Name: Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Ontdek hoe siRNA-gemedieerde gen-silencing en live-cell calcium imaging Ca²⁺-lekkanalen in het ER-membraan identificeren. Deze methode onthult regulerende mechanismen van SEC61A1 in calciumsignalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SL werd ondersteund door een beurs van de DFG (Graduate Research School 845). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de DFG (530/C1 SFB &amp; VOOR 967) en door HOMFOR.

1. Bereiding van de stam oplossingen <ol><li> Bereid calcium-vrije buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 10 mM glucose in 10 mM HEPES-KOH, (pH 7,35)). </li><li> Solubiliseren Fura-2 AM in DMSO tot een een mM voorraad oplossing te verkrijgen. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing homogeen licht geel. Bescherm beker tegen licht. Verdun de Fura-2 AM voorraad oplossing in 1 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine tot een uiteindelijke concentratie van 4 uM voor het laden van HeLa-cellen. </li><li> Bereid een 12,5 mM puromycine voorraad-oplossing in gedestilleerd water (pH 7,0). Bewaar fracties bij -20 ° C. Verdun de 12,5 mM puromycine voorraad oplossing in de calcium-vrije buffer tot een eindconcentratie van 500 uM puromycine. </li><li> Los thapsigargin in DMSO tot een een mM Stock oplossing te verkrijgen. </li><li> Solubiliseren 1 mg ophiobolin A in 20 pi chloroform en vervolgens mengen met 25 ul DMSO. De microcentrifugebuis blijft open tot chloroform is verdampt. Dus de uiteindelijke ophiobolin Een concentratie is 100 mm. Bewaar fracties bij -20 ° C. Voor gebruik verdunnen voorraad oplossingen in calcium-vrije buffer tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. Zo doet uiteindelijke DMSO concentratie voor live-cell imaging niet meer dan 0,1%. </li><li> Los trifluoperazine in DMSO tot een concentratie van 10 mM en op te slaan porties bij -20 ° C. Verdun de voorraad oplossingen in calcium-vrije buffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 uM voorafgaand aan gebruik. Zo uiteindelijke DMSO concentratie voor live-cell imaging, zoals voor ophiobolin A, niet meer dan 0,1%. </li><li> Los van de siRNA's (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA en controle siRNA) in RNase vrij water tot een 20 uM voorraad oplossing voor te bereiden. Meng met behulp van een vortex en observeer oplosbaar met het blote oog. Store 50 ul fracties bij -20 ° C. </li></ol> 2. Gene silencing in HeLa cellen Met het oog op onderzoek naar de bijdrage van een bepaald eiwit aan ER Ca 2 + efflux, de respectieve-gen op een efficiënte wijze tot zwijgen worden gebracht met twee verschillende siRNA's (afb. 1). Daarnaast is het effect van zwijgen moet worden overwonnen door expressie van de respectievelijke wild type gen. Normaal gesproken gebruiken we siRNA's die gericht zijn tegen de codering en de niet-coderende (UTR) regio, respectievelijk van het gen van belang. Gebruikmakend van UTR-gericht siRNA is een handige manier voor complementatie. <ol><li> Zaad 5,2 x 10 5 HeLa-cellen (ATCC Nr. CCL-2) in een 6 cm cultuur schotel met een 25 mm dekglas (vooraf behandeld met 200 ul van poly-L-lysine (1 mg / ml) gedurende 1 uur) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving met 5% CO 2 (uiteindelijke volume 3,9 ml). </li><li> Transfecteren de cellen met SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, of een negatieve controle met behulp van siRNA HiPerFect Reagens volgens de instructies van de fabrikant (uiteindelijke concentratie van siRNA: 20 nM). In het kort, vers bereiden siRNA's in een aparte microcentrifugebuis voorafgaand aan de feitelijke transfectie procedure: Voeg 20 pl HiPerFect transfectiereagens tot 4 ui van elk siRNA (20 pM), dat wordt opgelost in 80 pl OptiMEM. Deze mix is ​​voorzichtig gevortext en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg de siRNA mix (104 ul) druppelsgewijs aan de gezaaid 5,2 x 10 5 HeLa cellen (3,9 ml). </li><li> Na 24 uur, wijzigt u het medium (3,9 ml) en transfecteren de cellen voor een tweede keer met dezelfde siRNA mix (104 ul). </li><li> Evalueer zwijgen op te leggen door Western blot-analyse. Het moet hoger zijn dan 80%. Was cellen van de celkweek schotel in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en oogsten ze in DMEM. Tellen van de cellen door het gebruik van de gravin Automated Cell Counter. Lyseren van de cellen in cel lysis buffer (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40), aangevuld met een protease-remmer cocktail (3 ug / ml pepstatine A, 3 ng / ml Leupeptin, 3 ug / ml Antipain, 3 ug / ml Chymastatin) en meng met SDS-sample buffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercapto-ethanol, 