Name: Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer vibrodissociatie van neuronen uit hersenschijven van knaagdieren voor elektrofysiologisch onderzoek naar synaptische transmissie. Deze methode behoudt intacte presynaptische terminals voor patch-clamp en fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Drs erkennen. Ping juni Zhu en Susumu Koyama voor hun hulp tijdens de eerste opzet van de techniek, en Dr Veronica Alvarez voor hulp bij het formatteren van de geschreven manuscript. Deze studie werd gefinancierd door de Afdeling Klinische en Intramurale Biomedical Research van NIAAA.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Succesvolle vibrodissociation vereist dat de schijfjes gezonde neuronen bevatten en dat de interstitiële ruimten zijn flexibel genoeg om neuronen aan de slice af te sluiten zonder toxische schade. Zo is de techniek werkt optimaal bij vroege postnatale leeftijd (P1-21) als gezond plakjes gemaakt kan worden met minder gliale / interstiatial materiaal dan wordt aangetroffen in volwassen hersenen plakjes. In onze ervaring, echter, het optimaliseren van slice voorbereiding op de neuronale overleving in de slice zelf kan contraproductief zijn voor de vibrodissociation techniek. Terwijl we routinematig voorbereiden plakjes voor in-situ opname met koud gewijzigd aCSF waarin sucrose is vervangen voor een groot deel van de extracellulaire Na + en Ca 2 +, plakjes voorbereid voor vibrodissociation kunnen worden bereid (bijv. snede) in ons normale opname aCSF. Bij de voorbereiding plakjes voor het opnemen van individuele neuronen in de plakken we zelf ook plaats plakken in de normale aCSF bij 35 ° C net na het snijden en laat ze gedurende 30-60 minuten bij deze temperatuur alvorens terug te keren ze op kamertemperatuur. Echter, plakjes voorbereid voor vibrodissociation onmiddellijk naar kamertemperatuur net na het snijden. Deze procedures zorgen voor een hogere opbrengst van gezonde neuronen na vibrodissociation, misschien te wijten aan het ontbreken van ferme bindweefsel waarmee neuronen gemakkelijker worden geschud los van het schijfje zelf. We hebben nog niet uitputtend onderzocht slice voorbereiding van omstandigheden, zoals we regelmatig voldoende neuronen voor onze opname-en imaging-experimenten te verkrijgen over een bepaalde dag. Het is mogelijk dat extra aanpassingen, zoals veranderingen in slice dikte of preincubaton procedures, kunnen worden gemaakt om de opbrengst van gezonde neuronen te verhogen. Zeer milde protease behandelingen zijn uitgeprobeerd in een poging om de cel opbrengst te verhogen en krijg de techniek aan de slag bij oudere dieren. Maar steevast zelfs lichte protease behandeling lijkt te verstoren synaps functie. Dus, terwijl de combinatie van protease en mechanische dissociatie kan nog steeds worden gevonden om te werken is het niet betrouwbaar bewezen voorhersenen neuronen tot nu toe. Het moet ook worden gewezen op de relatief lage opbrengst van gezonde neuronen na vibrodissociation betekent dat de techniek is vooral nuttig voor het bestuderen van overvloedige neuronale subtypes, voornamelijk projectie neuronen. De beschikbaarheid van GFP-expressie muizen waarin kleine neuronale subpopulaties gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd verhoogt de kans op het bestuderen van deze zeldzamer neuronen. Maar tenzij neuronale opbrengst kan aanzienlijk worden verbeterd accumulatie van gegevens over deze neuronen is waarschijnlijk relatief langzaam. Een aantal stappen hebben bewezen dat het succes van het laden van de neuronen met calcium-sensing kleurstoffen. Blootstelling aan AM-veresterde kleurstof wordt uitgevoerd bij 37 ° C, en we hebben het ongelijk zijn gesteld in het proberen om dye-load bij lagere temperaturen. De concentratie van de kleurstoffen moeten worden geoptimaliseerd rekening houdend met zowel het laden van de tijd en de temperatuur, omdat blijkt dat hogere concentratie van de kleurstof-loading verlaagt calciumconcentratie in de presynaptische boutons. We hebben waargenomen dat het laden met hogere concentraties van de frequentie en de amplitude van sIPSCs af. Bij het laden van calcium-sensing kleurstoffen in presynaptische terminals van vibrodissociated neuronen, moet erop worden gelet, omdat bufferend vermogen van de kleine presynaptische boutons kan anders zijn dan in de soma en de afmetingen van boutons zijn niet consistent. Neuron-bevattende gerechten worden gewassen met HEPES-gebufferde externe oplossing na dye-loading, en de hersteltijd na het wassen is cruciaal. Bovendien, om een ​​goede afdichting voor het whole-cell opname te maken, moeten de cellen grondig worden gewassen om zich te ontdoen van niet-geïnternaliseerde dye moleculen uit de buitenste celmembraan. Naast het gebruik van vibrodissociated neuronen voor elektrofysiologie en live cell imaging, kan immunocytochemische technieken ook worden toegepast op deze cellen 11,12. Cellen kunnen eenvoudig worden gefixeerd en gekleurd met een verscheidenheid aan antilichamen en andere cel markers. Het gebruik van deze cellen zorgt voor een schone voorbereiding voor visualisatie van eiwitexpressie in GABAergische presynaptische terminals. Met behulp van muizen die fluorescerende eiwitten te uiten onder de controle van promotors die specifiek zijn voor GABA-erge neuronen kan de onderzoeker te identificeren individuele synaptische terminals in de voorbereiding van de vibrodissociated (figuur 1). Imaging fluorescente markers van dit type kunnen zorgen voor morfologische metingen in terminals met behulp van laser-gebaseerde microscopie en nieuwere technieken zoals STED (Stimuleringsprogramma Emission Depletion Microscopy). Visualisatie met kleurstoffen die synaptische vesicles fietsen rapport is ook mogelijk met deze voorbereiding. Akaike en collega&#39;s hebben bestempeld GABAergische terminals met de styrylkleurstoffen kleurstof, FM1-43 aan op de klemmen in levende cellen 4 te visualiseren. Het moet ook mogelijk zijn om single-cell reverse transcriptase-PCR uit te voeren naar het profiel van RNA-expressie in vibrodissociatedneuronen. Deze techniek wordt routinematig toegepast op enzymatisch-gesplitste neuronen en neuronen gekweekt in celkweek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Vennootschap </td><td> Catalog # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Vibrerende Tissue Slicer </td><td> Leica Microsystems Inc </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Cel Cultuur Dish (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen bodem Gerechten </td><td> Willco-schotel </td><td> GWSB-5040 Of GWSB-3522 </td><td> 0.16-0.19 mm glasdikte voor imaging </td></tr><tr><td> Piëzo-elektrische Manipulator </td><td> Exfo-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Kan ook gebruik maken van relais, enz. </td></tr><tr><td> SD9 Square Pulse Stimulator </td><td> Gras Technologies </td><td> SD9K </td><td> Voor het teweegbrengen van piëzo-elektrische manipulator </td></tr><tr><td> Ontleden Stereoscope </td><td> Wild Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Kan ook gebruik maken van een stereoscoop </td></tr><tr><td> Flaming / Bruin micropipet puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Dunne wand glazen capillairen </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> TW-150F-4 </td><td> Voor vlam-afgesloten glazen micropipet en patch micropipet </td></tr><tr><td> Zes Channel Perfusie Valve Control Systems </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 of VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusie Fast-Step </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop met 20-63x doelstellingen </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Camera </td><td> ANDOR Technology </td><td> IXON EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite fluorescentie verlichting Lichtbron </td><td> Exfo Fotonica Solutions Inc </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM calcium indicator </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren brain slices synaptische transmissie en image presynaptische terminals study

