Name: High-throughput screening en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Leer hoe u fluorescerende C. elegans-stammen kweekt en dispenseert voor high-throughput screening van chemische bibliotheken en detectie van milieuverontreinigingen. Deze methode maakt real-time meting van genexpressie in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C. elegans transgenen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Dit werk werd ondersteund door NIH R21 verlenen NS0667678-01 naar KS. Alle auteurs namen deel aan het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens. CKL, KS, en KPC deelgenomen aan het schrijven en de herziening van het manuscript.

1. De voorbereiding van bacteriële worm voedsel Dag 1 <ol><li> Voeg 5 ml van de verzadigde E. coli OP50 bacteriecultuur tot 500 ml bouillon Terrific aangevuld met 50 ug / ml streptomycine en in een incubator schudden (225 rpm) 's nachts bij 37 ° C te groeien </li></ol> Dag 2 <ol start="2"><li> Splits de nacht bacteriecultuur in tien 50 ml en centrifugeer bacteriën in een gekoelde centrifuge bij 2500 RCF gedurende 20 minuten. </li><li> Afgeschonken LB bouillon en resuspendeer elke bacteriële pellet in 10 ml vloeistof nematode groei media (NGM). Schudden horizontaal in een vloer shaker gedurende 15 minuten om de bacteriën te mengen. Te maken NGM buffer, voeg 3 g NaCl aan een L gedeïoniseerd water en autoclaaf. Afkoelen tot 55 ° C en toe te voegen om de volgende steriele oplossingen: 1 ml van 1 M CaCl 2, 1 ml van 1 M MgSO 4, en 25 ml van 1 M kalium fosfaat, pH 6,0. </li><li> Centrifugeer de bacteriecultuur in een gekoelde centrifuge bij 2500 RCF gedurende 20 minuten. </li><li> Afgeschonken NGM buffer en wegen de bacteriële pellet. </li><li> Voeg een gelijk volume van NGM buffer om de pellets, hoeveelheid van 3 ml concentraat bacteriën in 15 ml buizen, en bewaar bij -20 ° C. resuspenderen </li></ol> 2. Grootschalige C. elegans vloeibare cultuur We maken gebruik van een transgene lijn VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [DOP-3:: RFP]) met twee TL-constructen: Pgst -4:: GFP 14 tot SKN-1 monitor activiteit en PDOP-3:: RFP 17 om te dienen als een standaard voor de worm nummer normalisatie. Dag 1 <ol><li> Meng 150 ml NGM buffer, 1,5 ml LB-bouillon, 150 pl van 5 mg / ml cholesterol (in ethanol), en 75 pi van 100 mg / ml streptomycine. Filter-steriliseren van het mengsel en voeg een 1 liter steriele kolf. Opmerking: Het toevoegen van 1% LB-bouillon aan NGM buffer helpt om wormen te voorkomen dat het vasthouden aan glaswerk en plastic, maar dit bedrag is niet genoeg om de groei van bacteriën te ondersteunen. </li><li> Synchroniseer wormen met de standaard hypochloriet procedure 18. Maximaal 0,5 ml van zwangere wormen kan worden verwerkt in een 15 ml buis met 5 ml van hypochloriet oplossing (3,75 ml steriel water, 1 ml bleekmiddel, en 250 ul 10 N NaOH). Was de vrijgekomen eieren met steriel water en resuspendeer ze in 10 ml van NGM buffer. </li><li> Verdun een steekproef van de eieren 100 vouw in NGM buffer (bv. 100 pi in 10 ml) en tel het aantal eieren in drie afzonderlijke 5 ul aliquots. Meerdere het gemiddelde aantal van 200.000 (100 verdunningsfactor x 2.000) van het totale aantal eieren te schatten. </li><li> Voeg