0,01% broomfenolblauw ) tot een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen / ul te verkrijgen. Warmte monsters bij 56 ° C gedurende 15 minuten en vervolgens, voeg wat glas kralen en vortex gedurende 20 min om fragment DNA. Aparte 20 ul van elk monster door een Laemmli-type SDS-PAGE (meestal 15% polyacrylamid voor het scheiden van gel). Overdracht gescheiden eiwitten op een PVDF-membraan door electroblotting ("nat-blot") bij constante 400 mA gedurende 3 uur of 's nachts in transfer buffer (100 mM glycine, 12,5 mM Tris-HCl). Daarna blok met 5% (w / v) magere melkpoeder in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens bloot de blot aan het primaire antilichaam gericht tegen de C-terminus van Sec61α van konijn en een anti-β-actine- antilichaam van de muis. Was de vlek in PBS-TritonX-100 (0,05%) en tWICE in PBS gedurende 5 minuten, respectievelijk. Visualiseer de primaire antilichamen met behulp van ECL Plex geit-anti-konijn IgG-Cy5-of ECL Plex geit-anti-muis IgG-Cy3-conjugaat en de Typhoon-Trio imaging-systeem in combinatie met de Image Quant TL-software 7.0. In het geval van de SEC61A1 gen, is het maximale effect zwijgen typisch gezien 96 uur na de eerste transfectie. Een representatief experiment is weergegeven in Fig. 2. </li></ol> 3. Invulling van HeLa-cellen Met het oog op het fenotype van SEC61A1 zwijgen te redden, was de SEC61A1 cDNA ingevoegd in de multiple cloning site (MCS) van een pcDNA3-interne ribosomale entry site (IRES)-GFP-vector die het cytomegalovirus (CMV) promotor, de MCS bevatte, het IRES, plus de groene fluoresecent eiwit (GFP) coderende sequentie. <ol><li> 48 uur na de eerste siRNA transfectie, wisselen de medium (3,9 ml) voor een tweede keer en transformeren van de cellen met een lege vector-of SEC61A1 expressieplasmide met behulp van Fugene HD volgens protocol van de fabrikant (laatste verhouding van de vector te Fugene HD is 4 microgram vector tot en met 16 ul Fugene HD). In het kort, vers bereiden plasmiden in een aparte microcentrifugebuis voorafgaand aan de transformatie procedure: Voeg 16 pl Fugene HD transformatie reagens tot 4 ug van elk plasmide dat wordt opgelost in 80 pl OptiMEM. Voorzichtig vortex deze mix en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg de plasmide mix (0,1 ml) druppelsgewijs aan de gezaaid 5,2 x 10 5 HeLa cellen (3,9 ml). </li><li> Na 48 uur van plasmide expressie, onder voorbehoud van cultuur gerechten fluorescentie microscopie voorafgaand aan calcium beeldvorming en oogsten. Indien nodig vervang DMEM door PBS voor een betere fluorescentie signalen. Opnemen fluorescentie beelden op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gekoelde CCD-camera. Transformatie-efficiëntie kan worden bepaald door het aantal cellen weergeven van GFP-fluorescentie door de cellen geteld in de helderveld modus en moet hoger zijn dan 80%. Een typisch resultaat is weergegeven in Fig. 3. </li></ol> 4. Live-cell imaging calcium <ol><li> Voorafgaand aan de meting, overdracht van de dekglas bedekt met getransfecteerde HeLa-cellen in een aparte 3,5 cm cultuur schotel. Laad de cellen met 4 uM Fura-2 in 1 ml DMEM AM gedurende 45 min bij 25 ° C in het donker 11,12. </li><li> Fix een 25 mm dekglas in de iMic metalen kamer en tweemaal wassen cellen en incuberen in een calcium-vrije buffer (telkens 300 ul). </li><li> Beginnen met het verzamelen van gegevens over een iMic microscoop met polychrome V door afwisselend spannend bij 340 nm en 380 nm en het meten van de geëmitteerde fluorescentie bij 510 nm (Filter set: beamsplitter, 565 nm; emitter, 605/70 nm). Sample afbeeldingen met 20-50 cellen / frame om de 3 s. Record Fura-2-signalen als de verhoudingen F340/F380, waar de F340 en F380 naar de achtergrond-gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit overeen bij 340 en 380 nm respectievelijk. </li><li> Na 1 min, de behandeling van cellen met puromycine (500 uM) in calcium-vrije buffer of met dezelfde buffer. Als alternatief, te behandelen cellen met een klein molecuul-remmer (zoals 10 uM trifluoperazine of 100 uM ophibolin A) of met de calcium-vrije buffer. </li><li> Na ratiometrische metingen worden uitgevoerd van 2 tot 10 minuten, voeg thapsigargin (1 uM) en doorgaan met de metingen. </li><li> Uiteindelijk, cytoslic [Ca 2 +] wordt geschat op basis van verhouding tussen de metingen door een gevestigde kalibreringsmethode. 2 Analyseer gegevens door Excel 2007 en Origin 6.1. