ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza
9 juni 2011
ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een nieuwe en snelle signaalversterkingsmethode te gebruiken om influenza virale subtypes op de griepchip, een low density microarray platform, te detecteren en te karakteriseren. Dit wordt bereikt door biotinyleren DTP's te gebruiken en primers met een vijf prime fosfol-uiteinde om het matrixgensegment en een niet-structureel gensegment uit influenza RNA-extracten te versterken. PCR wordt gevolgd door enzymatische spijsvertering en fragmentatie om een kort, enkelstrengs biotinyleerd en versterkt viraan product te genereren, dat vervolgens wordt gehybridiseerd naar de array na hybridisatie.
Fox detectie gebruikt fotopolymerisatie om grote polymeervlekken te laten groeien waar hybridisatie plaatsvindt, en differentiële hybridisatiepatronen worden gebruikt om influenza virale subtypes te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals standaard fluorescentie detectie, is dat het vrij goedkoop is en een snel resultaat oplevert dat zichtbaar is voor het blote oog met een vergelijkbare analytische gevoeligheid als fluorescentie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de karakterisering van influenzavirussen met behulp van de griepchip omdat het een universele detectiemethode is.
Ampl Fox kan ook worden toegepast op een breed scala van andere systemen, zoals andere DNA- en eiwitgebaseerde low density microarrays. In theorie zou elk biotinyleerd product moeten kunnen worden gedetecteerd met behulp van amox. Het demonstreren van de procedure zullen Amber Taylor, een associate scientist, en Kevin Moulton, een onderzoeksassistent hier bij Endeavor zijn, die beide centraal hebben gestaan bij de ontwikkeling van de Fox-instrument en detectiechemie in de afgelopen jaren.
Extract viraal RNA uit 200 microliter van viraal isolaat met behulp van een viraal RNA extractiekit en het protocol van de fabrikant. Eluteer 60 microliters van het eindvolume en bewaar de extracten bij min 70 graden Celsius of lager voor later gebruik. Bereid vervolgens de R-T-P-C-R master mix op IJS volgens het protocol van de fabrikant.
Gebruik een BIOTINYLATED DNTP-mengsel en voeg het griepchip primer mengsel toe, dat de concentraties bevat die in de master mix zijn aangegeven. Een primer uit elke set moet een vijf prime fosfolgroep bevatten om enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken. De flu a primer set produceert een 1032 basenpaar product, en de flu B primer set produceert een 811 basenpaar product.
Vortex kort en verdeel 18 microliter van de master mix in dunne wand PCR buisjes. Voeg vervolgens twee microliter van RNA sjabloon toe aan elke reactiebuis. Breng PCR buisjes over naar een thermische cycler en gebruik een cyclusprofiel met een geschikte knikkende temperatuur.
Het cyclusprofiel dat in deze assay wordt gebruikt, wordt hier getoond. Bereid het enzymatische verteringsmengsel voor door 2,2 microliter van de enzymreactiebuffer, 0,8 microliter van nuclease vrij water en 1,0 microliter van lambda exonuclease enzym per PCR reactie te combineren. Verwijder de monsters uit de thermische cycler en voeg vier microliter toe aan elke PCR buis.
Breng de monsters terug naar de thermische cycler en programmeer de thermische cycler zoals getoond op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door 95 graden Celsius gedurende 10 minuten. Pas vervolgens single use hybridisatieputjes toe rond de microarrays die moeten worden gehybridiseerd. Was vervolgens de slides in 110 milliliter gezuiverd water op een orbitale shaker gedurende vijf minuten.
Droog de slides door voorzichtig een tissuedoekje tegen de rand van de put te houden. Combineer 22 microliter van twee x hybridisatiebuffer met elk van de gefragmenteerde enkelstrengs DNA producten en pipet 40 microliter in de microarrayputjes. Laat de slides hybridiseren gedurende een uur in een vochtigheidskamer na hybridisatie, verwijder de slides uit de vochtigheidskamer en spoel elke slide kort met twee milliliter wasbuffer D. Plaats de slides in een slide rack.
Voeg vervolgens 110 milliliter wasbuffer A en B toe aan aparte containers met behulp van een orbitale shaker. Was de slide rack in buffer A bij 60 tot 90 RPM, de snelheid die voor alle volgende wasbeurten wordt gebruikt, gedurende een minuut. Verwijder vervolgens de slide rack van wasbuffer A en spoel kort met wasbuffer D. Breng de slide rack over naar wasbuffer B en was gedurende vijf minuten op de orbitale shaker.