toe 200.000 naar 2 miljoen eieren aan de kolf met NGM buffer en schud de cultuur bij 100 tpm bij 20 ° C. </li></ol> Dag 2 <ol start="5"><li> Minimaal 16 uur na het toevoegen van eieren aan de kolf, gebruik dan een steriel serologische pipet tot ongeveer 0,5 ml van de geschorste worm cultuur te verwijderen. Pipet drie 5 pl druppels op de steriele deksel van een petrischaal. Plaats het deksel in een -20 ° C vriezer gedurende 1-2 minuten om wormen te verlammen. Tel het gemiddelde aantal levende uitgekomen wormen per 5 ul en vervolgens meerdere met 30.000 (150 ml / 5 ul) om het totale aantal uitgekomen wormen te schatten. </li><li> Dooi een buis van bevroren OP50 bacteriecultuur (Protocol 1.6) en voeg 3 ml van 50% OP50 in de worm cultuur per 500.000 uitgekomen wormen. Schudden de kolf bij 100 tpm bij 20 ° C. Worms zal ontwikkelen tot L4 larven en jonge volwassenen in ongeveer 51 uur. De OD600 van bacteriën moet ongeveer 2.200 aan het begin. Controleren het bedrag van bacteriën door absorptie en voeg meer als de OD 600 daalt onder 0.900. </li></ol> 3. Worm verzamelen en doseren Dag 4 <ol><li> Gebruik een steriele serologische pipet tot ongeveer 0,5 ml van de geschorste worm cultuur over te dragen aan een standaard NGM agarplaat. Bekijk de wormen met een stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat de meeste zijn L4 larven of jonge volwassenen. L4 larven hebben een ventrale duidelijke plek in het midden van het lichaam. Jonge volwassenen worden iets groter en zal niet een duidelijke plek. </li><li> Giet de worm cultuur in steriele 50 ml buizen en plaats de buizen in een reageerbuis rek op het werkblad. Laat de wormen genoegen te nemen met ongeveer 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie of pipetteren. OPMERKING: Deze stap kan belangrijk zijn om unhatched eieren of wormen die niet ontwikkelde verwijderen omdat ze langzamer dan L4 larven en jonge volwassenen af ​​te wikkelen. </li><li> Verzamel alle wormen in een 50 ml buis en wassen met NGM buffer met 1% LB-bouillon (NGM + LB) 3-4 keer om bacteriën te verwijderen. LET OP: Dit kan het beste gedaan in een swingende-bucket centrifuge door het verzamelen van wormen bij 500 RCF voor 30 sec en het vervangen van het supernatant met verse NGM + LB buffer. </li><li> Na het wassen, vul de buis met NGM + LB buffer tot 50 ml en giet het in een aangepaste dosering worm kolf. Voeg een klein roer bar en roer om de wormen opgeschort. Tellen ee aantal wormen in drie 5 pl druppels zoals hierboven aangegeven. Verdunnen met NGM + LB tot je 12 tot 15 wormen per 5 pi druppel (~ 2.5-3.0 wormen / ul). LET OP: Een minimum van ongeveer 20 ml (60.000 wormen) is nodig om de dode ruimte van de verstrekking kolf en dispenser cassette te vullen. Elke 384 wells plaat is ongeveer 35.000 wormen of 11,5 ml van de geschorste wormen. </li><li> Laad een 10 ul doseren cassette en steriliseer door priming met 70% ethanol. Spoel de ethanol door priming met steriel water. </li><li> Steek het uiteinde van de verstrekking cassette in de kolf zodat het net boven de roerstaafje zonder verstoring van de beweging. Zorg ervoor dat de wormen blijven hangen in de hele kolf. Programmeer de dispenser af te zien bij een lage snelheid met 2 pre-pulsen. Prime