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Tot nu toe hebben we de vraag of monddood maken van de SEC61A1 gen van invloed op calcium (Ca 2 +) lekkage van de ER (afb. 1). De SEC61A1-gen werd het zwijgen opgelegd door twee verschillende siRNA's in HeLa cellen voor 96 uur. Terwijl zwijgen op te leggen nauwelijks beïnvloed celgroei en levensvatbaarheid, eiwit transport in de ER van semi-gepermeabiliseerde cellen werd bijna volledig geremd. Bovendien werden de SEC61A1 zwijgen cellen ernstig getroffen met betrekking tot de Ca 2 + lekkage van de ER. Het effect van gene silencing werd teruggedraaid door expressie van het gen SEC61A1. Zo Sec61 complexen die aanwezig zijn in het ER membraan van alle cellen met een kern vormen Ca 2 + lekkage kanalen dat kan worden verwacht dat zij een cruciale rol spelen in Ca 2 + homeostase. Echter, de aanwezigheid van grote, met water gevulde poriën met ongecontroleerde ion permeabiliteit, zoals gevormd door Sec61 complexen in het ER membraan, zou ernstig interfereren met de gereguleerde afgifte van Ca 2 + uit het ER lumen in het cytosol, een essentieel mechanisme voor de intracellulaire signalering. We identificeerden een calmodulin (CAM) binding motief in de cytosolische N-terminus van zoogdieren Sec61α die gebonden CaM maar niet Ca 2 +-vrij apocalmodulin met nanomolaire affiniteit en specificiteit volgorde. Op cellulair niveau, twee verschillende CaM antagonisten gestimuleerd Ca (afb. 4 en 5). Dit laatste werd niet waargenomen toen Sec61 kanalen aanwezig waren, dat die mutaties in de IQ motief van Sec61α. Zo, Ca 2 +-CaM is betrokken bij het ​​beperken van Ca 2 + lekkage van de ER (Fig. 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomschema. Zie tekst voor details. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Data-analyse voor het zwijgen efficiency. Zwijgen op te leggen werd geëvalueerd door Western-blot analyse met behulp van antilichamen die zijn gericht tegen Sec61α en β-actine (het laden van controle). De primaire antilichamen werden gevisualiseerd met behulp van ECL Plex secundaire antilichamen en fluorescentie beeldvorming. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Data-analyse voor transfectie-efficiëntie. Beelden werden opgenomen op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een gekoelde CCD-camera. Transformatie-efficiëntie kan worden bepaald door het aantal cellen weergeven van GFP-fluorescentie door de cellen geteld in de helderveld-modus. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Screen shots van live-cell imaging van calcium HeLa cellen in de aanwezigheid van controle-of SEC61A1-siRNA en de aanwezigheid of afwezigheid van de CAM-antagonist ophiobolin A. HeLa cellen werden behandeld met siRNA gericht tegen SEC61A1 (B) of een negatieve controle siRNA (A) voor 96 uur zoals aangegeven. Deze cellen werden geladen met de calcium-indicator Fura-2 AM en geïncubeerd in een Ca 2 + gratis buffer met 0.5 mM EGTA, dan buffer of ophiobolin A (Ophio A) in buffer werd toegevoegd en de incubatie hervat. Na 10 min, Ca 2 + release werd geïnitieerd door het toepassen van thapsigargin (TG) in de afwezigheid van externe Ca 2 + en de incubatie werd voortgezet. Screen shots van de continue calcium imaging werden genomen op de aangegeven tijden. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Data-analyse voor live-cell imaging calcium experimenten. (A) Kinetic en kwantitatieve analyse van een serie experimenten zoals weergegeven in Fig. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] werd geschat op basis van metingen door de verhouding tussen een gevestigde calibratie methode 2. Het effect van thapsigargin wordt weergegeven als staafdiagram. (BD) Cellen werden behandeld met controle siRNA of de aangegeven SEC61A1-siRNA gedurende 48 uur en daarna getransformeerd met een vector-controle (C), of SEC61A1 expressie plasmide (C), of mutant SEC61A1 expressie plasmide (D) zoals aangegeven. Na 48 uur werden calcium imaging experimenten uitgevoerd als in fig. 4 en 5A. Statistische analyse van de veranderingen in de cytosolische Ca 2 +-concentratie na de toevoeging van thapsigargin in experimenten zoals gepresenteerd in A worden weergegeven. P-waarden &lt;0,001 werden gedefinieerd als significant door de ongepaarde t-test en worden aangeduid door drie sterretjes (***), ns, niet significant. Het aantal cellen die werden geanalyseerd worden aangegeven. De gemiddelde waarden worden gegeven, error bars geven standaard fouten van de middelen (sem). Wij merken op dat deze voorbeelden zijn overgenomen van ref. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Deze gegevens blijkt dat de afgifte van ontluikende ketens van het Sec61 complex inderdaad leidt tot calcium vrijlating uit de ER en de vorming van een calcium nanodomain rond de cytosolische monding van de Sec61 complex. Dit calcium is gebonden aan calmodulin en calcium-calmodulin sluit de Sec61 complex. "

