequenties.
- Resultaten kunnen worden geanalyseerd met conventionele PCR of kwantitatieve real-time PCR.
- Inzichten in het differentiatieprogramma in zich ontwikkelende weefsels en organen.
Conclusies
- De ChIP methode is effectief voor het bestuderen van weefselspecifieke genactivering.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van embryonale ontwikkeling en differentiatie.
- Dit protocol kan worden toegepast op verschillende studies in de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) in early-stage mouse embryos enables direct interrogation of protein-DNA interactions underlying tissue-specific gene activation during embryogenesis. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for developmental gene regulation. The approach is strategically positioned for discovery-stage programs focused on differentiation pathways and tissue lineage specification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables identification of regulatory factor binding at differentiation-specific gene promoters in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying when and where transcription factors engage target loci.
- Provides functional evidence for tissue-specific gene activation during lineage commitment.
- Facilitates triage of candidate targets based on direct chromatin engagement in relevant cell populations.
Screening & Assay Development
- Generates validated chromatin samples for downstream quantitative PCR analysis of factor occupancy.
- Establishes reproducible workflows for limited primary tissue, supporting assay standardization.
- Enables quantitative comparison of protein-DNA interactions across developmental stages or conditions.
- Prepares the foundation for screening regulatory factor perturbations in embryonic contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin state analysis with disease-relevant developmental windows.
- Supports continuity from discovery of regulatory mechanisms to preclinical models of tissue specification.
- Provides a platform for evaluating the impact of genetic or pharmacological interventions on gene activation.
- Enables risk-adjusted advancement of targets with validated developmental engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This ChIP protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct measurement of regulatory factor binding during early tissue specification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for transcription factor involvement in gene activation during embryogenesis.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts of chromatin engagement for assay development.
- Analytics: Provides PCR-based quantification of factor occupancy at specific promoters.
- Translational Research: Bridges mechanistic discovery with preclinical validation in disease-relevant developmental stages.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable protocol adaptable to diverse tissue-specific gene regulation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming in vivo chromatin interactions.
- Operational Value: Standardizes workflows for low-input embryonic tissue, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of regulatory engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional chromatin data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and chromatin handling.
- Demands access to sonication, immunoprecipitation, and quantitative PCR instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility with limited tissue input.
- Adaptable to various developmental stages and tissue types with protocol optimization.
- Limited by cell-type heterogeneity, as interactions are detected at the tissue rather than single-cell level.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:20
Isolation of Embryos
2:35
Homogenization of the Isolated Embryo and Chromatin Crosslinking
4:21
Sonication
5:38
Pre-clearing and Immunoprecipitation
6:25
Washing and Elution of the Chromatin
7:34
Reverse Cross-link and Recover DNA
8:47
Analysis of Recovered DNA
9:39
ChIP Assay Results for E8.5 and E9.5 Embryos
10:35
Conclusion