en lopen ten minste 10 ml van de geschorste wormen. Vul platen zo snel nodig is om de wormen te voorkomen dat de vestiging in de slang. </li><li> Afdichting van de platen met ademende tape. </li><li> Leg de platen op een schudden platform in een couveuse op de juiste temperatuur voor uw test. Niet stapelen van de platen. </li></ol> 4. Fluorescentie analyse <ol><li> Leg het doel plaat in een microplaat lezer om de fluorescentie-intensiteit van elk goed te meten met de juiste emissie en excitatie golflengte (Filters voor onze test: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li> Bereken de verhouding van GFP / RFP en normaliseren met de lezingen van de controle putten (zonder activering compound) om de exacte voudig verschil van de fluorescentie-intensiteit afgeleid uit individuele behandelingen te bepalen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Onze SKN-1-test maakt gebruik van een chromosomaal geïntegreerde dual reporter stam (VP596). Zoals weergegeven in figuur 1, is het aantal wormen goed gecorreleerd aan verspoten volume. Zoals in de figuren 2A en 2B, totale GFP en RFP fluorescentie per well is zeer reproduceerbare van goed tot goed over een 384 wells plaat. Zoals weergegeven in figuur 2C, on-geïnduceerde Pgst-4:: GFP fluorescentie is lineair gecorreleerd aan PDOP-3:: RFP over 384 putten. Uitgedrukt als een verhouding van GFP / RFP, fluorescentie wordt zeer reproduceerbaar uit goed om goed over een 384 wells plaat (vergelijk variatiecoëfficiënt van figuur 2D naar 2A) tonen het vermogen van de PDOP-3:: RFP reporter om de variabiliteit te verminderen. Zoals weergegeven in figuur 3, de inductie van GFP ten opzichte van RFP met een SKN-1 activeren milieuvreemde (38 uM juglone) is robuust en zeer reproduceerbare over een 384 wells plaat. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Aantal wormen versus volume gedoseerd. Wormen werden verdund tot ongeveer 2/μl en gedispenseerd in een 24 wells plaat voor handmatige telling met een stereomicroscoop. N = 8 wells per volume. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Totale fluorescentie van wormen gedispenseerd in een 384 wells plaat is reproduceerbaar. Wormen werden verdund tot ongeveer 2.5/μl en 30 pi werd verstrekt in ieder putje van een 384 wells plaat. GFP (A) en RFP (B) fluorescentie van alle putten hadden een variatiecoëfficiënt minder dan 9%. (C) GFP-fluorescentie is sterk gecorreleerd aan RFP fluorescentie. (D) berekening van de verhouding van GFP aan RFP verminderde de variatiecoëfficiënt tot onder de 6% (A, B en D) Vaste lijnen geven de middelen en gebroken lijnen geven drie standaarddeviaties boven of onder het gemiddelde. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> . Figuur 3 Activering van Pgst-4:: GFP is robuust en consistent. Ongeveer 75 L4 wormen werden afgegeven in ieder putje van een 384 goed bord en 38 uM juglone werd toegevoegd in elke andere kolom. GFP en RFP fluorescentie werd gemeten na 21 uur incubatie. De gemiddelde relatieve fluorescentie verhoudingen van alle controle (1.0) en juglone Wells (8,9) zijn gemarkeerd met doorgetrokken lijnen. Drie standaarddeviaties boven het gemiddelde en controle onder de juglone betekenen zijn gemarkeerd met gebroken lijnen.