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+physiological+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li>
<li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li>
<li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li>
<li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2%2B+leak+from+the+endoplasmic+reticulum%3A+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li>
<li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch.+Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li>
<li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocon+closure+to+Ca2%2B+leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li>
<li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilins+form+ER+Ca2%2B+leak+channels%2C+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li>
<li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li>
<li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li>
<li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Ca2%2B+signalling+by+Na%2B%2FCa2%2B+exchangers+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li>
<li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPC5+is+a+Ca2%2B-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2%2B-selective+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li>
<li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li>
</ol>

In zoogdiercellen, het endoplasmatisch reticulum (ER) speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese als in calcium signalering. Hier hebben we beschreven een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om direct het adres van de rol van een potentiële Ca 2 + lekken kanaal en haar vermeende regulerende mechanismen 13 te karakteriseren. Deze experimentele systeem geeft ons de unieke mogelijkheid om i) evaluatie van de bijdrage van verschillende ER membraaneiwitten om passieve Ca 2 + efflux van de ER in verschillende celtypes, ii) het karakteriseren van de eiwitten en mechanismen die deze passieve Ca 2 + efflux te beperken, en iii) onderzoek naar de effecten van de ziekte gelinkt mutaties in de relevante componenten. We merken op dat alleen levensvatbare cellen moeten worden geanalyseerd en dat de algehele levensvatbaarheid moet hoger zijn dan 80%. Daarom wordt levensvatbaarheid van de cellen regelmatig geëvalueerd in dienst Nucleaire-ID blauw / groen levensvatbaarheid van de cellen reagens volgens protocol van de fabrikant. Bovendien, statistische analyse van de veranderingen in de cytosolische Ca 2 + concentratie is verplicht. Daarom is de experimenten moeten worden uitgevoerd voor vier verschillende batches van cellen en twee dekglaasjes met ten minste 20 cellen moeten worden geanalyseerd voor elke aandoening in een enkel experiment. We merken dat de verschillende experimenten worden uitgevoerd op hetzelfde moment na het zaaien op de cover glijdt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> DMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nucleaire-ID Blauw / Groen levensvatbaarheid van de cellen reagens </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin A </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazine </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Countess ® Geautomatiseerde Cell Counter </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio imaging-systeem </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S microscoop met DS-5Mc camera </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> iMic microscoop met polychroom V </td><td> Till Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell calcium imaging gecombineerd met sirna gemedieerde gen-silencing identificeert ca 2 + lek kanalen in het er membraan en de regulerende mechanismen

