Karakterisering van de geïsoleerde, geventileerde en Instrumented Mouse Lung geperfuseerd met pulsatiele flow
29 april 2011
Het volgende protocol schetst het proces van isoleren, ventileren en instrumenteren muis longen stabiel of pulsatiele pulmonale vasculaire druk-flow relaties maatregel om de effecten van de bloedstroom, luchtstroom, luchtweg veranderingen en vasculaire veranderingen op rechter ventrikel afterload kwantificeren.
Om pulsatiele pulmonale druk-stroom relaties te bestuderen. Dit protocol legt uit hoe muislongen geïsoleerd, geventileerd en geperfuseerd kunnen worden. De luchtpijp wordt chirurgisch blootgelegd voor ventilatie.
Vervolgens worden het hart en de longen geïsoleerd zodat de longslagader en het linker atrium gecanuleerd kunnen worden. Het longsysteem wordt vervolgens geperfuseerd. Experimenten worden uitgevoerd door de stroom, grootte, golfvorm en/of frequentie van de longslagader te veranderen.
De resulterende drukgolfvormen van de longslagader en het linker atrium worden geregistreerd en tonen de pulsatiele pulmonale druk-stroom relaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals in vivo preparaten, is dat veranderingen in druk-stroom relaties kunnen worden verkregen zonder veranderingen in volumestatus, sympathische zenuwstelsel toon, activiteit en effecten van anesthesie.
Ook meten de meeste geïsoleerde longpreparaten alleen stabiele druk-stroom relaties, terwijl onze techniek pulsatiele druk-stroom relaties toelaat. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van pulmonale fysiologie, zoals hoe pulmonale vasculaire ziekte pulsatiele pulmonale hemodynamiek beïnvloedt, of hoe grote verstijving van de longslagader de nabelasting van de rechter ventrikel beïnvloedt? Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het blootleggen van het hart en de longen en het bevestigen van de canule in de longslagader moeilijk te leren is.
Overmatige druk van de instrumentatie kan oedeem in de longen veroorzaken en onjuiste canuleplaatsing kan de longslagader doorboren. Voordat het experiment begint, is het noodzakelijk om de IL een systeem voor te bereiden dat wordt gebruikt om de geïsoleerde long te beluchten en te perfunderen. De slang moet worden aangesloten op de druktransducers.
Een enkele pomp en flowmeter spoelen het systeem volledig met gedistilleerd water opgewarmd tot 37 graden Celsius en verwijderen eventuele luchtbellen in de slang. Spuis vervolgens de Endur tech pompslang met 1% PBS. Nu nul.
De druk voor elke P 75 transducer wordt bepaald door eerst de klep naar het IL een systeem te sluiten en de klep naar de atmosfeer te openen. Gebruik vervolgens de plug SIS versterker om de druk automatisch op nul te stellen voordat u het dier voorbereidt. Bevochtig de IO een setup door het keramische poreuze stuk in gedistilleerd water te weken. Nadat de muis is geanesthetiseerd, stabiliseer de muis voor de operatie door zijn voorpoten op een kurkplank te spelden.
Spuit nu de borst met 95% alcohol. Gebruik rechte pincetten om de huid bij de nek vast te grijpen en snijd een centimeter opening met de rechte schaar. Zodra de binnenkant van de nek is blootgelegd, snijd het witte klierweefsel weg in de oppervlakkige spieren terwijl je op zoek bent naar de slokdarm en luchtpijp.
Isoleer de slokdarm en luchtpijp van het weefsel aan beide zijden en van achteren en bind een losse naald rond de luchtpijp. Om de luchtpijp te canuleren, snijd voorzichtig een kleine V in een kant ervan met de kleine schaar. Neem nu de muis naar het IL een systeem met stompe pincetten.
Grijp de luchtpijp canule en schuif deze in de luchtpijp. Zet de canule vast met een naald. Begin met beluchten met kamerlucht, spuit de borst met alcohol en verwijder de huid met rechte pincetten en rechte schaar.