<ol><li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li>
<li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+versatile+platform+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li>
<li>WormBase [Internet]. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.wormbase.org">http://www.wormbase.org</a> (2012).</li>
<li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li>
<li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4%2FDDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li>
<li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li>
<li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1%2FNrf%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li>
<li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li>
<li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li>
<li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+signaling%2C+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li>
<li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li>
<li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li>
<li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide%2C+a+harmful+substance+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li>
<li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li>
<li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%2C+a+Practical+Guide%22">C. elegans, a Practical Guide</a>. , Oxford University Press. (2005).</li>
<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li>
</ol>

We presenteren een methode voor het kweken en het doseren van grote aantallen transgene nematoden. De apparatuur wordt gebruikt voor het kweken van wormen is standaard voor de laboratoria die moleculaire klonen en de liquid handling-en fluorescentie-apparatuur is standaard voor laboratoria het verwerken van grote aantallen microtiterplaten. Andere methoden van doseren grote aantallen van de live C. elegans dure deeltje gesorteerd apparatuur 19. De Pgst-4:: GFP assay kan worden gebruikt voor ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> LB bouillon </td><td> Research Products International Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific bouillon </td><td> Research Products International Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-mode Microplate Reader </td><td> BioTek </td><td></td><td> Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Selecteer Dispenser </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm doseren fles </td><td> Southern Scientific Inc, Micanopy, FL </td><td></td><td> Op maat geassembleerd (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microtiterplaten </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Ademende afdichtband </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone wordt opgelost in DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans stam transgene </td><td> Auteur laboratorium </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP en PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende c. elegans stammen

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is een krachtige aanpak voor het identificeren van chemische modulatoren van biologische processen. Er zijn echter vele stoffen die in schermen met behulp van celkweek modellen vaak te toxisch of farmacologisch inactief worden in vivo 1-2. Screening in hele diermodellen kunnen helpen deze valkuilen te vermijden en het stroomlijnen van de weg naar de ontwikkeling van geneesmiddelen. C. elegans is een meercellig organisme model zeer geschikt voor HTS. Het is klein (&lt;1 mm) en economisch kunnen worden gekweekt en afgeleverd in vloeistoffen. C. elegans is ook een van de meest handelbare experimenteel diermodellen waarbij een snelle en gedetailleerde identificatie van de drug mode-van-actie 3. Beschrijven we een protocol voor het kweken en het doseren van tl-stammen van C. elegans voor high-throughput screening van chemische bibliotheken of het opsporen van milieuverontreinigende stoffen die de expressie van een specifiek gen wijzigen. Grote aantallen ontwikkelingsgebied gesynchroniseerde wormen worden gekweekt in vloeibare cultuur, geoogst, gewassen en opgehangen in een bepaalde dichtheid. Wormen zijn vervolgens toegevoegd aan zwarte, platte bodem 384-wells platen met behulp van een peristaltische vloeistof dispenser. Kleine moleculen van een chemische bibliotheek of proefmonsters (bijvoorbeeld water, voedsel, of bodem) kunnen worden toegevoegd aan putten met wormen. In vivo, real-time fluorescentie-intensiteit wordt gemeten met een fluorescentie microplaat reader. Deze methode kan worden aangepast aan een induceerbaar gen in C. elegans waarvoor een geschikte verslaggever beschikbaar is. Veel induceerbare stress en ontwikkelingsstoornissen transcriptionele paden zijn goed gedefinieerd in C. elegans en GFP transgene reporter stammen al bestaan ​​voor velen van hen 4. In combinatie met de juiste transgene verslaggevers, kan onze methode worden gebruikt voor het screenen op pad modulatoren of de robuuste biosensor testen te ontwikkelen voor milieucontaminanten. We tonen onze C. elegans cultuur en het doseren van het protocol met een HTS-test hebben we ontwikkeld om de C. te controleren kraag transcriptie elegans cap &#39;n&#39; factor SKN-1. SKN-1 en de zoogdier-homoloog Nrf2 activeren cytoprotectieve genen tijdens oxidatieve stress-en xenobiotische 5-10. Nrf2 beschermt zoogdieren uit tal van leeftijd-gerelateerde aandoeningen zoals kanker, neurodegeneratie, en chronische ontstekingen en is uitgegroeid tot een belangrijke chemotherapeutische doelwit 11-13. Onze test is gebaseerd op een GFP transgene verslaggever voor de SKN-een target-gen gst -4 14, dat codeert voor een glutathion-s-transferase 6. De gst -4 reporter is ook een biosensor voor xenobiotische en oxidatieve stoffen die SKN-1 te activeren en kan gebruikt worden om lage niveaus van verontreinigende stoffen zoals acrylamide en methyl-kwik 15-16 te detecteren.

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking van<em&gt; C. elegans</em&gt; Stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten is beschreven dat betekent niet duur sorteren apparatuur nodig. Deze aanpak kan worden toegepast op tal van induceerbare<em&gt; C. elegans</em&gt; Genen voor drug discovery of biosensing van verontreinigende stoffen.