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In zoogdiercellen, het endoplasmatisch reticulum (ER) speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese als in calcium signalering 1. De heterotrimere Sec61 complex in het ER membraan biedt een waterige pad voor nieuw-gesynthetiseerde Polypeptiden in het lumen van het ER. Recent werk van verschillende laboratoria gesuggereerd dat dit heterotrimere complex kan ook van voorbijgaande aard Ca 2 + lekkage kanalen 2-8 te vormen. De belangrijkste waarneming voor dit idee was dat het vrijkomen van ontluikende Polypeptiden van het ribosoom en Sec61 complex door puromycine leidt tot een tijdelijke vrijstelling van Ca 2 + uit het ER. Bovendien was het in vitro waargenomen dat de ER luminale proteïne BiP is betrokken bij het ​​voorkomen van ion permeabiliteit op het niveau van de Sec61 complex 9,10. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om direct op de rol van de Sec61 complex als potentiële Ca 2 + lekken kanaal en te karakteriseren zijn vermeende regulerende mechanismen 11-13. Dit systeem combineert siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca 2 + 13. Cellen worden behandeld met siRNA&#39;s die gericht zijn tegen de codering en onvertaalde gebied (UTR), respectievelijk van de SEC61A1 gen of een negatieve controle siRNA. In aanvulling analyse worden de cellen co-getransfecteerd met een IRES-GFP vector die de siRNA-resistente expressie van het wild-type SEC61A1 gen maakt. Dan is de cellen worden geladen met de ratiometrische Ca 2 +-indicator Fura-2 om gelijktijdig veranderingen in de cytosolische Ca 2 + concentratie in een aantal cellen door middel van een fluorescentie microscoop monitor. De continue meting van cytosolische Ca 2 + maakt het ook mogelijk de evaluatie van de impact van verschillende middelen, zoals puromycine, kleine molecule inhibitoren, en thapsigargin op Ca 2 + lekkage. Deze experimentele systeem geeft ons de unieke mogelijkheid om i) evaluatie van de bijdrage van verschillende ER membraaneiwitten om passieve Ca 2 + efflux van de ER in verschillende celtypes, ii) het karakteriseren van de eiwitten en mechanismen die deze passieve Ca 2 + efflux te beperken, en iii) onderzoek naar de effecten van de ziekte gelinkt mutaties in de relevante componenten.

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

In zoogdiercellen speelt het endoplasmatisch reticulum (ER) een sleutelrol bij de eiwitbiogenese evenals bij calciumsignalering1. Het heterotrimere Sec61 ...