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanische dissociatie van de neuronen van het centrale zenuwstelsel heeft het voordeel dat de presynaptische boutons gehecht blijven aan de geïsoleerde neuron van belang. Dit maakt voor het onderzoek van synaptische transmissie onder omstandigheden waar de extracellulaire en postsynaptische intracellulaire omgeving goed kan worden gecontroleerd. Een trilling-gebaseerde techniek zonder het gebruik van proteasen, bekend als vibrodissociation, is de meest populaire techniek voor mechanische isolatie. Een micropipet, met de punt brand-gepolijst om de vorm van een kleine bal, wordt geplaatst in een plakje hersenen gemaakt van een P1-P21 knaagdier. De micropipet is parallel getrild om de slice oppervlak en verlaagd door middel van de slice dikte resulteerde in de bevrijding van geïsoleerde neuronen. De geïsoleerde neuronen zijn klaar voor studie binnen een paar minuten vibrodissociation. Deze techniek heeft voordelen ten opzichte van het gebruik van primaire neuronale culturen, de hersenen plakjes en enzymatisch geïsoleerde neuronen, waaronder: snelle productie van levensvatbare, relatief volwassen neuronen die geschikt zijn voor elektrofysiologische en imaging studies; superieure beheersing van de extracellulaire omgeving vrij van de invloed van de naburige cellen; geschiktheid voor de goed-gecontroleerde farmacologische experimenten met behulp van een snelle drug toepassing en totale cel superfusie en verbeterde ruimte-klem in whole-cell opnames ten opzichte van neuronen in de slice of celkweek preparaten. Dit preparaat kan worden gebruikt om synaptische fysiologie, farmacologie, de modulatie en plasticiteit onderzoeken. Real-time beeldvorming van zowel pre-en postsynaptische elementen in de levende cellen en boutons is ook mogelijk met vibrodissociated neuronen. Karakterisering van de moleculaire bestanddelen van pre-en postsynaptische elementen kunnen ook worden bereikt met immunologische en imaging-gebaseerde benaderingen.