Snijd de huid omhoog langs het borstbeen. Til de huid aan elke kant op en snijd langs de lijn van de onderste ribben. Grijp nu het xiphoïde proces met pincetten en gebruik ballpoint schaar om een gat in het middenschot te snijden waar het de onderkant van het borstbeen ontmoet.
Grijp het middenschot en snijd het los van de ribben. Gebruik ballpoint schaar om het xiphoïde proces opnieuw vast te grijpen en gebruik de ballpoint schaar om voorzichtig het borstbeen door de ribben te snijden zonder de longen, het hart of de bloedvaten te beschadigen. Om het hart bloot te leggen, grijp de linker ribben en snijd hun uiteinden af.
Spuit nu langzaam 0,1 milliliter heparine in de rechter ventrikel. Snijd na de injectie de rest van de ribben weg. Gebruik de achterkant of afgeronde kant van de pincetten om voorzichtig de longen weg te duwen van de rib terwijl je de ribben onder een microscoop snijdt. Verwijder klierweefsel in het vet bovenop het hart.
Gebruik de pincetten om de weefsels weg te trekken en te trimmen. Gebruik de veerscharen om een naald rond de aorta en longslagader te plaatsen, schep het hart voorzichtig met stompe pincetten. Er zou weinig weerstand moeten zijn.
Bind nu een losse naald met de dubbele draai. Snijd vervolgens de onderbuik weg. Gebruik schuine schaar om door de ribben en wervelkolom te snijden.
Dit zal ervoor zorgen dat er een aanzienlijke hoeveelheid bloed zal stromen. Gebruik een wattenstaafje om de stroom te stoppen. Zodra de bloedstroom is gestopt, spoelt u het IL-systeem met vier milliliter RPMI vanuit een spuit gevuld met 10 milliliter RPMI.
Het is goed om dubbel te controleren of de slang geen luchtbellen bevat. Canuleer vervolgens de rechter ventrikel door een kleine inkeping te snijden nabij de apex en de canule in te brengen. Richt naar beneden in de rechter kant om de longslagader te bereiken. De punt van de sonde moet zichtbaar zijn door de bijna transparante wand van de longslagader.
Trek vervolgens de naald vast rond de canule, aorta en longslagader om de linker ventrikel te canuleren. Snijd een inkeping in de apex en breng de canule in met als doel naar boven in het linker atrium. Er kan lichte druk nodig zijn om de klep te vinden, maar eenmaal gevonden, zal de canule erdoor glijden en veilig zijn zonder een naald.
Infundeer handmatig RPMI uit de 10 milliliter spuit met 0,3 milliliter per minuut totdat u stroom in de uitlaatslang ziet. Als er geen stroom in de uitlaatslang is, herpositioneert u de linker ventrikel canule. Als er echter geen stroom in de longen is, moet het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het proces van het isoleren, ventileren en perfunderen van muizenlongen om pulsatiele druk-stroomrelaties in de longen te bestuderen. Het doel is om de effecten van verschillende factoren op de afterload van de rechterventrikel te kwantificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Pulmonale fysiologie
- Cardiovasculair onderzoek
- Experimentele biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de druk-stroomrelaties in de pulmonale vaten is cruciaal voor de cardiovasculaire gezondheid.
- Het isoleren van muizenlongen maakt gecontroleerde experimenten mogelijk.
- De afterload van de rechterventrikel wordt beïnvloed door de bloedstroom en veranderingen in de luchtwegen.
- Het bestuderen van deze relaties kan inzicht bieden in pulmonale aandoeningen.
Doel van de studie
- Om stationaire en pulsatiele druk-stroomrelaties in de pulmonale vaten te meten.
- Om de effecten van bloedstroom en luchtstroom op de afterload van de rechterventrikel te kwantificeren.
- Om de impact van vasculaire veranderingen op de longfunctie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van muizenlongen via chirurgische blootstelling van de trachea.
- Ventilatie en perfusie van het pulmonale systeem.
- Cannulatie van de arteria pulmonalis en het linker atrium.