In zoogdiercellen speelt het endoplasmatisch reticulum of ER een belangrijke rol bij de eiwitbiogenese en calciumsignalering. Het heterotrimere Sec61-complex in het ER-membraan biedt een waterig pad voor nieuw gesynthetiseerde polypeptiden naar het lumen van het ER. Recente gegevens suggereren dat Sec61 mogelijk ook tijdelijke calciumlekkagekanalen vormt; om de rol van het Sec61-complex als potentieel calciumlekkagekanaal direct te onderzoeken.En om de vermeende regulatiemechanismen te karakteriseren, worden de cellen eerst behandeld met siRNA's gericht tegen het sex 61 A one-gen. In een complementatieanalyse worden de cellen gecotransfecteerd met een iris GFP-vector die de irna-resistente expressie van het wildtype sex 61 A one-gen mogelijk maakt. Vervolgens worden de cellen geladen met de ratiometrische calciumindicator RO two en worden veranderingen in de cytosolische calciumconcentratie gemonitord via fluorescentiemicroscopie.Terwijl de calciumwaarden worden gemeten, worden wijzigingen in de oplossing aangebracht om de impact van diverse agentia, zoals calmodulinumantagonisten en fabs argon, op calciumlekkage te beoordelen. Kwantitatieve analyse van de resulterende beelden onthult veranderingen in de calcium F-flux geïnduceerd door het uitschakelen van sex 61 A one. In deze video zal, na demonstratie van de procedure en presentatie van de resultaten, een model worden gepresenteerd voor de rol van sex 61 A one in de calcium F-flux.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals experimenten met planaire lipidemembranen of metingen via één enkel kanaal, is dat kandidaat-membraaneiwitten in hun natuurlijke omgeving kunnen worden geanalyseerd, zonder tijdrovende zuivering en doorgaans inefficiënte functionele reconstitutie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van calciumsignalering, zoals bijvoorbeeld: wat is de bijdrage van specifieke ER-membraaneiwitten aan de calciumflux vanuit het ER in verschillende celtypen en hoe worden deze gereguleerd? Om de procedure te demonstreren, zullen twee getalenteerde promovendi uit onze laboratoria deze procedure uitvoeren. Begin deze procedure met het bereiden van de te gebruiken oplossingen en reagentia. Bereid eerst een calciumvrije buffer volgens de instructies in het bijbehorende schriftelijke protocol.Verdun vervolgens een voorraadoplossing van de calciumindicator. Verdun deze tot een eindconcentratie van 4 µM in één milliliter DMEM met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Verdun een 1 mM Apso Garin-voorraadoplossing in een calciumvrije buffer tot een eindconcentratie van 3 µM. Houd daarnaast 200 µM oleïne A en 20 µM bij de hand om het risico op off-target effecten van een specifieke siRNA te verminderen. Om mogelijke bijwerkingen van de transfectieprocedure te beoordelen, worden twee verschillende siRNA's gebruikt om elk gen tot zwijgen te brengen.Negatieve controle-siRNA's, die bestaan uit een willekeurige nucleotidevolgorde, worden parallel met de experimentele siRNA's getransfecteerd. Het is belangrijk dat het effect van siRNA-gemedieerde silencing kan worden hersteld door expressie van wild-type cDNA. Daarom worden de voor het experiment gebruikte siRNA's specifiek geselecteerd, zodat het rescue-plasmide niet wordt beïnvloed door de siRNA's. In dit experiment zijn de siRNA's gericht tegen zowel de coderende als de niet-coderende regio of het onvertaalde gebied, afgekort UTR, van het gen van belang.Wanneer siRNAs gericht zijn tegen de UTR-rescue, kunnen plasmiden zonder de endogene UTR worden gebruikt voor transfectie in HeLa-cellen. Bereid de cellen voor op de transfectie door in elke zes centimeter cellentestschotel voor elke transfectie een met poly-L-lysine gecoat dekglas van 25 millimeter te plaatsen; voeg na één uur 5,2 × 10⁵ HeLa-cellen en gesupplementeerd DMEM toe aan elke schotel. Om de cellen te transfecteren, labelt u één microcentrifugebuisje.Voeg voor elke transfectiereactie vier µL 20 µM siRNA, opgelost in 80 µL Opti-MEM, toe aan elke buis. SEC61A1, SEC61A1 UTR en negatieve controle siRNA worden in elke buis klaargemaakt. Voeg 20 µL Hyperfect-transfectiereagens toe, vortex zachtjes en incubeer de reacties vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de cellen te transfecteren, wordt het siRNA-mengsel (in totaal 104 µL) druppelsgewijs toegevoegd aan de uitgezaaide HeLa-cellen, waarna de schaal zachtjes wordt bewogen om een uniforme distributie van de transfectiecomplexen te waarborgen.Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde omgeving met 5% koolstofdioxide. Vervang na 24 uur het medium door 3,9 milliliter vers medium. Om de transfectie-efficiëntie te verhogen, wordt de transfectie vervolgens een tweede keer uitgevoerd; gebruik dezelfde irna-mix om het silencing-effect te evalueren via western blot-analyse.De silencing moet boven de 80% liggen, zoals hier wordt getoond voor sex 61 A one. Het maximale silencing-effect is doorgaans waarneembaar 96 uur na de eerste transfectie, 48 uur na de eerste transfectie voorbereid om het fenotype resulterend uit sex 61 silencing te redden. Begin met het labelen van een nieuwe microcentrifugebuis.Voor elke reactie worden de cellen nu getransfecteerd met ofwel een lege vector ofwel een wild-type sex. 61 A one expressieplasmide. Het hier gebruikte wild-type expressieplasmide werd gegenereerd door sex 61 A one cDNA in de multiple cloning site van een pcd in te voegen.Een GFP-vector met drie interne ribosomale entry-sites, bestaande uit de cytomegalovirus-promoter, de iris en de coderende sequentie voor het groen fluorescerend eiwit. Bereid het transfectiereagens voor door vier microgram van elk plasmide, opgelost in 80 µL optimum, aan elke buis toe te voegen. Voeg vervolgens 16 µL FUgene HD transfectiereagens toe, vortex deze oplossing voorzichtig en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.Vervang vervolgens het medium en voeg het plasmidmengsel druppelsgewijs toe aan de uitgezaaide 5,2 × 10⁵ HeLa-cellen. Draai de schaal voorzichtig rond om een uniforme distributie van de transfectiecomplexen te waarborgen. Plaats de cellen bij 37 °C en 5% CO2 en incubeer deze nog eens 48 uur. Om de transfectie-efficiëntie te bepalen, wordt de GFP-expressie geëvalueerd via fluorescentiemicroscopie.Na 48 uur moet ten minste 80% van de cellen zijn getransfecteerd. Gebruik vóór het beeldvormen een pincet om de dekglasjes met de getransfecteerde HeLa-cellen over te brengen naar een nieuwe cellendeskpetrischaal van 