Name: Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer het isoleren van nasale olfactorische stamcellen uit knaagdieren of mensen voor hersenziekteonderzoek. Deze methode maakt veilige biopsie en differentiatie naar neuron-achtige cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathie), Feder in PACA en IRME (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale). We dankbaar danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Instituut) voor haar een efficiënte hulp tijdens time lapse opname.

1. Het verzamelen van Olfactorische slijmvlies in ratten <ol><li> Begin met het opstellen van drie 35 mm petrischalen gevuld met DMEM / HAM F12 kweekmedium in een schone cultuur kap. </li><li> Een methode van euthanasie moet vooraf worden goedgekeurd door dier van de instelling zorg en het gebruik commissie en uitgevoerd door gekwalificeerd personeel. Nadat de rat is aangegaan diepe narcose met natrium-pentobarbital of andere injecteerbare vormen van anesthesie, zoals ketamine / xylazine, onthoofden en verwijder de huid. Inhalatieoplossing anesthetica moeten worden vermeden. Toereikendheid van de anesthesie zal worden beoordeeld door de teen knijpen voorafgaand aan de onthoofding. Verwijder de onderkaak met een schaar en met de hulp van een rongeur, elimineren de gelaatsspieren aan beide zijden. </li><li> Vanaf de achterkant van de snijtanden, verwijderen met een rongeur het bot met betrekking tot de neusholte, een kant tegelijk. De olfactorische neusschelpen komen in zicht als oranje / bruin organen zich in de achterkant van de neus. </li><li> Voorzichtig verwijderen van de neusschelpen met een pincet. Met behulp van een 26 gauge naald, de oorzaak van het olfactorische slijmvlies liggend op het septum door te snijden van het weefsel langs drie lijnen: de boog van de loodrechte plaat, de getralied plaat en het plafond van de neusholte. </li><li> Verzamel biopsies aan beide kanten en zet ze in een DMEM / HAM F12 gevulde petrischaal. Deze procedure mag niet langer duren dan 10 minuten van het begin euthanasie. </li><li> Nu, om het slijm te verwijderen, overdracht van de biopten twee keer in het midden-gevulde petrischalen. </li></ol> 2. Het verzamelen van Olfactorische slijmvlies bij mensen <ol><li> Deze procedure moet worden uitgevoerd door een Oor Neus en Keel (KNO) chirurg, in overeenstemming met de relevante lokale ethische commissie (s), en iedere polikliniek moet een informed consent formulier ondertekenen. </li><li> Met behulp van een 0 ° of 30 ° stijve endoscoop (4 mm diameter), controleer beide neusholten en beoordeling van de vermeende aanwezigheid van poliepen of een inflammatoire laesie. Kies de beste neusholte, rekening houdend met de afwijking van het septum. </li><li> Met behulp van een katoenen applicator, toepassen van een plaatselijke verdoving, zoals lidocaïne met adrenaline, gedurende 10 minuten. </li><li> Met een throughcut ethmoid tang, hetzij bij een twee vierkante millimeter biopsie aan de wortel van de mediale aspect van de middelste turbinate of op het septum in het dorsomediale gebied. </li><li> De olfactorische biopsie wordt dan overgebracht, met een steriele naald, in een steriele 2 ml buis gevuld met 1 ml DMEM / HAM F12. Tip de buis ondersteboven om ervoor te zorgen dat de biopsie wordt ondergedompeld in het kweekmedium. </li><li> Steek de buis in een gekoelde container en het transport naar het onderzoekslaboratorium. In dit stadium kan de biopsie worden gebruikt per se voor vergelijkende moleculaire studies gericht zijn op specifieke hersenaandoeningen of verwerkt voor het genereren van stamcellen. </li></ol> 3. Isolatie van Olfactorische stamcellen uit menselijke en Rat slijmvlies <ol><li> Was de biopten in DMEM / HAM F12. Incubeer de biopten in een petrischaal gevuld met 1 ml van dispase II-oplossing (2,4 