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

High-throughput screening (HTS) is een krachtige benadering voor het identificeren van chemische modulatoren van biologische processen. Veel van de verbindingen die zijn geïdentificeerd in ...

Deze video demonstreert een methode voor het kweken en uitplaten van fluorescerende stammen van CL gans voor high-throughput screening van chemische bibliotheken of detectie van milieuverontreinigingen om het effect van chemische of milieu-factoren op specifieke eiwitactiviteit te beoordelen. Bij CL elgan worden eerst bacteriële culturen bereid als voedsel voor de wormen en worden GFP-transgene, gesynchroniseerde wormen gekweekt.Vervolgens worden 0,5 tot 2 miljoen wormen verzameld, gewassen en verdeeld over drie 84-wells microtiterplaten, waarna kleine moleculen uit een chemische bibliotheek of testmonsters zoals water, voedsel of bodem aan de wormen worden toegevoegd. Tot slot wordt de fluorescentie van de wormen gemeten met een microplaatlezer.Data-analyse van fluorescentie-intensiteiten onthult kleine moleculen die induceerbare transcriptionele paden moduleren of die de detectie van milieuverontreinigingen mogelijk maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in vitro- en celkweekgebaseerde assays, is dat er geen tijd wordt verspild aan verbindingen die in vivo toxisch of inactief zijn. Deze high-throughput methode kan helpen bij het identificeren van kleine moleculen die diverse induceerbare paden moduleren.Hoewel we deze methode hebben ontwikkeld voor high-throughput screening van bibliotheken met kleine moleculen, kan deze ook worden toegepast voor biosensing van contaminanten in voedingsmiddelen en milieu-monsters. De procedure zal worden gedemonstreerd door Andrew Dine, een technicus in mijn laboratorium, en Q long, een postdoc in mijn laboratorium. Bereid het bacteriële wormvoeder vooraf.Begin met het inoculeren van 500 milliliters terrific broth, aangevuld met 50 micrograms per milliliter streptomycine, met vijf milliliters verzadigde e coli. OP 50. Plaats de cultuur op een schudapparaat en laat deze overnacht groeien bij 37 degrees Celsius.Verdeel de cultuur de volgende dag over tien buisjes van 50 milliliter. Plaats de buisjes vervolgens in een gekoelde centrifuge en centrifugeer ze 20 minuten bij 2.500 RCF. Resuspendeer na het centrifugeren elke bacteriële pellet in 10 milliliter vloeibaar nematode-groeimedium of NGM.Schud de suspensies horizontaal. Gebruik een orbitalschudder gedurende 15 minuten om de bacteriën opnieuw te suspenderen. Centrifugeer vervolgens de bacteriecultuur bij 2.500 RCF bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Giet het NGM af en weeg het bacteriële pellet. Voeg vervolgens een gelijk volume NGM-buffer toe en resuspendeer de pellets door middel van vortexen. Verdeel tot slot drie milliliter van de geresuspendeerde bacteriecultuur in buisjes van 15 milliliter en bewaar deze bij minus 20 graden Celsius tot ze nodig zijn.In deze demonstratie zal het effect van de stress-inducerende Xeno Duke lening op de transcriptiefactor Sskn one worden gemeten als voorbeeld. Sskn one staat erom bekend cytoprotectieve genen te activeren tijdens oxidatieve en xenobi stress. Er wordt een grootschalige cultuur voorbereid van de Trenchgenic c gans-lijn VP 5 96, die twee fluorescerende constructen bevat.VP 5 96 wormen brengen zowel de GST vier promoter tot expressie die GFP aanstuurt, wat wordt gebruikt om de activiteit van de transcriptiefactor te monitoren, als de Sskn één en de DOP drie promoter die RFP aanstuurt, wat wordt gebruikt als standaard voor de normalisatie van het aantal wormen.DOP three is de promotor voor een dopaminereceptor en wordt constitutief tot expressie gebracht in neuronen door het hele lichaam. In het voorbeeld, aangezien de xenobi