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Mechanische dissociatie van neuronen uit het centrale zenuwstelsel heeft het voordeel dat presynaptische boutons verbonden blijven met het geïsoleerde neuron van ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het isoleren van neuronen met behoud van aangehechte, afgesnoerde synaptische batons, wat farmacologische controle en een verbeterde space clamp mogelijk maakt, terwijl de invloed van naburige cellen wordt geëlimineerd. Dit wordt bereikt door in eerste instantie acute hersensecties voor te bereiden van ratten of muizen van postnatale dag P1 tot P21, die het hersengebied van belang bevatten, om in een tweede stap individuele neuronen te isoleren. De acute secties worden in een schaal geplaatst en een vlamgesmolten glazen micropipet wordt in het betreffende gebied gevibreerd terwijl de tip door de sectie wordt bewogen, waardoor individuele neuronen vrijkomen.De neuronen krijgen de tijd om zich aan de bodem van de kweekschaal te hechten. Vervolgens wordt de schaal met gefibro-gedissocieerde neuronen naar een microscoop verplaatst om de synaptische fysiologie, farmacologie, modulatie en plasticiteit te onderzoeken, evenals real-time beeldvorming en karakterisering van pre- en postsynaptische elementen in de levende cel; de resultaten tonen de fysiologische en farmacologische kenmerken van synaptische responsen en bijbehorende veranderingen in de functie van de presynaptische terminal via whole-cell recording met een tight seal en fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals registraties uit hersensnijden, gecultiveerde neuronen en enzymatisch gedissocieerde neuronen, is dat de gehechte synaptische verbindingen controle en visualisatie van presynaptische elementen mogelijk maken, terwijl de relatief compacte postsynaptische structuur zorgt voor een verbeterde voltage clamp en een uitstekende controle over de extracellulaire omgeving.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de opbrengst van gezonde neuronen sterk kan variëren afhankelijk van verschillende omstandigheden, zoals de leeftijd van het dier, de vibratieparameters en het gebied van interesse in het coupesectie. Bovendien houden celregistraties bij individuen korter aan dan bij conventionele coupesectie-registraties. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de VI-dissociatiestappen moeilijk aan te leren zijn omdat het lastig is om de bewegingsafstand en de penetratie door de coupe nauwkeurig te beschrijven. Bereid ter voorbereiding op het maken van de hersencoupes een bel van kunstmatig cerebrospinaal vocht (aCSF) voor met carbogeen gedurende 15 minuten.Voeg vervolgens twee millimolaire calciumchloride en één millimolaire magnesiumchloride toe. Nadat een dier van P 1 tot 21 postnatale leeftijd is geanestheseerd en gedecapiteerd, verwijdert u de hersenen en snijdt u deze in de gewenste oriëntatie zodat het gebied van belang is inbegrepen. Bevestig de gedissecteerde hersenen aan een objecttafel en dompel deze onder in een kamer gevuld met A CSF.Monteer vervolgens de kamer op een brensnijmachine en neem coupes van het brein met een dikte van 250 tot 400 micrometer per coupes met behulp van een trilmes. Plaats de coupes in A CSF en belucht deze met carbogegas in een pre-incubatiekamer gedurende ten minste één uur. Om een vlamgesloten glazen micropipet te prepareren, trek eerst een standaard patchclamp-micropipet met een tipdiameter van twee micrometer met een Flaming Brown of een vergelijkbare micropipet-trekker.Plaats de micropipetpunt ongeveer twee seconden in de vlam van een bunsenbrander om een gesmolten bol met een diameter van 200 tot 300 micrometer te vormen. Plaats vervolgens de vlamgesloten patchpipet in een houder van de micromanipulator die snel zijwaarts kan worden gevijbererd met een uitslag van 100 tot 200 micrometer met behulp van een piëzo-elektrisch bimorf relais of een vergelijkbaar effectief apparaat. Bereid een HEPES-gebufferde zoutoplossing.Stel de pH van de oplossing bij tot 7,4 met natriumhydroxide en de osmolariteit tot ongeveer 300 milliosmolen met sucrose. Vul vervolgens een kweekschaal met een diameter van 35 millimeter met HEPES-gebufferde zoutoplossing. Plaats een plakje in de kweekschaal en visualiseer dit met een dissectiestereomicroscoop bij een vergroting van 250 x met behulp van een