High-throughput screening 'en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Deze video demonstreert een methode om fluorescerende stammen van C. elegans te kweken en te dispenseren voor high-throughput screening van chemische bibliotheken of detectie van milieuverontreinigingen om het effect van chemische of milieufactoren op specifieke eiwitactiviteit te beoordelen. In C. elegans worden eerst bacteriële culturen voorbereid als voedsel voor de wormen en worden GFP-transgene, gesynchroniseerde wormen gekweekt.

Vervolgens worden 0,5 tot 2 miljoen wormen verzameld, gewassen en verdeeld over 3 microtiterplaten met 84 putjes, waarna kleine moleculen uit een chemische bibliotheek of testmonsters zoals water, voedsel of bodem aan de wormen worden toegevoegd. Ten slotte wordt de fluorescentie van de wormen gemeten met een microplatelezer.

Data-analyse van fluorescentie-intensiteiten onthult kleine moleculen die induceerbare transcriptionele paden moduleren of die de detectie van milieuverontreinigingen mogelijk maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro assays en assays op basis van celculturen, is dat er geen tijd wordt verspild aan verbindingen die in vivo toxisch of inactief zijn. Deze high-throughput methode kan helpen bij het identificeren van kleine moleculen die diverse induceerbare paden moduleren.

Hoewel we deze methode hebben ontwikkeld voor high-throughput screening van bibliotheken met kleine moleculen, kan deze ook worden toegepast voor biosensing van verontreinigingen in voedingsmiddelen en milieu-monsters. De procedure zal worden gedemonstreerd door Andrew Dine, een technicus in mijn laboratorium, en Q long, een postdoc in mijn laboratorium. Bereid het bacteriële wormvoedsel vooraf voor.

Begin met het inoculeren van 500 milliliters terrific broth, aangevuld met 50 micrograms per milliliter streptomycine, met vijf milliliters verzadigde e coli. OP 50. Plaats de cultuur op een schudmachine en laat deze gedurende de nacht groeien bij 37 degrees Celsius.

Verdeel de cultuur de volgende dag over 10 buisjes van 50 milliliter. Plaats de buisjes vervolgens in een gekoelde centrifuge en centrifugeer 20 minuten bij 2 500 RCF. Resuspendeer na het centrifugeren elk bacterieel pellet in 10 milliliter vloeibaar nematode-groeimedium of NGM.

Schud de suspensies horizontaal. Gebruik een schudplatform voor 15 minuten om de bacteriën opnieuw te suspenderen. Centrifugeer vervolgens de bacteriële cultuur bij 2.500 RCF bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Giet het NGM af en weeg het bacteriële pellet. Voeg vervolgens een gelijk volume NGM-buffer toe en resuspendeer de pellets door middel van vortexen. Verdeel tot slot drie milliliter van de geresuspendeerde bacteriecultuur over 15 milliliter buisjes en bewaar deze bij minus 20 degrees Celsius tot ze nodig zijn.

In deze demonstratie wordt het effect van de stress-inducerende Xeno Duke-lening op de transcriptiefactor Sskn one gemeten als voorbeeld. Sskn one staat erom bekend cytoprotectieve genen te activeren tijdens oxidatieve stress en xenobi-stress. Er wordt een grootschalige cultuur voorbereid van de Trenchgenic c gans-lijn VP 5 96, die twee fluorescente constructen bevat.

VP 5 96 wormen brengen zowel de GST four-promotor tot expressie die GFP aanstuurt, wat wordt gebruikt om de activiteit van de transcriptiefactor te monitoren, als de Sskn one en de DOP three-promotor die RFP aanstuurt; dit dient als standaard voor de normalisatie van het aantal wormen.

DOP drie is de promoter voor een dopamine-receptor en wordt constitutief tot expressie gebracht in neuronen in het gehele lichaam. In het voorbeeld, aangezien het xenobioceut sskn één sterk activeert en de hoeveelheid GFP die vanuit de GS T vier-promoter wordt tot expressie gebracht verhoogt, bereidt u de culturen voor door 150 milliliters N NGM-buffer, 1,5 milliliters LB, 150 microliters 1 molar cholesterol en 75 microliters 100 milligram per milliliter streptomycine te combineren. Het toevoegen van LB helpt te voorkomen dat de wormen aan het glaswerk en plasticware kleven, maar deze hoeveelheid is onvoldoende om bacteriële groei te ondersteunen.

Filter het mengsel om het te steriliseren, breng het vervolgens over naar een steriele kolf van één liter en zet de kolf apart om de eieren uit de volwassen GR-wormen te laten komen. Was de bacteriën van de wormen door ze te centrifugeren en het NGM-medium te vervangen tot het supernatant helder is. Was de wormen een tweede keer door ze te resuspenderen in steriel water en na het centrifugeren opnieuw te centrifugeren.