lon sskn one sterk activeert en de hoeveelheid GFP die vanaf de GS T four promotor wordt tot expressie gebracht verhoogt, begint u ter voorbereiding van de culturen met het mengen van 150 milliliters N NGM-buffer, 1,5 milliliters LB, 150 microliters 1 molar cholesterol en 75 microliters 100 milligrams per milliliter Streptomycine. Het toevoegen van LB helpt te voorkomen dat de wormen aan het glaswerk en plasticware kleven, maar deze hoeveelheid is onvoldoende om bacteriële groei te ondersteunen.Filtreer het mengsel om het te steriliseren, breng het vervolgens over naar een steriele kolf van één liter en zet de kolf apart om de eieren uit de volwassen GR-wormen te laten vrijkomen. Was de bacteriën van de wormen door ze te centrifugeren en het NGM-medium te vervangen totdat het supernatant helder is. Was de wormen een tweede keer door ze te resuspenderen in steriel water en na het centrifugeren opnieuw te centrifugeren.Verwijder het supernatant en vul de buis met 3,75 milliliters steriel water. Voeg één milliliter huishoudbleekmiddel en 250 microliters 10 normaal natriumhydroxide toe en meng dit onmiddellijk door de buis vijf tot zes keer om te keren. Plaats de buis in een rotator nadat de wormen gedurende vier minuten aan het bleekmiddel zijn blootgesteld.Plaats de buis onder een stereomicroscoop. De meeste volwassen wormen zouden gelyseerd moeten zijn. Schud de buis krachtig 15 tot 20 keer om de resterende volwassen wormen te lyseren. Nadat de lysering in totaal vijf minuten heeft geduurd, voegt u steriel water toe tot de buis vol is.Meng door vijf tot zes keer te keren om de eieren te verzamelen. Centrifugeer de buis gedurende één minuut bij 500 RCF. Was de eieren drie keer door ze te resuspenderen in 10 milliliters steriel water, te centrifugeren en het supernatant te verwijderen.Verdun vervolgens een monster van 100 µL eieren 100-voudig door 10 mL NGM-buffer toe te voegen. Pipetteer daarna drie aliquoten van 5 µL op het deksel van een Petrischaal onder een microscoop. Tel het aantal eieren in drie afzonderlijke aliquoten van 5 µL.Om het totale aantal eieren te schatten: voeg 200.000 tot 2 miljoen eieren toe aan de kolf met NGM-buffer en schud de cultuur met 100 RPM bij 20 °C. Ten minste 16 uur nadat de eieren aan de kolf zijn toegevoegd, wordt een steriele serologische pipet gebruikt om ongeveer 0,5 ml van de gesuspendeerde wormencultuur te verwijderen.Pipetteer drie druppels van 5 µL op het steriele deksel van een Petrischaal. Plaats het deksel gedurende één tot twee minuten in een vriezer van -20 °C om de wormen te verlammen. Tel, zodra de wormen verlamd zijn, het gemiddeld aantal levende uitgekomen wormen per 5 µL met een stereomicroscoop om het totaal aantal te schatten.Ontdooi de eerder bereide bevroren OP 50 bacteriële cultuur door deze enkele minuten op de werkbank te plaatsen. Voeg vervolgens drie milliliters 50% OP 50 toe per 500.000 uitgekomen wormen. Schud de kolf met 100 RPM bij 20 °C.De wormen zullen in ongeveer 51 uur uitgroeien tot L4-larven en jonge volwassen stadia. Controleer de hoeveelheid bacteriën gedurende de incubatie door middel van visuele inspectie. Voeg meer bacteriën toe als het medium helder wordt.Gebruik een steriele serologische pipette om ongeveer 0,5 milliliter van de gesuspendeerde wormcultuur over te brengen naar een standaard NGM-agarplaat. Bekijk de wormen met een stereomicroscoop om te controleren of het merendeel L4-larven en jonge volwassenen zijn; onder brightfield-microscopie vertonen L4-larven een heldere ventrale vlek in het midden van het lichaam. Jonge volwassenen zijn iets groter en hebben geen heldere vlek.Trek vervolgens de wormcultuur in steriele buizen van 50 milliliter. Plaats de buizen in een reageerbuisrek in de zuurkast en laat niet-uitgekomen eitjes of wormen die zich niet