In vivo Laser axotomy in C. elegans

Het algemene doel van deze procedure is om de neuronen van CL nauwkeurig in vivo met een laser door te snijden. Dit wordt bereikt door het taxotomiesysteem te assembleren en de laser nauwkeurig te focussen, uit te lijnen en het vermogen hiervan aan te passen. Wanneer wormen op een objectglas worden geïmmobiliseerd, kunnen hun neuronen met precieze spatiale en temporele controle worden doorgesneden.

De mate waarin doorgesneden neuronen regenereren wordt vervolgens gemeten door te scoren op groeikegels en/of door de lengte van de neurieten te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de femtoseconde-laser, is dat de micropunt-pulslaser een kosteneffectief systeem is dat eenvoudig op te stellen en te onderhouden is en gemakkelijk aanpasbaar is voor een breed scala aan toepassingen, hoewel we deze methode gewoonlijk toepassen om de regeneratie van GABA-motorneuronen te bestuderen. Het systeem kan ook worden gebruikt om andere celtypen te ablateren, zoals huidspiercellen of specifieke neuronale synapsen.

Deze methode vereist een micro-punt lasersysteem. De laser wordt gemonteerd op de epifluorescentiepoort van een samengestelde microscoop en bevat een enkele dichroïsche spiegel die overeenkomt met de fluorofoor in de te snijden cellen, een pulsgenerator en een voetpedaal om de laser te bedienen. De microscoop moet minimaal zijn uitgerust met een 100x 1,4 NA olie-objectief en een 4x objectief.

Gebruik een gemotoriseerde tafel met joystickbediening, gemonteerd op een luchttafel voor de verlichting. Een lichtbron met lichtgeleider en een sluiter mechanisme is bevestigd aan de micro-puntlaser. Het sluiter mechanisme is nuttig om de verlichtingsintensiteit onafhankelijk van de laser te verminderen.

Een camera die is aangesloten op een computer vereist een framerate van ten minste 16 hertz en moet goed functioneren bij weinig licht. De computer vereist beeldverwerkingssoftware, zoals Nikon elements, om de neuronen te bekijken, de camera aan te sturen en de gemotoriseerde tafel te bedienen. Wanneer het systeem volledig is gemonteerd, kan de gebruiker de microscoop met één hand scherpstellen, de tafel met de andere hand bewegen, de laser met het voetpedaal activeren en een duidelijk zicht hebben op het beeld op het scherm.

Het doorsnijden van neuronen in een organisme ter grootte van een zandkorrel kan uitdagend zijn. Om dit te bereiken, moet de laser in alle drie de dimensies strak worden gefocust. Begin met het focussen van het Z-vlak.

Schuif het neutrale dichtheidsfilter ND 16 in om de laser te dempen voor een nauwkeurigere focussering, door zowel het ND 16-filter als de vier fluorescentiefilters in te schuiven. Stel vervolgens de micro-puntlaser in op één puls met de schakelaar op selectie, en draai daarna het filterwiel naar het juiste long-pass barrièrefilter. Plaats nu een gespiegelde slide op de tafel en focus met het 4x objectief en doorgelaten licht op de pinholes in de slide.

Zodra de focus is ingesteld, wordt een druppel immersieolie op het objectglas aangebracht en wordt er opnieuw gefocust op de pinholes met het 100-voudige objectief. Gebruik vervolgens de hendel voor het schakelen van het optische pad om de camerashutter en de lasershutter te openen. Als het lastig is om een nauwkeurige focus te verkrijgen, dient de intensiteit van het doorgelaten licht te worden verminderd zodat de randen van de pinhole scherp zijn.

Om de focus te testen, gebruikt u het voetpedaal om de laser te activeren. Als het Z-vlak correct is gefocust, moet er een klein gaatje in de spiegel verschijnen. Focus de microscoop nu iets boven het vlak van het gespiegelde objectglas en activeer de laser opnieuw.

Dit zou een nog kleiner gat moeten maken dan bij het eerste schot, of helemaal geen markering moeten achterlaten. Dezelfde resultaten moeten zichtbaar zijn bij het focussen onder het gespiegelde objectglas. Als er echter een groter gat ontstaat, moet de laser opnieuw worden gefocust met de focusring op de ablatiekop.

Controleer ten slotte of het gat nog steeds correct is uitgelijnd met het kruisdraad in het oculair. Bij consistent gebruik hoeft de focus in het Z-vlak zelden te worden aangepast. Om de laser in het XY-vlak te focussen, maakt u een tweede gat in de spiegel en opent u vervolgens de software in Nikon elements.