Verwijder het supernatant en vul de buis met 3,75 milliliters steriel water. Voeg één milliliter huishoudbleekmiddel en 250 microliters 10 normaal natriumhydroxide toe en meng dit onmiddellijk door de buis vijf tot zes keer om te keren. Plaats de buis in een rotator nadat de wormen gedurende vier minuten aan het bleekmiddel zijn blootgesteld.

Plaats de buis onder een stereomicroscoop. De meeste volwassenen moeten zijn gelyseerd. Schud de buis krachtig 15 tot 20 keer om te helpen bij het lyseren van eventuele resterende volwassen wormen. Nadat de lysis in totaal vijf minuten heeft geduurd, voegt u steriel water toe tot de buis vol is.

Meng door vijf tot zes keer om te keren om de eieren te verzamelen. Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 500 RCF. Was de eieren drie keer door resuspendering in 10 milliliters steriel water, gevolgd door centrifugeren en het verwijderen van het supernatant.

Verduun vervolgens een monster van 100 µL eieren 100 maal door 10 mL NGM-buffer toe te voegen. Pipetteer daarna drie aliquoten van 5 µL op het deksel van een Petrischaal onder een microscoop. Tel het aantal eieren in drie afzonderlijke aliquoten van 5 µL.

Om het totaal aantal eieren te schatten: voeg 200.000 tot 2 miljoen eieren toe aan de kolf met NGM-buffer en schud de cultuur bij 100 RPM bij 20 °C. Minstens 16 uur nadat de eieren aan de kolf zijn toegevoegd, wordt een steriele serologische pipette gebruikt om ongeveer 0,5 milliliters van de gesuspendeerde wormencultuur te verwijderen.

Pipetteer drie druppels van 5 µL op het steriele deksel van een Petrischaal. Plaats het deksel gedurende één tot twee minuten in een vriezer van -20 °C om de wormen te verlammen. Tel, zodra de wormen verlamd zijn, met een stereomicroscoop het gemiddeld aantal levende uitgekomen wormen per 5 µL om het totaal aantal te schatten.

Ontdooi de eerder bereide bevroren OP 50 bacteriële cultuur door deze enkele minuten op het labtafel te plaatsen. Voeg vervolgens drie milliliters van 50% OP 50 toe per 500.000 uitgebroede wormen. Schud de kolf met 100 RPM bij 20 °C.

De wormen zullen in ongeveer 51 uur uitgroeien tot L4-larven en jonge volwassen stadia. Controleer de hoeveelheid bacteriën gedurende de incubatie via visuele inspectie. Voeg meer bacteriën toe als het medium helder wordt.

Gebruik een steriele serologische pipet om ongeveer 0,5 milliliters van de gesuspendeerde wormcultuur over te brengen naar een standaard NGM-agarplaat. Bekijk de wormen met een stereomicroscoop om te controleren of de meeste L4-larven en jonge volwassenen zijn; bij brightfield-microscopie hebben L4-larven een heldere ventrale vlek in het midden van het lichaam. Jonge volwassenen zijn iets groter en hebben geen heldere vlek.

Trek vervolgens de wormcultuur in steriele buisjes van 50 milliliter. Plaats de buisjes in een reageerbuisrek in de zuurkast en laat niet-uitgekomen eitjes of wormen die zich niet ontwikkelen bezinken. Deze bezinken langzamer dan ontwikkelde wormen.

Verwijder na 10 minuten het supernatant, dat niet uitgekomen en onontwikkelde wormen bevat, door middel van aspiratie. Voeg ongeveer 10 milliliter NGM-buffer toe aan elk pellet en suspendeer de wormen door de buisjes voorzichtig te zwenken. Verzamel alle wormen in één enkele buis van 50 milliliter. Centrifugeer in een centrifuge met zwenkrotor bij 500 RCF gedurende 30 seconden.

Resuspendeer de wormen vervolgens in 50 milliliters NGM met 1%lb om ze te wassen. Herhaal dit proces drie tot vier keer om de bacteriën na het wassen te verwijderen. Vul de buis aan met NGM plus LB-buffer tot 50 milliliters.

Giet dit in een op maat gemaakte fles voor het dispenseren van wormen met een roerbalkje en plaats deze op een magneetroerer. Minimaal ongeveer 20 milliliters of 60.000 wormen zijn nodig om de dode ruimte in de dispenserfles en de dispensercassette te vullen. Tel het aantal wormen in drie druppels van vijf microliter zoals eerder is aangetoond.

Na het tellen op NGM plus LB tot een concentratie van 12 tot 15 wormen per druppel van vijf microliter, heeft elke 84-well plaat ongeveer 35.000 wormen of 11,5 milliliter gesuspendeerde wormen nodig. Plaats een doseercassette van 10 microliter in de dispenser en steriliseer deze door te primen met 70% ethanol. Spoel de ethanol weg door te primen met steriel water.

