Name: Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Leer hoe je insuline-injectie en hemolymfe-extractie toepast om insulinegevoeligheid te meten in volwassen Drosophila melanogaster. Deze methode minimaliseert darmcontaminatie en meet glucoseklaring via spectrometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIA naar YW.CF (AG21068, AG31086).

1. Insuline bereiding van oplossingen <ol><li> Bereid vers vlees van runderen insuline-oplossing door het oplossen van insuline in PBS met de concentratie van 0,01 mg / ml te bereiken. Zowel insuline / PBS en controle PBS oplossingen moeten worden bewaard op ijs gedurende de injectie procedure. Deze oplossingen moeten worden bereid met 0,5% (v / v) FD &amp; C Blue geen. Een kleurstof. </li></ol> 2. Naald Voorbereiding en injectie Set-up <ol><li> Bereid capillaire glazen naalden met behulp van een micropipet puller.The volgende puller instellingen produceren naalden van voldoende kwaliteit voor injectie: Heat, 345, Pull, 210, Velocity, 100, Time, 200 (100ms). Vers getapt naalden moeten worden tegengewerkt door het indrukken van de tip via een Kimwipe weefsel. Deze afstomping proces verwijdert de langgerekte hoge weerstand tip en produceert een stouter tip met een grotere poriën diameter. </li><li> Plaats blunted naalden tip-up in een microcentrifugebuis met de insuline / PBS-oplossing of PBS alleen. Capillaire werking resulteert in een back-vulling van elke naald. Let op de punt van de naald onder een stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen vuil of luchtbellen verschijnen aan het uiteinde. Gooi naalden die niet netjes te vullen. </li><li> Plaats de gevulde naalden in de handleiding microinjector naaldhouder en de positie van de naald houder met een micromanipulator, zodat de naald is zichtbaar door een stereomicroscoop. Van toepassing zijn positieve druk op de vloeistof kolom in de naald door het draaien van de handleiding microinjector micrometer knop aan de zuiger op de microinjector spuit. </li><li> Controleer of er voldoende druk voor vloeistoffen is toegepast door het aanraken van een Kimwipe aan het uiteinde van de naald en bevestigen vloeistofstroom. </li><li> Zodra de naald is voorbereid voor injectie, een kalibratie grafiek aanbrengen om de naald as met heldere tape, en breng de naald in beeld door middel van een stereomicroscoop onder een vergroting van 20x. </li></ol> 3. Fly Voorbereiding <ol><li> Tien dagen oude vrouwtjes worden gebruikt voor injectie experimenten. Verzamel vliegt binnen de 24 uur van Eclosion. Verdoven vliegt met bevochtigde CO 2 op een gas-pad, een soort uit mannetjes en vrouwtjes plaats in flesjes met standaard of behandeling dieet. Onderhouden vrouwtjes over experimentele diëten voor 10 dagen. </li><li> Op de tiende dag na Eclosion en scheiding op experimentele diëten, transfer vliegt van hun voedsel-bevattende flacons dat flacons met een 5 ml stekker van 2% agar en verhongeren ze voor 12-16 uur </li><li> Overdracht uitgehongerd vliegt naar flacons met 10% glucose geweekt filters gedurende 1 uur voorafgaand aan de insuline-injectie. </li><li> Kort verdoven de vliegen met bevochtigde CO 2 na glucose voeden en vervolgens koud te immobiliseren op ijs. </li></ol> 4. Injectie Procedure <ol><li> Voorzichtig greep een koude-geïmmobiliseerde vliegen met een paar fijne pincetten en houd het dicht bij de naald, zodat de tip grenst aan het voorste deel van de linkerkant van de thorax van de vlieg. Breng zowel de naald en de vlieg thorax in beeld onder de stereomicroscoop. </li><li> Beweeg de vlieg in de richting van de naald, zodat de naald raakt het midden van de uitstulping van de linker prescutum gebied van de thorax van de vlieg (afb. 1). Zodra de vlieg in de juiste richting en in lijn met de naald tip, blijven de vlieg op de naald, zodat de naald het midden van de prescutum doorboort vooraf. </li><li> Van toepassing zijn positieve druk indien nodig door het bevorderen van de zuiger met micromanipulator van de microinjector de knop tot 0,1 pi van vloeistof is geïnjecteerd in de vlieg. De stroom van vocht in hemocoel de vlieg zal geven een blauwe kleur aan de linkerkant van de voorste thorax. Af en toe moet men