3,5 centimeter en voeg één milliliter DMEM met vier micromolar toe.Incubeer gedurende 45 minuten bij 25 °C in het donker. Voor het uitvoeren van de beeldvorming brengt u het dekglas met minimaal twee beladen cellen over naar een metalen registratiekamer en zet u dit vast door de twee delen van de kamer op elkaar te schroeven. Gebruik een pipet om 300 µL calciumvrije buffer bij de cellen toe te voegen en weer te verwijderen om ze te wassen.Herhaal dit en monteer de registratiekamer op een I MIC-microscoop met een polychrome five cremator. Gebruik een filterset voor URA twee om een veld met ten minste 20 cellen te vinden, om zo de calciumonafhankelijke fluorescentie van FU A twee te schatten. De excitatiegolflengte die in deze stap wordt gebruikt is 360 nanometers.Zodra er een geschikt gezichtsveld is geselecteerd, wordt de imaging-software zo ingesteld dat er excitatie plaatsvindt bij 340 nanometer en 380 nanometer en dat de geëmitteerde fluorescentie elke drie seconden bij 510 nanometer wordt gemeten; stel de belichtingstijd zo in dat er fluorescentie-intensiteiten van rond de 1000 arbitrary units worden geproduceerd voor de hier getoonde opstelling. Er is een belichtingstijd van vijf milliseconden ingesteld. Markeer daarnaast de regions of interest of ROI's voor een celvrij achtergrondgebied en tot 20 celcontouren.Start de levende cel-imaging terwijl het experiment loopt; het systeem zal de ratiometrische beelden voor ten minste twee signalen presenteren, evenals de real-time F340/F380-ratio's voor elke gemarkeerde ROI als een lijngrafiek, waarbij F340 en F380 respectievelijk overeenkomen met de fluorescentie-intensiteit binnen de ROI's bij 340 en 380 nanometer. Voeg na één minuut testoplossingen toe aan de imagingkamer om verschillende experimentele parameters te testen. In deze experimenten worden de Calmoduline-antagonist, trifluorine en bollin A getest nadat er gedurende nog eens 10 minuten ratiometrische metingen zijn uitgevoerd.Voeg voor CAL modulaire antagonisten DSA gargan toe en ga verder met de metingen. Leg per experiment 400 gepaarde beelden vast. Zodra de beelden zijn verzameld, worden deze beoordeeld en worden de ROI's voor ten minste 20 cellen per gezichtsveld gemarkeerd.Gebruik vervolgens de optie voor kinetische analyse in de software om een reeks ratio-afbeeldingen te maken waarbij de achtergrond is afgetrokken, en een grafiek die de kinetiek van de calciumratio na achtergrondcorrectie weergeeft. Exporteer ten slotte voor elke ROI de gegevens naar Excel en Origin met behulp van een gevestigde kalibratiemethode. De cytosol calciumconcentratie kan worden berekend op basis van de ratio-metingen om te onderzoeken of het sex 61 A one-gen de calciumlekkage uit het ER beïnvloedt.Het Sox61A1-gen werd gesilenced met twee verschillende RNA's in HeLa-cellen gedurende 96 uur. De silencing werd geëvalueerd via Western blot-analyse van gelijke celaantallen in triplicaat; zoals hier getoond is er een sterk Sox61$\alpha$-signaal in banen één tot en met drie en een significant zwakker signaal in banen vier tot en met zes en zeven tot en met negen, die overeenkomen met de Sox61A1-gesilenced cellen. Om de resultaten te kwantificeren, werden de Sox61$\alpha$-signalen genormaliseerd ten opzichte van de $\beta$-actine-signalen; er werd een silencing van meer dan 80% bereikt om de rol van calmoduline in de ER calciumflux te testen.URA-beeldvorming van sex 61 A one sir A-behandelde helo-cellen werd uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van de Cal Modin-antagonist Bollin A. Deze film toont controlecellen die behandeld zijn met bollin a; 10 minuten na de behandeling met bollin A werd calciumvrijgave geïnitieerd door het toevoegen van FSO Gargan, een circa-remmer die calciumvrijgave uit het ER ontsluit in de afwezigheid van extern calcium, zoals hier te zien is.De toevoeging van FSA argon leidde tot een kortstondige maar significante toename van de fluorescentie, wat duidt op een calcium F-flux vanuit het ER. In contrast hiermee is de calcium F-flux na de toevoeging van FSO garin in PHE-bot, A-behandelde sex 61 A one silent-cellen veel minder uitgesproken, zoals hier te zien is. Dit verschil is duidelijk zichtbaar in dit diagram, dat de geschatte cytosolische calciumconcentratie in de tijd over een reeks films toont; de hier getoonde kwantitatieve resultaten bevestigen de verhoogde calciumflux in controlecellen als reactie op thic argon in aanwezigheid van offi bolin A, zoals te zien is in dit staafdiagram.Hetzelfde fenomeen werd waargenomen voor een tweede cam-antagonist triazine. De effecten van de cam-antagonisten waren echter niet zichtbaar wanneer het sex 61-complex uit de cellen werd gedepleteerd door gebruik van een van de twee sex. 61 A one specifieke siRNA's. Een gedeeltelijk herstel van dit fenotype is waarneembaar wanneer sex 61 A one-silent cellen werden getransfecteerd met sex.een expressieplasmide voor Sec61α, zoals hier te zien is. De calciumflux als reactie op Calmodulin-agonisten wordt gedeeltelijk hersteld door transfectie met het siRNA-ongevoelige wildtype-plasmide. Deze resultaten suggereren dat Calmodulin betrokken is bij het beperken van de ER-calciumflux op het niveau van het Sec61-complex in cellen.Indien dit het geval is, zou transfectie van Sec61$\alpha$1-genen met een dubbele mutatie in de Calmoduline-bindingsplaats het door irna geïnduceerde fenotype niet moeten herstellen. Inderdaad, wanneer cellen werden getransfecteerd met een Sec61$\alpha$1-expressieplasmide met een dubbele mutatie in het IQ-motief, was er geen herstel van het fenotype in suo. Deze gegevens geven aan dat de vrijgave van nascente ketens uit het Sec61-complex inderdaad leidt tot calciumvrijgave uit het ER en de vorming van een calcium-nanodomein rond de cytosolische opening van het Sec61-complex.Dit calcium wordt gebonden door Calmodulin en calcium Calmodulin sluit het complex. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u siRNA-gemedieerde gene silencing in menselijke cellen kunt combineren met live-cell calcium imaging door deze procedure te volgen. Andere methoden, zoals de expressie van cDNA's met ziekte-gerelateerde mutaties, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de potentiële impact van ziekte-gerelateerde mutaties in relevante componenten.En vergeet niet dat het werken met geneesmiddelen zoals tap, nogmaals, extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van handschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