gebogen draad.Houd het plakje tegen de bodem van de schaal om de cellen te dissociëren. Positioneer de punt van de vlamgesloten micropipet op het oppervlak van het plakje. Activeer de micromanipulator zodat de punt lateraal vibreert met 10 tot 30 hertz en een uitwijkingsafstand van ongeveer 100 micrometers.Laat de micropipetpunt met de micromanipulator in de slice zakken, zodanig dat deze binnen 30 seconden door de volledige diepte snijdt. Herhaal deze stap indien nodig om het aantal geïsoleerde neuronen te maximaliseren. Verwijder vervolgens de punt uit de slice.Pak de plak met een pincet op en schud deze voorzichtig in de oplossing. Verwijder de plak vervolgens volledig uit de oplossing. Laat de cellen gedurende ten minste 10 minuten naar de bodem van de schaal zinken.Plaats de schaal met de neuronen op de tafel van een omgekeerde microscoop en visualiseer deze met een 1x tot 63x objectief. Zoek naar neuronen met gladde membranen zonder blaasjes en detecteerbare, maar niet overmatig grote kernen. Indien fasecontrastoptiek wordt gebruikt, zoek dan naar de fase-heldere neuronen met een gelige tint, maar niet te blauw.Trek een standaard patch-micropipet met een flaming brown-puller of een gelijkwaardig apparaat, zodanig dat de weerstand van de pipetpunt twee tot vier megaohm bedraagt. Vul de patchpipet met een intracellulaire oplossing op basis van cesiumchloride voor de meting van synaptische responsen, of met een intracellulaire oplossing op basis van kaliumchloride voor de meting van intrinsieke membraaneigenschappen en actiepotentialen. Voer een whole-cell patchclamp uit op het neuron met behulp van standaard elektrofysiologische technieken.Registreer eerst spontane postsynaptische stromen met behulp van een gap-free data-acquisitieprotocol. Pas vervolgens 200 nM animal- of tetrotoxine en/of een extracellulaire oplossing met een laag calciumgehalte toe om miniatuur postsynaptische stromen te registreren om de extracellulaire moleculaire samenstelling te wijzigen. De betreffende geneesmiddelen worden individueel geladen in een van de lumen van een gefuseerde, vierkant gepunte glazen pipet, die dicht bij het betreffende neuron wordt geplaatst.Een individueel vat wordt aan het neuron blootgesteld door een door een stappenmotor aangestuurde micromanipulator, die zijdelings beweegt om een uitwisseling van oplossingen gedurende 10 tot 100 milliseconden mogelijk te maken. Bekijk de gedownloade bns bij hoge vergroting met een objectief met een hoge numerieke apertuur in een cameragebaseerde of multifotonmicroscoop. Hier wordt het beeld van een neuron en bns getoond, vastgelegd met een electron multiplying charge coupled device-camera.De sterkte van de lichtbron voor excitatie werd verzwakt tot 1,2% met een neutraal density 1,0 filter en een irisfilter dat werd ingesteld op 12% output tijdens de voltage clamp metingen. Met een cesiumchloride-gebaseerde intracellulaire oplossing worden spontane synaptische stromen waargenomen om vesikelfusie te visualiseren. In de presynaptische batons hebben we muizen gebruikt die het synaptische florine-construct tot expressie brengen onder controle van de TH1-promotor.Synaptisch florine is een moleculair construct waarin ecliptisch Florine, een GFP-mutant met een verhoogde pH-gevoeligheid, aan het blaasjesgeassocieerde membraaneiwit is gekoppeld bij blaasjesfusie. Dit motief wordt blootgesteld aan de meer neutrale extracellulaire omgeving, wat resulteert in een toename van de fluorescentie bij puncta die overeenkomen met blaasjes en presynaptische terminals. Fibro-dissociatie van hippocampaal neuronen van deze muizen maakt de visualisatie mogelijk van fluorescente puncta met de grootte en locatie die verwacht worden voor GABAerge terminals tijdens het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om te onthouden dat u gezonde coupes moet hebben om gezonde neuronen te verkrijgen. Daarom is de preparatie van acute hersencoupes een cruciale stap in deze procedure. Andere methoden, zoals immunohistochemie of single-cell RT-PCR, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke eiwitten en mRNA-soorten tot expressie komen in de synaptische knoppen of postsynaptische neuronen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u gezonde geïsoleerde neuronen verkrijgt en deze gebruikt voor elektrofysiologie en real-time imaging.