- Experimentele manipulatie van de stroom en golfvorm in de arteria pulmonalis.
Belangrijkste resultaten
- Vaststelling van een protocol voor het meten van druk-stroomrelaties in de longen.
- Demonstratie van hoe veranderingen in de stroom de nabelasting van de rechterventrikel beïnvloeden.
- Inzichten in de dynamiek van de pulmonale vasculaire weerstand.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van pulmonale hypertensie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van de pulmonale hemodynamiek.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de cardiovasculaire fysiologie.
- Verder onderzoek kan therapeutische interventies voor pulmonale aandoeningen verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie
Kwantitatieve karakterisering van de pulmonale vasculaire weerstand en impedantie in geïsoleerde, beademde muizenlongen maakt een nauwkeurige risicoreductie van mechanismen van de rechterventrikel-afterload in preklinische modellen mogelijk. Deze benadering biedt onafhankelijke controle over belangrijke fysiologische variabelen, wat bijdraagt aan een betrouwbare targetvalidatie en mechanistische analyse van pulmonale vasculaire aandoeningen. Het vermogen van deze methode om proximale versus distale vasculaire bijdragen te onderscheiden, bevordert de translationele continuïteit van moleculaire perturbatie naar functionele hemodynamische resultaten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target-validatie
- Maakt rigoureus testen van therapeutische hypothesen mogelijk met betrekking tot de relaties tussen structuur en functie van de pulmonale vaten.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de effecten van genetische of farmacologische interventies op de vasculaire impedantie en weerstand te isoleren.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door de nabelasting van de rechterventrikel te kwantificeren als reactie op defecten op moleculair niveau.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd ex vivo systeem voor reproduceerbare meting van druk-stroom- en impedantiemetrieken.
- Standaardiseert kwantitatieve outputs zoals Z0, ZC en RW voor comparatieve screening van verbindingen of genetica.
- Maakt schaalbare beoordeling mogelijk van de site-specifieke werkingen van vasoactieve middelen binnen de pulmonale vasculatuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische hemodynamische eindpunten uit met klinisch relevante maten van de rechterventrikel-afterload.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door moleculaire verstoringen te koppelen aan functionele vasculaire uitkomsten.
- Maakt risicogecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van predictieve hemodynamische read-outs in ziekterelevante modellen.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinische validatie door een platform te bieden voor hypothesetoetsing, mechanistische risicoreductie en kwantitatieve beoordeling van de pulmonale vasculaire functie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de isolatie van onafhankelijke variabelen om de bijdragen van pathways aan vasculaire impedantie en weerstand te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve hemodynamische resultaten voor vergelijkingen tussen verschillende condities en verbindingen.
- Analytica: Maakt de berekening van druk-stroomcurven met meerdere meetpunten en frequentieafhankelijke impedantiematen mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische of farmacologische interventies met klinisch relevante maten van de nabelasting van de rechterventrikel.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar, gestandaardiseerd platform voor functionele beoordeling van de pulmonale vaten over verschillende R&D-programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en het mechanistische begrip van pulmonale vasculaire aandoeningen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van hemodynamische assays.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door het bieden van robuuste, kwantitatieve eindpunten voor portfoliotriage.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en verbindingen mogelijk op basis van functionele vasculaire uitkomsten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische longisolatie- en canulatietechnieken.
- Vereist nauwkeurige instrumentatie voor de meting van druk, flow en impedantie.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie van perfusie- en ventilatieparameters tussen teams.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan protocoloptimalisatie vereisen vanwege anatomische verschillen.
- Voorzichtige hantering is essentieel om artefacten zoals oedeem of vaatperforatie tijdens de opstelling te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Introduction
1:52
Preparing the IL-1 System
2:42
Ventilating a Mouse
3:34
Perfusing a Ventilated Mouse
6:28
Measuring Steady and Pulsatile Pulmonary Pressures and Flow
7:57
Pulmonary Artery and Left Atrial Pressure Measurements
9:11
Conclusion