live-cell-calcium-imaging-combined-with-sirna-mediated-gene-silencing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit...

Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)

Hier presenteren we technieken voor het beeldvormen van lokale IP3-gemedieerde Ca2+-gebeurtenissen met behulp van fluorescentiemicroscopie in intacte zoogdiercellen die zijn geladen met Ca2+-indicatoren, samen met een algoritme dat de identificatie en analyse van deze gebeurtenissen automatiseert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signalen in gekweekte zoogdiercellen

Calciumhomeostase van het endoplasmatisch reticulum is verstoord bij verschillende pathologieën. Een uitgescheiden ER calcium-monitoring-eiwit (SERCaMP) reporter kan worden gebruikt om verstoringen in de ER calciumopslag te detecteren. Dit protocol beschrijft het gebruik van een Gaussia luciferase SERCaMP om ER calciumhomeostase in vitro en in vivo te onderzoeken.

Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER + voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K d meting en kalibratie wordt ook besproken.

Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor CatchER<sup&gt; +</sup

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Dit protocol beschrijft een aanpak voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming in met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïden en biedt een benadering voor analyse.

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Dit artikel presenteert een methode voor real-time, kwantitatieve monitoring van calciumionconcentraties (Ca2+) in cellen met behulp van eencellige Ca2+ beeldvorming met de Fura-2/AM-kleurstof. Deze techniek maakt het mogelijk om de kleurstof efficiënt te laden en de Ca2+ -niveaus nauwkeurig te berekenen door middel van fluorescentie-intensiteitsverhoudingen, waardoor het een eenvoudige en snelle aanpak is voor onderzoekstoepassingen.

Eencellige calciumbeeldvorming voor het bestuderen van de activering van calciumionkanalen

Ontdek hoe siRNA-gemedieerde gen-silencing en live-cell calcium imaging Ca²⁺-lekkanalen in het ER-membraan identificeren. Deze methode onthult regulerende mechanismen van SEC61A1 in calciumsignalering.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen (Video) | JoVE Journal

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca^{2 +} Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

Meer video's verkennen