vibrodissociation-neurons-from-rodent-brain-slices-to-study-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We demonstreren het gebruik van het gen pistool op fluorescente kleurstoffen, zoals DII, te introduceren in neuronen in de hersenen plakjes van knaagdieren en niet-menselijke primaten van verschillende leeftijden. In dit specifieke geval maken we gebruik van volwassen muizen (3-6 maanden oud) en volwassen cynomologus apen (9-15 jaar oud). Deze techniek, die oorspronkelijk beschreven door het laboratorium van Dr Lichtman...

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

The video describes the electrophysiological recording of retinogeniculate and corticogeniculate synapses in mouse brain slices. The slices containing the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) are placed in a recording chamber. A stimulating pipette is positioned on either the optic tract to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) and investigate retinogeniculate synapses or the nucleus reticularis thalami to stimulate cortical neurons and investigate corticogeniculate synapses. Upon...

An Electrophysiological Study of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapses in Mouse Brain Slices

This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: McLeod, F., et al. Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a method for visualizing synaptic markers in hippocampal brain slices using confocal immunofluorescence analysis. The slices are immunostained with primary antibodies targeting presynaptic and postsynaptic markers, followed by fluorophore-conjugated secondary antibodies. The labeled markers are then visualized using confocal microscopy to evaluate the synaptic...

Microscopic Analysis of Synapses in Mouse Hippocampal Slices Using Immunofluorescence

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Een protocol voor het nauwkeurig identificeren en analyseren van synapsen in hippocampal plakjes met immunofluorescentie wordt in dit artikel beschreven.

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.

Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Dit protocol presenteert een robuuste, gedetailleerde methode om zeer zuivere synaptosomen, synaptische blaasjes en andere synaptische fracties uit het muizenbrein te verkrijgen. Deze methode maakt de evaluatie van synaptische processen mogelijk, inclusief de biochemische analyse van eiwitlokalisatie en -functie met compartimentale resolutie.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Leer vibrodissociatie van neuronen uit hersenschijven van knaagdieren voor elektrofysiologisch onderzoek naar synaptische transmissie. Deze methode behoudt intacte presynaptische terminals voor patch-clamp en fluorescentiemicroscopie.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Meer video's verkennen