Activeer de live-capturemodus in het acquisitiemenu. Selecteer in de meetwerkbalk de ROI-editor, kies het dubbele kruisgereedschap en sleep het kruiskoord om dit uit te lijnen met het centrum van het nieuwe gat. Klik op ROI opslaan en verlaat vervolgens de editor om de live-capture te hervatten.

Om de tafel met de muis te besturen, activeert u de muis XY-instelling. De laser is nu gefocust. Zet de neutrale dichtheidsfilters terug naar hun oorspronkelijke positie en stel de laserpulsen in van één naar 10 voor toekomstig gebruik.

Bereid eerst een oplossing van 3% gesmolten aros in M nine-oplossing voor en pipetteer ongeveer 5 ml in een buis van 50 ml. Plaats de buis in een waterbad van 55 tot 65 °C en bewaar het restant voor toekomstig gebruik. Gebruik nu twee objectglazen voorzien van etiketten.

Plak een paar schone objectglazen aan elkaar en voeg een druppel agarose toe om een bedje te maken waarop de wormen kunnen worden geplaatst. Na 30 seconden is de agarose gestold; pipetteer drie tot vijf µL polystyrene beads van 0,05 tot 0,1 µm op het bedje. Plaats binnen 10 minuten snel vijf tot 10 transgene wormen met een platina pick op de beads, zodat hun gelabelde neuronen gemakkelijk zichtbaar zijn. Plaats voorzichtig een standaard dekglas op de wormen om beschadiging te voorkomen.

Schuif het heen en weer. Het wormpreparaat is nu gereed voor het uitvoeren van taxonomies. Lokaliseer de wormen met behulp van het oculair bij een viervoudige vergroting, stel opnieuw scherp met het 100x objectief, schakel het doorgelaten licht uit, zet de fluorescentie aan en schakel het optische pad over naar de camera.

Gebruik de muis om het neuron in het midden van het kruisdraad te plaatsen. Activeer vervolgens de laser met het voetpedaal. De juiste laserintensiteit zal het neuron in één of twee pulsen doorsnijden.

Te veel laservermogen zal perifere schade veroorzaken of een gat in de worm branden; om het vermogen van de laser aan te passen, moet de dempingsplaat worden verplaatst. Als de laser zwakker wordt, kan de positie van de dempingsplaat worden aangepast om het snijden voort te zetten. Dit is echter waarschijnlijk een indicatie dat de Kumar in four 40 in de D-cel van de laser moet worden vervangen wanneer dit correct wordt uitgevoerd.

Laser-taxotomie veroorzaakt een kleine onderbreking in het neuron. In bepaalde gevallen kan er een klein litteken ontstaan rond de plaats van het letsel. In de praktijk worden er tussen de één en drie neuronen per dier doorgesneden, maar er is geen theoretische limiet.

Wanneer u klaar bent, herstelt u de wormen door het dekglas in een rechtlijnige opwaartse beweging te verwijderen, waarbij u er op let dat de wormen op het agarosepad blijven. Verschuif het dekglas niet. Gebruik pincetten met een spitse punt om het pad rondom de wormen uit te snijden.

Plaats het kussentje op een vers gezaaide NGM-plaat met OP 50 en laat de wormen vrij met 10 µL steriele M9. Tussen acht en 48 uur na de exotomie kan de regeneratie worden beoordeeld; om dit te doen, monteert u de gezonde wormen opnieuw op drie tot vijf µL polystyreenbolletjes en visualiseert u hun neuronen in doorsneden neuronen. Een neuronale stomp distaal van de snijplaats blijft behouden. Zowel de distale als de proximale stompen trekken aanvankelijk terug na het snijden, maar regeneratie wordt verwacht vanuit de proximale stomp.

Regeneratie kan worden gescoord op basis van de vorming van een groeikegel. Als alternatief kan de neurietenlengte worden gevolgd en vergeleken; doorgaans vormen 60 tot 70% van de GABA-neuronen groeikegels binnen 24 uur na het doorsnijden. Als de laser niet correct snijdt, komt dit waarschijnlijk doordat de laser niet in focus is of doordat de kleurstof in de kleurcel moet worden vervangen.

Bovendien, als u merkt dat de wormen rondbewegen, komt dit waarschijnlijk doordat het agros-kussen te vochtig is. We hebben vastgesteld dat de kussens ongeveer 30 seconden moeten rusten voordat de wormen erop worden geplaatst om dit probleem te voorkomen. Daarnaast kunt u proberen microbeads van een kleinere afmeting te gebruiken om de wormen te immobiliseren.

Ten slotte, als u merkt dat de axonen een kralachtig uiterlijk hebben, is dit waarschijnlijk omdat het agar-kussen te droog is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het micro-point lasersysteem opstelt. Monteer wormen voor taxotomie, snijd individuele neuronen door en beoordeel de daaropvolgende regeneratie.