High-throughput screening 'en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen
May 19th, 2011
Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking van C. elegans Stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten is beschreven dat betekent niet duur sorteren apparatuur nodig. Deze aanpak kan worden toegepast op tal van induceerbare C. elegans Genen voor drug discovery of biosensing van verontreinigende stoffen.
Deze video toont een methode om fluorescente stammen van CL-ganzen te kweken en te verdelen voor grootschalige screening van chemische bibliotheken of detectie van milieuverontreinigingen om de effecten van chemische of milieu-agentia op specifieke eiwitactiviteit te beoordelen. Bij CL elgan worden bacterieculturen eerst bereid als voedsel voor de wormen en GFP-transgen. Gesynchroniseerde wormen worden gekweekt.
0,5 tot 2 miljoen wormen worden vervolgens verzameld, gewassen en verdeeld in 3 84-well microtiterplaten, waarna kleine moleculen uit een chemische bibliotheek of testmonsters zoals water, voedsel of bodem aan de wormen worden toegevoegd. Ten slotte wordt de fluorescentie van de wormen gemeten met een microplaatlezer.
Gegevensanalyse van fluorescentie-intensiteiten onthullen kleine moleculen die inducibele transcriptionele paden moduleren of de detectie van milieuverontreinigingen mogelijk maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro en op celcultuur gebaseerde tests, is dat er geen tijd wordt verspild aan verbindingen die toxisch of inactief zijn in vivo. Deze methode met hoge doorvoer kan helpen bij het identificeren van kleine moleculen die diverse inducibele paden moduleren.
Hoewel we deze methode ontwikkelden voor grootschalige screening van kleine molecuulbibliotheken, kan deze ook worden toegepast op biosensing van verontreinigingen in voedsel en milieumonsters. De procedure zal worden gedemonstreerd door Andrew Dine, een technicus voor mijn laboratorium en Q long, een postdoc voor mijn laboratorium. Bereid bacteriële wormvoeding van tevoren.
Begin met het inoculeren van 500 milliliters terrific bouillon, aangevuld met 50 microgram per milliliter streptomycine met vijf milliliters verzadigd e coli. OP 50. Plaats de cultuur op een shaker en kweek het overnacht bij 37 graden Celsius.
De volgende dag verdeelt u de cultuur in 10 50 milliliters buisjes. Plaats vervolgens de buisjes in een gekoelde centrifuge en centrifugeert u gedurende 20 minuten bij 2.500 RCF. Na de centrifugatie suspendeert u elk bacterieel pellet in 10 milliliters vloeibaar nematodegroeimedium of NGM.
Schud de suspensies horizontaal. Een vloerschaker gedurende 15 minuten om de bacteriën te resuspenderen. Centrifugeer vervolgens de bacteriecultuur bij 2.500 RCF bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.
Decanteer de NGM en weeg het bacteriële pellet. Voeg vervolgens een gelijk volume NGM-buffer toe en resuspendeer de pellets door te vortexen. Verdeel tenslotte drie milliliters van de resuspendeerde bacteriecultuur in 15 milliliters buisjes en bewaar ze bij minus 20 graden Celsius tot ze nodig zijn.
In deze demonstratie wordt het effect van de stress-inducerende Xeno Duke-leen op de transcriptiefactor Sskn één gemeten als voorbeeld. Sskn één is bekend om cytoprotectieve genen te activeren tijdens oxidatieve en xenobi-stress. Een grootschalige cultuur van de Trenchgenic c gans-lijn VP 5 96, die twee fluorescente constructen bevat, wordt bereid.
VP 5 96 wormen drukken zowel de GST-vier-promotor aan die GFP aanstuurt, die wordt gebruikt om de activiteit van de transcriptiefactor te monitoren. Sskn één en de DOP-drie-promotor die RFP aanstuurt, wordt gebruikt als standaard voor normalisatie van het aantal wormen.
DOP drie is de promotor voor een dopaminereceptor en wordt constitutief tot expressie gebracht in neuronen door het hele lichaam. In het voorbeeld activeert het xenobi lon sterk sskn één en verhoogt het de hoeveelheid GFP die wordt geëxpresseerd uit de GS T vier-promotor. Om culturen voor te bereiden, begint u door 150 milliliters N NGM-buffer, 1,5 milliliters LB 150, microliters van één molaire cholesterol en 75 microliters van 100 milligram per milliliter streptomycine te combineren. Het toevoegen van LB helpt om te voorkomen dat de wormen aan het glaswerk en plasticwerk blijven plakken, maar deze hoeveelheid is niet genoeg om bacteriegroei te ondersteunen.
Filter om de mixtuur te steriliseren, breng het over in een steriele 1 liter fles en laat de fles opzij om de eieren van GR-volwassen wormen vrij te geven. Was de bacteriën van de wormen door ze te centrifugeren en vervang het NGM-medium totdat het supinate helder is. Was de wormen een tweede keer door ze in sterieel water te resuspenderen, centrifugeer opnieuw na het spinnen.
Verwijder het supinate en vul de buis met 3,75 milliliters sterieel water. Voeg een milliliter huishoudbleach toe en 250 microliters van 10 normale natriumhydroxide onmiddellijk gemengd door vijf tot zes keer om te draaien. Plaats de buis in een rotator nadat de wormen vier minuten lang zijn blootgesteld aan bleekmiddel.
