Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van menselijke neurale stamcellen uit weggegooid frontaal corticaal weefsel. Dit wordt bereikt door eerst de oplossingen en materialen voor te bereiden voordat menselijke foetale hersenen worden gedisseceerd. Dit wordt gevolgd door het onderhoud van de geïsoleerde neurale stamcellen, inclusief verdere expansie, karakterisering en experimentatie.

Langetermijnopslag is mogelijk, evenals het opzetten van subculturen voor de differentiatie van progenitoren tot neuronale en gliale celtypen. Uiteindelijk kan de differentiatie van cellen uit een normaal centraal zenuwstelsel (CZS) worden gekarakteriseerd en vergeleken met die van cellen afgeleid van een CZS met bekende neurologische aandoeningen. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie of diagnose van elke menselijke aandoening van het CZS.

De techniek biedt een eenvoudig en betrouwbaar platform om pathologische S te evalueren en de farmacologische werkzaamheid van nieuwe geneesmiddelen voor een specifieke aandoening te beoordelen. Vanwege de uitzonderlijke waarde van multipotente cellen moeten alle materialen gereed zijn voordat het protocol wordt gestart. Om het risico op beschadiging van de monsters te minimaliseren, dienen de gekoelde dissectiebenodigdheden, het op 37 °C voorverwarmde kweekmedium en het gekoelde cryobewaarmedium voor langetermijnopslag vooraf te zijn klaargezet.

Voor de cryoconservering bij de dissectie moeten steriele, geautoclaveerde pincetten en scalpellamellen met houders gereedstaan voor de celdissociatie. Zorg dat een pipetpistool, transferpipetten van 10 milliliter en een celzeef van 40 micrometer aanwezig zijn. Zet daarnaast enkele kweekschalen van 10 centimeter klaar voor de dissectie.

Centrifugebuizen van 50 milliliter voor dissociatie. Centrifugebuizen van 1,5 milliliter voor weefselopslag en cryovials voor het invriezen van cellen. Om succes te garanderen, moet levensvatbaar weefsel van 18 tot 22 weken oud binnen twee uur na beschikbaarheid worden geoogst.

Idealiter kan foetaal weefsel binnen enkele minuten na beschikbaarheid worden verkregen door afspraken te maken voor verzameling na electieve procedures. De weefsels zijn vaak gefragmenteerd, maar een aanzienlijk deel van de hersenen blijft intact. Verzamel de hersenen in een Petrischaal van 10 milliliter gevuld met ijskoud dissectiemedium.

Identificeer verschillende delen van de cortex aan de hand van anatomische oriëntatiepunten. De grenzen voor de frontale en pariëtale occipitale cortices worden bepaald door de geëxtrapoleerde intersectie van de sulcus centralis en de fissura sylvii. Dissecteer weefsel uit de frontale cortex anterieur van de sulcus centralis en langs de rand van de fissura sylvii met chirurgische scalpels.

Zorg ervoor dat de ventrikel intact en onbeschadigd blijft. Verwijder nu alle resterende bloed en meninges uit het gescheiden blok frontale cortex. Als het monster niet te gefragmenteerd is en voldoende groot is, ontleed het blok dan in verschillende kleinere monsters om er enkele te bewaren voor histologie en proteïne- of mRNA-assays.

Breng nu een hersenblok over naar een centrifugebuis van 50 milliliter en voeg drie keer het volume van het weefsel aan ijskoud dissectiemedium toe. Dissocieer het weefsel voorzichtig met een pipet totdat alle weefsels gefragmenteerd zijn. Om de cellen volledig te suspenderen, worden ze gefilterd door een 40 micromolar cell strainer.

Centrifugeer nu de celsuspensie en resuspendeer de celpellet in 10 milliliters vers, warm kweekmedium. Tel met een hemocytometer het aantal cellen en bereken het volume voor 2 miljoen cellen. Draag nu elk volume van 2 miljoen cellen over naar een vierkante kweekfles van 25 centimeter.

Bereid met vijf milliliter warm kweekmedium. Houd de cellen gedurende één week op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Vervang bij langere kweken eenmaal per week de helft van het medium. Na één tot twee weken in kweek vormen zich gewoonlijk neurosferen met een NSC-diameter tussen 200 en 400 micron.

Om de neurosferen te dissociëren tot enkelvoudige cellen. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten met EDTA in Hank's medium. Om de gesuspendeerde cellen voor subcultuur voor te bereiden, worden deze gecentrifugeerd, gewassen met Hank's en opnieuw aangebracht in warm kweekmedium.

Om de differentiatie te starten, plaatst u de gedissocieerde cellen op met poly-D-lysine en laminine-1 gecoate dekglasjes met een dichtheid van 100 000 cellen per dekglasje en incubeert u deze gedurende 30 minuten. De cellen kunnen eenvoudig worden gedifferentieerd tot oligodendrocyten, neuronen of astrocyten.

Voor neuronale differentiatie worden de cellen zeven dagen onderhouden in medium met B 27. Voor astrocyten-differentiatie worden de cellen zeven dagen gekweekt in medium met FBS. Voor oligodendrocyt-differentiatie worden de cellen twee dagen onderhouden in gemodificeerd medium met groeifactoren en daarna nog vijf dagen in hetzelfde gemodificeerde medium zonder de groeifactoren om de stamcellen te bewaren.

Nadat de gedissocieerde cel-suspensies zijn gecentrifugeerd, resuspendeer de cellen in vriesmedium met een concentratie van 10 miljoen cellen per vial. Per milliliter, vries de cellen langzaam in bij -20 °C voordat ze bij -80 °C worden ingevroren voor langetermijnopslag. Verplaats ze vervolgens naar vloeibare stikstof.

Vervolgens worden de cellen snel ontdooid in een waterbad van 37 °C en geresuspendeerd. Voor een wasstap gebeurt dit in voorverwarmd D-M-E-M-F 12 plus 10% serum. De voorverwarmde cellen worden daarna gecentrifugeerd, geaspireerd en geresuspendeerd in het voorverwarmde medium.

Medium neurale stamcellen van een normale foetus. Op 18 weken gestationele leeftijd werden deze gekweekt om neurosferen te vormen, die vervolgens werden getransfecteerd met GFP. De neurosferen werden gedifferentieerd om verschillende celtypen te creëren, die daarna werden gefixeerd en gekleurd met celmarkers en rumine.

Multipotiëntie wordt waargenomen door de expressie van markers die indicatief zijn voor neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u menselijke neurale stamcellen kunt isoleren, expanderen en manipuleren uit weggegooid frontaal corticaal weefsel. Deze regio's bieden een unieke mogelijkheid om mechanismen van ziekten in de menselijke corticale omgeving te bestuderen en de potentiële effectiviteit van farmacotherapeutische middelen te testen.