Plaats het uiteinde van de doseercassette in de kolf, zodanig dat deze net boven de roerstaaf bevindt zonder de beweging ervan te verstoren. Zorg ervoor dat de wormen in de gehele kolf gesuspendeerd blijven. Programmeer de dispenser om de wormen op lage snelheid te doseren met twee voorpulsen om het systeem te primen en voer ten minste 10 milliliters van de wormensuspensie uit.

Vul de microtiterplaten, die al testverbindingen moeten bevatten, snel om te voorkomen dat de wormen in de slang bezinken. Hier is de testverbinding die eerder op de microtiterplaat is geladen aan de beurt.Glow. Seal de platen met ademend plakband om te voorkomen dat er stof in de wells verzamelt.

Plaats de platen op een schudplatform in een incubator op de juiste temperatuur voor de assay. Stapel de platen niet op elkaar, omdat dit de luchtstroom kan belemmeren. Plaats de doelplaat in een microplaatlezer om de fluorescentie-intensiteit van elke put te meten met de juiste emissie- en excitatiegolflengten.

De filters die voor GFP worden gebruikt, hebben een excitatie bij 4 85 en een emissie bij 5 28. De filters voor RFP hebben een excitatie bij 5 40 en een emissie bij 5 90. Bereken na het uitlezen van de plaat de ratio van GFP ten opzichte van RFP en normaliseer deze met de metingen van de controleputjes, die geen activerende verbinding bevatten, om het exactevoudige verschil in fluorescentie-intensiteit als gevolg van de individuele behandelingen te bepalen.

De hier getoonde SSKN one-assay maakt gebruik van een chromosomaal geïntegreerde duale rapporteur-stam, waarbij de wormen handmatig werden geteld met een stereomicroscoop. Het aantal wormen correleerde met het gedispenseerde volume met een R-kwadraatwaarde van 0,94 en een p-waarde van minder dan 0,0001. Dit geeft aan dat het aantal wormen dat in elke put wordt gedispenseerd, kan worden gecontroleerd door het gedispenseerde volume aan te passen.

De totale GFP-fluorescentie per well, links afgebeeld, en de RFP-fluorescentie per well, rechts afgebeeld, zijn in deze figuren zeer reproduceerbaar tussen de wells over een 384-well plaat. XS geeft de relatieve fluorescentie aan die in elke well is gemeten. Doorgetrokken lijnen geven de gemiddelden aan en stippellijnen geven drie standaarddeviaties boven of onder het gemiddelde van de fluorescentie van alle wells aan, met een variatiecoëfficiënt van minder dan 9%. Zoals in deze figuur wordt getoond, is de GFP-fluorescentie van de GST-4 promoter lineair gecorreleerd aan de RFP-fluorescentie van de DOP-3 promoter over 384 wells, met een R-kwadraatwaarde van 0,62 en een p-waarde van minder dan 0,0001.

Daarom kan de niet-induceerbare RFP-reporter worden gebruikt om de induceerbare GFP-reporter te normaliseren. Wanneer deze tot expressie komt, wordt de verhouding tussen GFP- en RFP-fluorescentie zeer reproduceerbaar van put tot put over een 384-wells plaat.

Door de ratio van GFP ten opzichte van RFP te berekenen, werd de variatiecoëfficiënt gereduceerd tot onder de 6%, wat het vermogen van de DOP three promoter RFP-reporter aantoont om de variabiliteit te verminderen, zoals hier wordt getoond. De inductie van GFP ten opzichte van RFP met een SK N one activerend xenobioticum is robuust en zeer reproduceerbaar over een 384-wellplaat; de gemiddelde relatieve fluorescentieratio's van alle controle-wells en due GLO-wells zijn aangegeven met doorgetrokken lijnen. Drie standaarddeviaties boven het gemiddelde van de controle en onder het dlo-gemiddelde zijn aangegeven met onderbroken lijnen.

Zodra de methode onder de knie is, kan het opzetten van een wormcultuur op de eerste dag in ongeveer één uur worden voltooid, evenals het oogsten en uitdelen. Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, kan het proces met de wormen in ongeveer twee uur worden afgerond. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat men moet beginnen met ten minste 60.000 wormen en dat deze tijdens het uitdelen in suspensie moeten worden gehouden; door deze procedure te volgen, kunnen screenings met andere methoden, zoals rapportages over andere induceerbare paden, worden uitgevoerd om na de ontwikkeling modulatoren voor andere paden te ontwikkelen.

Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van high-throughput screening en biosensing om snel kleine moleculaire pathway-modulatoren te identificeren of milieuverontreinigingen te detecteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fluorescente elegan-stammen kunt kweken, dispenseren en meten voor high-throughput screening van induceerbare transcriptionele pathways of het testen van meerdere monsters op milieuverontreinigingen.