Na het wassen droog de arrays op elke slide voorzichtig met een tissuedoekje en plaats de droge slides in de vochtigheidskamer. Bereid in voorbereiding op fox kleurmetrische detectiestappen 10 microliter van amplitude, 20 microliter van twee x amplitude buffer, en 10 microliter van gezuiverd water voor elke array die moet worden verwerkt, breng 40 microliter van labelsmengsel over naar elke array en laat de labelreactie doorgaan in een gesloten vochtigheidskamer gedurende vijf minuten Tijdens hybridisatie, bereid 110 milliliter wasbuffer C voor in een container. Na het labelen, spoel elke array onmiddellijk met wasbuffer D. Plaats elke slide in de slide rack en was en was buffer C op de orbitale shaker gedurende vijf minuten na bufferzeewas, dompel de slide rack kort drie keer onder in een container met gezuiverd water.
Om zoutresten te verwijderen droogt u de arrays zoals eerder is aangegeven. Bewaar de arrays in een donkere slide box tot foto activering en beeldvorming, die binnen 24 uur moet worden voltooid. Schakel vervolgens de Amli Fox lezer in en zorg ervoor dat de Amli view software klaar is voor foto activering vóór detectie van het array monster.
Bepaal eerst de optimale foto activeringstijd voor alle monsters door een korte kalibratieprocedure te volgen. Verwarm de versterker oplossing elke dag een keer tot kamertemperatuur en vortex kort om te mengen. Pipet drie microliter van versterker versterker in het versterker vat en vortex grondig. Breng 40 microliter van versterker oplossing gedurende 10 seconden gelijkmatig aan op slechts één slide per keer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
Plaats de microarray slide in de foto activeringsbaai van de Versterker lezer. Start foto activering door te selecteren, start in de PL view software met behulp van de foto activeringstijd die is bepaald in het kalibratieproces. Zodra voltooid, spoel de microarray met twee milliliter gezuiverd water om overtollig versterker helder polymeervorming dat nu is opgetreden op vlekken met doel-DNA te verwijderen, maar beter zichtbaar is.
Laat na het kleuren de polymeervlekken twee minuten drogen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De ampliPHOX colorimetrische detectietechnologie biedt een betaalbaar alternatief voor fluorescentiedetectie bij microarrays. Deze methode maakt gebruik van fotopolymerisatie om binnen enkele minuten zichtbare polymeervlekken te creëren, waardoor een snelle analyse van influenzavirale subtypen mogelijk is.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microarraytechnologie
- Virale detectie
- Signaalversterkingsmethoden
Achtergrond
- Influenzavirussen vormen een aanzienlijk probleem voor de volksgezondheid.
- Traditionele detectiemethoden kunnen kostbaar en tijdrovend zijn.
- Colorimetrische detectie biedt een snel en zichtbaar alternatief.
- Fotopolymerisatie maakt een snelle visualisatie van de resultaten mogelijk.
Doel van de studie
- Om een methode voor snelle signaalversterking te ontwikkelen voor de detectie van influenza.
- Om influenza-virale subtypes te karakteriseren met behulp van een microarrayplatform met lage dichtheid.
- Om een goedkoop en efficiënt alternatief voor fluorescentiedetectie te bieden.
Gebruikte methoden
- Gebruik van gebiotinyleerde DTP's en specifieke primers voor amplificatie.
- PCR gevolgd door enzymatische digestie en fragmentatie van RNA-extracten.
- Hybridisatie van geamplificeerde producten op de microarray.
- Detectie via fotopolymerisatie om hybridisatieresultaten te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle amplificatie en detectie van influenza-virale subtypen.
- Zichtbare polymeerstippen gevormd op hybridisatieplaatsen.
- Resultaten die qua gevoeligheid vergelijkbaar zijn met traditionele fluorescentiemethoden.
- Snelle analyse voltooid in enkele minuten.
Conclusies
- De AmpliPHOX-technologie biedt een kosteneffectieve oplossing voor virale detectie.
- Deze methode verbetert de snelheid en toegankelijkheid van de karakterisering van influenza.