intrekken en vooraf een paar keer op een punt van de naald verstopping los en voor de vloeistofstroom mogelijk te maken. </li><li> Laat geïnjecteerd vliegt in 2% agar flesjes terug voor aangewezen tijdstippen voor hemolymfe extractie. </li></ol> 5. Hemolymfe Collection <ol><li> Kort verdoven vliegt met bevochtigde CO 2 op de gewenste post-injectie tijd punten en positie elke fly rug-side-down op dubbelzijdig tape aangebracht op het oppervlak van een CO 2 pad. Schik vliegt zelfs in rijen met uitgelijnd hoofd capsules. Men kan gebruik maken van een bijgesneden houten applicator vasthouden aan hun vleugels druk in de tape lijm en immobilisatie te verzekeren. </li><li> Zodra vliegen zijn bevestigd aan de band, pakt elke vlieg proboscis met fijn pincet en trek het voorzichtig naar de ventrale en dan achterste deel van de vlieg, zodat de voorkant van het hoofd capsule is zichtbaar door de stereo microscoop. </li><li> Met uw andere hand en terwijl de proboscis in positie, doorprikken het midden van het hoofd capsule net boven de ptilinal hechtdraad met een scherp wolfraam naald (afb. 2). Men moet oppassen niet om de naald te ver omdat het gemakkelijk is om de punt van de naald punch via de andere kant van het hoofd capsule en vervolgens te verliezen cONTROLE van hemolymfe flow. Punctie vliegt alles in een injectie groep voor het verzamelen van hemolymfe. </li><li> Zodra het hoofd capsule heeft aangeprikt, gebruik dan een bijgesneden houten stok applicator voorzichtig druk uit te oefenen op de buik van de vlieg. Het kan nuttig zijn om het viaduct, zodat het rust op zijn buikzijde als u druk uitoefenen roll. Deze procedure zal een druppel van hemolymfe van het hoofd capsule prikplaats. </li><li> Raak het ene uiteinde van een 1μl microcapillaire buis aan de hemolymfe druppel die uit het hoofd capsule prikplaats. De hemolymfe zal in de buis via capillaire werking. Bepaal en noteer de hoeveelheid hemolymfe verzameld door het controleren van de vloeistof kolom binnen de microcapillaire buis tegen een afgestudeerd volume grafiek. </li></ol> 6. Hemolymfe Glucose Bepaling <ol><li> Eject hemolymfe monsters in microtiterplaat putjes die 100 ul van Infinity Glucose reagens. Houd plaat op ijs tijdens het laden van hemolymfe monsters. </li><li> Stel een standaard curve door het laden van een afzonderlijk ui elk van glucose voorraad oplossingen op 50mm, 25mm, 12,5 mm, 6.25mM en 3.125mM. </li><li> Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Detect absorptie bij 340 nm. </li><li> Account voor hemolymfe volume verzameld en te bepalen steekproef glucose concentratie op basis van de standaard curve met bekende glucose concentraties. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Een typische reactie van insuline tolerantie wordt gedetecteerd in insuline-injectie vliegt, waar een daling van het circulerende glucose wordt gedetecteerd 15 minuten na de injectie. In tegenstelling, is een dergelijke reactie niet gezien in PBS geïnjecteerd vliegt (afb. 3). Deze reactie in de afvoer van perifere glucose blijft in het insuline-injectie vliegt tot 30 minuten na de injectie. We routinematig extract 0,2-0,5 pi hemolymfe per 4-5 vliegt in elke injectie groep. Drie injectie groepen worden opgenomen in elk experiment. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Linkerkant van Drosophila thorax met naald inbrengen site (Aangepast uit Demerec, 1950) 7. Steek de naald door het midden van de prescutum op de voorste, rug-regio van de linker zijde van de thorax. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vooraanzicht van Drosophila hoofd zien punctie plaats voor hemolymfe extractie (Aangepast uit Demerec, 1950) 7. Prik de kop capsule met een fijn geslepen wolfraam sonde in het midden van het hoofd capsule net boven het ptilinal hechtdraad. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Een typische reactie van insuline tolerantie waargenomen in de controle volwassen vliegen. Controle w 1118 vliegt werden geïnjecteerd met insuline van runderen (1 ng in PBS) of PBS alleen. Vliegen in repliceren groepen werden vervolgens toegestaan ​​om te herstellen voor 0, 15 of 30 minuten en circulerende glucose niveaus werden gemeten.

