Silicon Microchips voor het manipuleren van Cel-cel interactie

Hallo, ik ben Elliot Hu.Ik ben een postdoctoraal onderzoeker in het lab van Tia hier aan het Massachusetts Institute of Technology. Vandaag gaan we celculturen voorbereiden op siliconen micro mechanische chips. De apparaten zien eruit als kleine kammen die in elkaar passen en ze stellen ons in staat om de interacties tussen twee verschillende populaties cellen precies te manipuleren.

Vandaag gaan we de interactie bestuderen tussen leverhepatocyten en ondersteunende stromale cellen. Specifiek worden drie T drie fibroblastcellen gekweekt op het bovenoppervlak van de kammen, zodat door het verschuiven van de kamvingers je de cellen kunt verplaatsen en hun ruimtelijke rangschikking kunt wijzigen. Elk apparaat is verdeeld in twee delen die in twee mogelijke configuraties in elkaar passen.

De eerste brengt de twee celpopulaties met elkaar in contact. De tweede scheidt de twee populaties lichtjes, zodat de cellen elkaar niet kunnen aanraken. Hier worden contactinteracties voorkomen, maar interacties via uitgescheiden factoren worden behouden.

Laten we beginnen met praten over hoe we de onderdelen met pincetten moeten hanteren. Ik gebruik graag zowel grotere Teflon pincetten als kleinere ronde metalen pincetten. Met de grotere pincetten kun je de onderdelen aan de randen oppikken, zoals hier met de grotere onderdelen met de armen, je moet voorzichtig zijn om de armen niet te breken omdat ze erg kwetsbaar zijn.

Dus je wilt ze aan de achterkant van het onderdeel oppikken zoals hier. Met de metalen pincetten kun je in het gat reiken en de chips direct oppikken. De grotere onderdelen passen in een wand van een 12-well plate, terwijl de kleinere onderdelen passen in een 24-well plate of kunnen worden gekoppeld aan het grotere onderdeel.

In een 12-well plate gebruik ik meestal de metalen pincet. Wanneer ik de onderdelen in de platen hanteer om twee onderdelen aan elkaar te klikken, leg ik meestal eerst het grotere onderdeel in het putje en duw ik het helemaal naar een kant. Dan neem ik het complementaire reparatie en plaats het aan de andere kant van het putje, en ik duw ze samen door twee pincetten te nemen, één in elk gat.

Dus nu kan ik de onderdelen gewoon vergrendelen, ofwel in de kloofconfiguratie ofwel in de contactconfiguratie. Als ik de onderdelen uit elkaar wil halen, trek ik de onderdelen graag naar de kloofconfiguratie en trek verticaal om het onderdeel te verwijderen. Nu zijn de apparaten gemaakt van siliconen, dus ze moeten worden gecoat om een goede celadhesie mogelijk te maken.

Je zult waarschijnlijk de apparaten al gecoat met polystyreen en plasmabehandeld ontvangen, dus we gaan ervan uit dat dat ons startpunt is. Allereerst gaan we collageen gebruiken om het oppervlak te coaten waar de hepatocyten zich zullen hechten. We gaan de hepatocytenkammen in een 50 microgram per mill collageen, één oplossing, en incuberen bij 37 C gedurende 45 minuten.

De fibroblastkammen daarentegen hoeven we niet te coaten. Na incubatie zuigen we de collageenoplossing af en wassen en water. Nu gaan we de ES vergrendelen in contact met complementaire onderdelen, zodat we een vlak oppervlak vormen voor celzaaien.

Eerst vullen we wat putjes met 70% ethanol. Ik zal een paar in elk putje doen en ze vervolgens vergrendelen. Na het vergrendelen willen we de onderdelen onder de microscoop bekijken om er zeker van te zijn dat ze coplanair zijn.

Af en toe kunnen de onderdelen verkeerd met elkaar vergrendelen. En onder de microscoop zul je zien dat ze op twee verschillende brandpunten zijn. In dit geval scheid je eenvoudig de onderdelen en duwt ze weer bij elkaar. Nadat je hebt gecontroleerd of de uitlijning goed is, laten we de onderdelen een tijdje in ethanol liggen om te steriliseren.

Vaak heb ik haast, dus ik weken gedurende 10 minuten. Na sterilisatie moeten we grondig wegwaspen. Het ethanol grondig afzuigende en in water wassen, vervolgens afzuigende en opnieuw in water wassen, en tenslotte het water afzuigende en vervangende door je kweekmedium.

Laten we nu cellen op de apparaten zaaien. Meestal suspenderen we de cellen in een concentratie van 500.000 cellen per milliliter, en we pipetteren één milliliter suspensie over elk kampaartje met behulp van een 12-well plate. Dus we zaaiden de fibroblasten met 500.000 cellen per milliliter in twee van de putjes.

Op dezelfde manier namen we een suspensie van 500.000 hepatocyten per putje en zaaiden ze in de andere twee putjes. Nu, voordat we incuberen, gaan we de cellen grondig schudden om er zeker van te zijn dat ze gelijkmatig verdeeld zijn. En ik schud graag drie keer verticaal, drie keer horizontaal en herhaal dit dan drie keer.

Na het schudden gaan we het in de incubator plaatsen en laten we de cellen 15 minuten zitten, waarna we ze weer gaan schudden. Na het schudden elke 15 minuten gedurende één uur, gaan we de celsuspensie afzuigen en een nieuwe suspensie van cellen aanbrengen. En we gaan dit herhalen totdat we een confluente laag cellen hebben.

Typisch duurt het bij fibroblasten een of twee keer zaaien. En bij hepatocyten kan het twee tot vier keer zaaien duren. Om een confluent monolaag te krijgen, worden de cellen met een vrij hoge dichtheid gezaaid, schudden zorgt ervoor dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn.

Na het eerste zaaien is er een dunne laag cellen gevormd. Merk op dat cellen alleen hechten aan de vingers die zijn gecoat met polystyreen en collageen. Na het zaaien van verse cellen en incubatie gedurende nog een uur, opnieuw met schudden elke 15 minuten, wordt de cel laag dichter.

Na het derde zaaien hebben we een goede celdichtheid, en nu kunnen we stoppen nadat de cellen op de kammen zijn gezaaid. We willen de cellen manipuleren in de gewenste experimentele configuratie. Apparaten worden nu gescheiden van hun complementaire onderdelen en geïncubeerd gedurende 24 uur.

Na 24 uur zijn de cellen uitgezaaid om een confluent monolaag over het