- Potentieel voor bredere toepassingen in diverse scenario's voor virale detectie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
AmpliPHOX colorimetrische detectie biedt een kosteneffectief alternatief voor fluorescentiegebaseerde microarray-analyse voor de karakterisering van influenza-virale subtypes. Door snelle, met het blote oog zichtbare resultaten mogelijk te maken met een vergelijkbare gevoeligheid als fluorescentie, ondersteunt het workflows voor vroege ontdekking waarbij snelheid en toegankelijkheid van invloed zijn op go/no-go-beslissingen. Deze technologie verlaagt de instrumenteringskosten en verbetert de draagbaarheid, waardoor microarray-assays levensvatbaarder worden voor R&D-omgevingen met beperkte middelen of gedecentraliseerde omgevingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via specifieke hybridisatiepatronen op microarrays met lage dichtheid voor discriminatie van influenzasubtypen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het bieden van snelle visuele bevestiging van de aanwezigheid van het doelwit zonder dure beeldvormingsapparatuur.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door biotinyleerde ampliconen te genereren die compatibel zijn met de ampliPHOX-detectiechemie.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via gedefinieerde fotoactivatietijden en polymeerkleuringsstappen die consistente visuele resultaten opleveren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekte-relevante systeemmodellering door de detectie van influenzasubtypen van diverse oorsprong (mens, varken) mogelijk te maken voor mechanische risicoreductie van antivirale kandidaten.
- Operationele waarde: Faciliteert translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie via een draagbaar detectieplatform dat in verschillende laboratoriumomgevingen kan worden gebruikt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De ampliPHOX-detectiemethode past binnen het continuüm van vroege ontdekking en ondersteunt specifiek inspanningen voor lead-identificatie, waarbij snelle fenotypische of genotypische screening dient als basis voor de prioritering van verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking mogelijk door het detecteren van specifieke influenzagensegmenten (matrix en niet-structureel) via hybridisatie van gebiotineerde targets.
- Screening: Levert assay-gereidheid en kwantitatief bruikbare resultaten via gedefinieerde hybridisatie- en fotoactivatiestappen die leiden tot de vorming van meetbare polymeer spots.
- Analytiek: Genereert visuele read-outs die een vergelijkende analyse van hybridisatiepatronen tussen subtypen mogelijk maken, wat datagedreven vergelijkingen van condities ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische continuïteit door subtype-specifieke detectie mogelijk te maken die relevant is voor studies naar de effectiviteit van vaccins en therapeutica.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbare detectiemogelijkheid die toepasbaar is op elk gebiotineerd target op microarrays met lage dichtheid, waardoor het nut wordt uitgebreid van influenza naar andere systemen voor de detectie van pathogenen of eiwitten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door specifieke, visueel waarneembare hybridisatiepatronen die mechanistische ambiguïteit bij de identificatie van virale subtypes verminderen.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gedefinieerde reagensvolumes, tijdcontrole en een compact leesinstrument dat geschikt is voor batchverwerking.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de tijd tot resultaat voor detectiestappen te verkorten van uren naar minder dan 30 minuten, waardoor de opportuniteitskosten in screeningscampagnes worden verlaagd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door vroege, toegankelijke gegevens te leveren over de aanwezigheid van virale subtypes, wat de verdere ontwikkeling van kandidaten met een bevestigd werkingsmechanisme ondersteunt.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologische technieken, waaronder RT-PCR, enzymatische digestie en hybridisatieprotocollen.
- Is afhankelijk van toegang tot het ampliPHOX Reader-instrument, het ampliTAG-labelconjugaat, de ampliPHY-monomeeroplossing en de ampliVIEW-software voor beeldacquisitie en analyse.
- Maakt cross-team standaardisatie van de fotoactivatiekalibratie en kleuringsprocedures noodzakelijk om consistente resultaten tussen gebruikers en locaties te garanderen.
- Houdt rekening met aanpassingen voor het ontwerp van de microarray, aangezien de spotdichtheid onder de ~1800 spots/array moet blijven om te voldoen aan de detectielimieten op basis van polymerisatie.
- Omvat praktische beperkingen, zoals incompatibiliteit met high-density microarrays en een verminderde lineariteit in vergelijking met fluorescentie, waardoor het het meest geschikt is voor kwalitatieve of semi-kwantitatieve toepassingen voor pathogeendetectie.