<ol><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li>
<li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li>
<li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longer+lifespan%2C+altered+metabolism%2C+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li>
<li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li>
<li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li>
<li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li>
<li>Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).</li>
</ol>

De techniek wordt beschreven in dit rapport is potentieel bruikbaar in een studie dat fysiologische processen resulteert in aantoonbare veranderingen in Drosophila hemolymfe samenstelling onderzoekt. Door het combineren van injectie en hemolymfe collectie op deze manier, is het mogelijk om vast te stellen de directe fysiologisch relevante effecten van een bepaalde experimentele behandeling of manipulatie. Het voornaamste voordeel van deze &quot;bloedvergieten&quot; techniek in hemolymfe collectie ten opzichte v...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Runderen insuline </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> Infinity Glucose Reagens </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> TR1541 </td></tr><tr><td> Handleiding microinjector </td><td> Sutter Instrument </td><td></td></tr><tr><td> P-87 Flamming / Brown micropipet puller </td><td> Sutter Instrument </td><td></td></tr><tr><td> Single barrel borosilicaat glas capillair </td><td> AM-systemen </td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD &amp; C Blue nr. 1 </td><td> McCormick &amp; Company </td><td></td></tr><tr><td> 1 pi microcapillaire buizen </td><td> Drummond </td><td></td></tr><tr><td> Drie-assige manuele micromanipulator en de basis </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td></td></tr></tbody></table>

insuline-injectie en hemolymfe extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs drosophila melanogaster</em

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Geconserveerde voedingsstoffen sensing mechanismen bestaan ​​tussen zoogdier en de fruitvlieg, waar peptiden die lijken op zoogdieren insuline en glucagon, respectievelijk de functie om glucose homeostase te handhaven tijdens ontwikkeling larvale stadia 1,2. Studies over grotendeels post-mitotische volwassen vliegen hebben aangetoond verstoring van de glucose homeostase als gevolg van genetische ablatie van insuline-achtige peptide (ILP) producerende cellen (IPC&#39;s) 3. Zo volwassen fruitvliegjes zijn veelbelovend als een geschikt modelsysteem voor genetisch metabole aandoeningen, waaronder type II diabetes. Verdere ontwikkeling van de fruitvlieg-systeem, dient men over vergelijkbare fysiologische testen gebruikt om de glucose tolerantie en de gevoeligheid voor insuline bij zoogdieren te meten worden vastgesteld. Daartoe hebben we onlangs beschreven een nieuwe procedure voor het meten van orale glucose tolerantie respons in de volwassen vliegen en het belang aangetoond van volwassen IPC&#39;s bij het ​​handhaven van glucose-homeostase 4,5. Hier hebben we aangepast van een eerder beschreven procedure voor de insuline-injectie 6 en gecombineerd met een nieuwe hemolymfe extractie methode om perifere insuline gevoeligheid te meten in de volwassen vlieg. Uniek is dat ons protocol maakt een directe fysiologische metingen van het vermogen van de volwassen vlieg te beschikken over een perifere glucose-belasting op insuline-injectie, een methodiek die maakt het mogelijk om insuline signalering mutanten en de mogelijke interventies die de glucosetolerantie en insulinegevoeligheid in de volwassen vlieg karakteriseren.

Geconserveerde insuline signaalwegen te vinden in de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Maken van dit organisme een potentieel instrument voor het modelleren van metabole aandoeningen, waaronder type II diabetes. Daartoe is het essentieel om fysiologische testen vast te stellen systemische werking van insuline effectief te kunnen meten in de afvoer van perifere glucose in de volwassen vlieg.