ontwikkelen bezinken. Deze bezinken langzamer dan ontwikkelde wormen.Verwijder na 10 minuten het supernatant, dat niet uitgekomen en onontwikkelde wormen bevat, via aspiratie, voeg ongeveer 10 milliliters NGM-buffer toe aan elk pellet en suspendeer de wormen door voorzichtig met de buisjes te draaien. Verzamel alle wormen in één enkele buis van 50 milliliter. Centrifugeer in een centrifuge met zwaaibekers bij 500 RCF gedurende 30 seconden.Resuspendeer de wormen vervolgens in 50 milliliters NGM met 1%lb om ze te wassen. Herhaal dit; was drie tot vier keer om de bacteriën na het wassen te verwijderen. Vul de buis aan met NGM plus LB-buffer tot 50 milliliters.Giet dit in een speciale fles voor het dispenseren van wormen met een roerstaf en plaats deze op een roerplaat. Er is een minimum van ongeveer 20 milliliters of 60 000 wormen nodig om de dode ruimte in de dispenserfles en de dispensercassette te vullen. Tel het aantal wormen in drie druppels van vijf microliter, zoals eerder gedemonstreerd.Na het tellen bij NGM plus LB tot een concentratie van 12 tot 15 wormen per druppel van vijf µL, heeft elke 84-wells plaat ongeveer 35.000 wormen of 11,5 mL gesuspendeerde wormen nodig. Plaats een doseercassette van 10 µL in de dispenser en steriliseer deze door te primen met 70% ethanol. Spoel de ethanol weg door te primen met steriel water.Plaats het uiteinde van de doseercassette in de kolf, zodat deze net boven de roerkolf staat zonder de beweging ervan te hinderen. Zorg ervoor dat de wormen gedurende het proces in de hele kolf gesuspendeerd blijven. Programmeer de dispenser om de wormen op lage snelheid te doseren met twee voorpulsen (prime) en laat ten minste 10 milliliters gesuspendeerde wormen doorlopen.Vul de microtiterplaten, die al testverbindingen moeten bevatten, snel om te voorkomen dat de wormen in de slang bezinken. Hier dient de testverbinding die eerder op de microtiterplaat is geladen te worden gebruikt. Glow. Verzegel de platen met ademend plakband om te voorkomen dat er stof in de wells verzamelt.Plaats de platen op een schudplatform in een incubator bij de juiste temperatuur voor de assay. Stapel de platen niet op elkaar, omdat dit de luchtstroom kan beperken. Plaats de doelplaat in een microplaatlezer om de fluorescentie-intensiteit van elke well te meten met de juiste emissie- en excitatielengten.De filters die voor GFP worden gebruikt, hebben een excitatie van 485 en een emissie van 528. De filters voor RFP hebben een excitatie van 540 en een emissie van 590. Bereken na het uitlezen van de plaat de verhouding tussen GFP en RFP en normaliseer dit met de waarden van de controleputjes, die geen activerende verbinding bevatten, om het exactevoudige verschil in fluorescentie-intensiteit als gevolg van de individuele behandelingen te bepalen.De hier getoonde SSKN one-assay maakt gebruik van een chromosomaal geïntegreerde dubbele reporterstam, waarbij de wormen handmatig werden geteld met een stereomicroscoop. Het aantal wormen correleerde met het gedoseerde volume met een R-kwadraatwaarde van 0,94 en een p-waarde van minder dan 0,0001. Dit geeft aan dat het aantal wormen dat in elke put wordt gedoseerd, kan worden gecontroleerd door het gedoseerde volume aan te passen.De totale GFP-fluorescentie per well, links afgebeeld, en de RFP-fluorescentie per well, rechts afgebeeld, zijn in deze figuren zeer reproduceerbaar tussen de wells over een 384-well plaat. De XS geven de relatieve fluorescentie aan die in elke well is gemeten. Doorlopende lijnen geven de gemiddelden aan en stippellijnen geven drie standaarddeviaties boven of onder het gemiddelde aan; de fluorescentie van alle wells had een variatiecoëfficiënt van minder dan 9%. Zoals in deze figuur wordt getoond, is de GFP-fluorescentie van de GST-4-promotor lineair gecorreleerd met