Plaats de buis onder een stereomicroscoop. De meeste volwassenen zouden moeten liggen. Schud de buis krachtig 15 tot 20 keer om liggende wormen te helpen na lysis gedurende een totaal van vijf minuten, voeg sterieel water toe totdat de buis vol is.
Meng door vijf tot zes keer om te draaien om de eieren te verzamelen. Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 500 RCF. Was de eieren drie keer door ze te resuspenderen, buigen in 10 milliliters sterieel water, te centrifugeren en het supinate te verwijderen.
Verdun vervolgens een 100 microliter-monster van de eieren 100 keer door 10 milliliters NGM-buffer toe te voegen. Pipetteer vervolgens drie vijf microliter-aliquots op een petrischaaldeksel onder een microscoop. Tel het aantal eieren in drie afzonderlijke vijf microliter-aliquots.
Om het totale aantal eieren te schatten. Voeg 200.000 tot 2 miljoen eieren toe aan de fles met NGM-buffer en schud de cultuur bij 100 RPM bij 20 graden Celsius. Ten minste 16 uur nadat de eieren aan de fles zijn toegevoegd, gebruikt u een steriele serologische pipet om ongeveer 0,5 milliliter van de gesuspendeerde wormcultuur te verwijderen.
Pipetteer drie vijf microliter-druppels op het steriele deksel van een petrischaal. Plaats het deksel een tot twee minuten in een minuus 20
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video demonstreert een methode om fluorescente stammen van C. elegans te kweken en te verdelen voor hoogdoorvoerscherming van chemische bibliotheken of detectie van milieuverontreinigingen. De procedure maakt de beoordeling mogelijk van de effecten van chemische of milieuagentia op specifieke eiwitactiviteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biotechnologie
- Milieuwetenschappen
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme dat veel wordt gebruikt in biologisch onderzoek.
- Fluorescente reporter-eiwitten helpen bij het visualiseren van genexpressie en eiwitactiviteit.
- Hoogdoorvoerscherming is essentieel voor medicijnontdekking.
- Milieuverontreinigingen kunnen biologische systemen beïnvloeden.
Doel van de studie
- Om een kosteneffectieve methode voor het kweken van C. elegans te ontwikkelen.
- Om het screenen van chemische bibliotheken te vergemakkelijken.
- Om de impact van milieuagentia op eiwitactiviteit te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bacterieculturen worden bereid als voedsel voor de wormen.
- Gesynchroniseerde C. elegans wormen worden gekweekt.
- Worms worden verzameld, gewassen en verdeeld in microtiterplaten.
- Kleine moleculen of testmonsters worden toegevoegd aan de wormen.
Belangrijkste resultaten
- Fluorescentie van de wormen wordt gemeten met een microplaatlezer.
- De methode maakt efficiënt screenen van meerdere monsters mogelijk.
- Resultaten kunnen de effecten van verschillende agentia op eiwitactiviteit aangeven.
- Deze aanpak kan worden toegepast op talrijke inducible C. elegans genen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is een levensvatbaar alternatief voor dure sorteerapparatuur.
- Het kan worden gebruikt voor medicijnontdekking en biosensing van verontreinigingen.
- Deze techniek verbetert de toegankelijkheid van C. elegans onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput screening using fluorescent C. elegans strains enables in vivo identification of chemical modulators with improved predictive confidence over cell-based assays. This approach reduces attrition from compounds that are toxic or inactive in whole organisms, supporting more reliable early-stage triage and target pathway validation. The method's scalability and reproducibility position it as a robust platform for both drug discovery and environmental biosensing pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of inducible transcriptional pathways in a whole-animal context.
- Supports functional target validation by measuring pathway-specific gene activation in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing active compounds from those with off-target toxicity or inactivity.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative readouts using dual fluorescent reporters for normalization.
- Ensures reproducibility and scalability across 384-well plate formats for HTS campaigns.
- Prepares validated biological systems for reliable compound evaluation and biosensor assay development.
- Enables rapid adaptation to new pathways or environmental targets with existing reporter strains.
Translational & Preclinical Research
- Aligns pathway activation data with disease-relevant mechanisms, such as oxidative stress response.
- Provides translational continuity from early discovery to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming in vivo activity prior to mammalian studies.
- Offers predictive de-risking for compounds targeting conserved stress response pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, enabling seamless transition to preclinical validation when pathway modulation is confirmed in vivo.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying gene expression changes in response to chemical or environmental agents.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility with dual-reporter normalization and low well-to-well variability.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence ratios for robust statistical comparison of treatment effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by validating pathway modulation in a multicellular organism.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse pathways and biosensor applications with minimal reconfiguration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage screening.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for high-throughput campaigns.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by filtering out non-viable compounds early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated in vivo activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, synchronization, and transgenic strain maintenance.
- Needs access to liquid handling automation and fluorescence microplate readers for high-throughput operation.
- Demands rigorous cross-team standardization of worm density and dispensing protocols.
- Adaptable to various inducible pathways with available reporter strains, but dependent on reporter validation.
- Practical limitations include maintaining worm suspension and ensuring consistent normalization across plates.