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster</em

Geconserveerde mechanismen voor voedingsstoffen-sensing komen voor bij zowel zoogdieren als fruitvliegen, waarbij peptiden die respectievelijk lijken op het zoogdier-insuline en -glucagon functioneren ...

Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van geïnjecteerde insuline op de glucosewaarden in de hemolymfe van volwassen Drosophila melanogaster te meten. Dit wordt bereikt door eerst uitgehongerde vliegen een geconcentreerde glucoseloplossing te laten consumeren. De tweede stap van de procedure is het injecteren van insuline in de vliegen die glucose hebben geconsumeerd.De derde stap van de procedure is het afnemen van een onbesmette hemolymfemonster. De laatste stap van de procedure is het bepalen van de glucoseconcentratie in de hemolymfe. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat exogeen insuline de glucoseklaring bij Esof la Melan gaster faciliteert via spectrometrie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het onthoofden van volwassen vliegen voor bloedafname, is dat deze procedure de darminhoud minimaliseert. Besmetting van het hemolymfemonster. Verzamel de vliegen binnen 24 uur na occlusie door ze te anesthetiseren met bevochtigde koolstofdioxide. Sorteer de vrouwelijke vliegen en plaats deze in vials met standaardvoeding.Laat de vliegen 10 dagen oud worden. Na 10 dagen worden de vliegen overg

insulin-injection-hemolymph-extraction-to-measure-insulin-sensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Deze video beschrijft hoe een injectie van levende volwassen vliegen uit te voeren en bevat een voorbeeldprotocol waarin gelabelde deeltjes en trypanblauw in de buik van vliegen worden geïnjecteerd om fagocytose te meten.

Injectie van volwassen Drosophila-vliegen: een methode voor samengestelde of labelafgifte

De Drosophila hemolymph dient als zowel bloed als interstitiële vloeistof en circuleert door het hele lichaam tijdens de larve- en volwassen stadia. Deze video beschrijft een protocol om larvale hemolymph te verzamelen om de circulerende cellen te kwantificeren.

Cuticula disruptie: een methode om hemolymph te verzamelen van Drosophila larven

Dit artikel beschrijft een methode voor de meting van brandstofoxidatie in Drosophila melanogaster waarbij sporenhoeveelheden van specifieke radioactief gelabelde metabole substraten aan vliegen worden gevoerd. Het uitgeademde radioactief gelabelde CO2 dat wordt geproduceerd uit brandstofoxidatie wordt verzameld en gemeten.

Meting van de productie van koolstofdioxide uit Radioactief gemerkt Substrates in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

De CApillary FEeder (CAFE) test is een eenvoudige, budgetvriendelijke en zeer betrouwbare methode voor het onderzoeken van mechanismen die ten grondslag liggen aan voedselinname. Gebruikt met het zeer veelzijdige genetische modelorganisme Drosophila melanogaster, biedt het een krachtig middel om nieuwe inzichten te verkrijgen in de regulerende mechanismen van voedselinname.

De capillaire Feeder test meet voedselinname bij<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Dit witboek beschrijft een protocol voor ex vivo calcium beeldvorming van de hersenen van Drosophila . Bij deze methode, kunnen natuurlijke of synthetische verbindingen worden toegepast op de buffer voor het testen van hun vermogen om bepaalde neuronen in de hersenen activeren.

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Integriteit van de bloed-hersen barrière is essentieel voor de functie van het zenuwstelsel. In Drosophila melanogasterwordt de bloed-hersen barrière gevormd door gliacellen tijdens de late embryogenese. Dit protocol beschrijft methoden voor het testen van de vorming en het onderhoud van de bloed-hersen barrière in D. melanogaster -embryo's en derde instar larven.

Test voor de integriteit van de bloed-hersen barrière in Drosophila melanogaster

Dit protocol beschrijft een in vivo test van fagocytose die wordt gebruikt om het vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te beoordelen en te kwantificeren..

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Leer hoe je insuline-injectie en hemolymfe-extractie toepast om insulinegevoeligheid te meten in volwassen Drosophila melanogaster. Deze methode minimaliseert darmcontaminatie en meet glucoseklaring via spectrometrie.

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster

Meer video's verkennen