de RFP-fluorescentie van de DOP-3-promotor over 384 wells, met een R²-waarde van 0,62 en een p-waarde van minder dan 0,0001.Daarom kan de niet-induceerbare RFP-reporter worden gebruikt om de induceerbare GFP-reporter te normaliseren. Wanneer dit gebeurt, wordt de ratio van GFP- ten opzichte van RFP-fluorescentie zeer reproduceerbaar van put tot put over een 384-wells plaat.Het berekenen van de ratio van GFP ten opzichte van RFP reduceerde de variatiecoëfficiënt tot onder de 6%, wat de mogelijkheid van de DOP three promoter RFP-reporter demonstreert om de variabiliteit te verminderen, zoals hier wordt getoond. De inductie van GFP ten opzichte van RFP met een SK N one-activerend xenobioticum is robuust en zeer reproduceerbaar over een 384-well plaat; de gemiddelde relatieve fluorescentieratio's van alle controle-wells en due GLO-wells zijn aangegeven met ononderbroken lijnen. Drie standaarddeviaties boven het gemiddelde van de controle en onder het gemiddelde van dlo zijn aangegeven met streeplijnen.Zodra de methode onder de knie is, kan het opzetten van een wormcultuur op de eerste dag in ongeveer één uur worden voltooid, evenals het verzamelen en uitpipetteren. Het verzamelen en uitpipetteren van wormen kan in ongeveer twee uur worden gedaan als dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat men moet beginnen met ten minste 60.000 wormen en deze in suspensie moet houden tijdens het uitpipetteren; door deze procedure te volgen kunnen screens met andere, bijvoorbeeld reporter-strains voor andere induceerbare pathways, worden uitgevoerd om na de ontwikkeling modulatoren voor andere pathways te ontwikkelen.Deze techniek kan de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van high-throughput screening en biosensing om snel modulatoren van kleine molecuulpaden te identificeren of milieuverontreinigingen te detecteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fluorescerende elegan-stammen moet kweken, dispenseren en meten voor high-throughput screening van induceerbare transcriptionele paden of het testen van meerdere monsters op milieuverontreinigingen.

high-throughput-screening-biosensing-with-fluorescent-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

We beschrijven een protocol met behulp...

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

Source: Anderson, Q. L. et al. A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates a high-throughput screening method using Caenorhabditis elegans to study gene knockdowns during host-pathogen interactions. It outlines the procedure for preparing knockdown worms and transferring them to assay plates to evaluate the effects of pathogen-induced worm killing.

A Multiwell Liquid-Based Assay for Screening C. elegans Knockdowns

Source: Ali, I., et al. High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a high-throughput fluorescent assay to evaluate how gut bacteria affect stress resilience in Caenorhabditis elegans. By tracking blue fluorescence from ruptured gut granules, the assay reveals earlier death signals in worms exposed to test bacteria.

High-Throughput Fluorescent Assay to Study Microbe-Worm Interactions

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Hier beschrijven we een protocol dat is een aanpasbaar, hele gastheer, hoge-content screening tool die kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties en worden gebruikt voor drugontdekking.

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Leer hoe u fluorescerende C. elegans-stammen kweekt en dispenseert voor high-throughput screening van chemische bibliotheken en detectie van milieuverontreinigingen. Deze methode maakt real-time meting van genexpressie in vivo mogelijk.

High-throughput screening 'en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

Meer video's verkennen