IU / ml), gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Vervolgens onder een microscoop met dissectie een gebogen omgekeerd licht, is het reukepitheel verwijderd van de onderliggende lamina propria met behulp van een micro-spatel. </li><li> Het reukepitheel is dunner en ziet er translucent over een zwarte achtergrond in vergelijking met de lamina propria die is gestreept oranje / bruin. Over een witte achtergrond, het epitheel ziet er grijs en de lamina propria, bruin. </li><li> Eenmaal gezuiverd, overdracht van de lamina propria in een petrischaal gevuld met DMEM / HAM F12. </li><li> Als het weefsel is van een knaagdier, knip dan de lamina propria in kleine stukjes met twee 25 gauge naalden. Dan overdracht van de stukken om een ​​15 ml buis gevuld met 1 ml collagenase IA. </li><li> In de buis, met behulp van een steriele plastic pipet, dissociëren het weefsel. Vervolgens wordt de buis incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Tot beëindiging van de dissociatie, schud de buis en voeg 9 ml Ca-Mg-vrij en vrij PBS en centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de celpellet in DMEM / HAM F12 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal kalf serum, antibiotica en de plaat op plastic cultuur gerechten. </li><li> Nu, als het weefsel mens is, dan snijd de lamina propria in 3 tot 4 stukken met een dikte van 200 tot 500 pm. </li><li> Steek elke strip in een eigen 2 cm diameter cultuur schotel en bedek het weefsel met steriele 1,3 cm diameter glazen dekglaasjes. </li><li> Dan, voeg 500 ul kweekmedium (DMEM / HAM F12 aangevuld met 10% foetaal kalf serum en antibiotica) om elke cultuur gerecht. </li><li> Voor beide weefsel type, vernieuwen van de cultuur medium om de 2 tot 3 dagen. </li><li> Vijf tot zeven dagen na, zal stamcellen beginnen met de cultuur schotel binnen te vallen en na twee weken moeten ze worden confluent. Wanneer confluentie bereikt is, passage en de overdracht van de cellen aan de cultuur kolven. </li></ol> 4. Sphere Vorming en neuronale Differentiation van olfactorische Stem Cells <ol><li> Voor het genereren van stamcellen bollen, incubeer de kolven gedurende twee uur bij 37 ° C met poly-L-lysine. (TEXT: 5 g/cm2). </li><li> Het bord van de cellen bij een dichtheid van 16.000 cellen per vierkante centimeter in de behandelde kolven. </li><li> Om de twee dagen, voeden de cellen met 0,2 ml per vierkante centimeter aangevuld medium (DMEM / HAM F12 aangevuld met insuline, transferrine, selenium (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) en FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Twee tot vijf dagen later, het verzamelen van drijvend cel sferen en een re-plaat of losmaken voordat enten in diermodellen van celtherapie. </li><li> Om onderscheid te olfactorische stamcellen in neuron-achtige cellen, kweken ze gedurende 21 dagen in Neurobasal medium met B-27, penicilline, streptomycine, glutamine en glutamaat. </li><li> Maak medium verandert elke drie dagen. Neuron-achtige cellen zou moeten verschijnen na twee tot drie weken. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Neus menselijke explant-ontgroeien stamcellen (Figuur 2A) zijn snel delende en confluentie kunnen bereiken binnen een tot twee weken. Een belangrijk kenmerk van stemness, Nestin expressie, werd geëvalueerd (figuur 2B). Wanneer gekweekt op poly-L-lysine met een serum-vrij kweekmedium aangevuld met EGF (50 ng / ml) en FGF2 (50 ng / ml), olfactorische stamcellen aanleiding geven tot bollen (figuur 2C). Wanneer ze groeien in serum-bevattend kweekmedium nieuw vergulde bollen aanleiding geven tot GFAP expressie cellen (~ 50%), tubuline expressie cellen (~ 10-15%) en O4 expressie cellen (~ 2-5%) 9 (Cijfers 2D-F). Kan echter het lot van de bol-afgeleide cellen worden aangepast. Bijvoorbeeld, wanneer ze groeien in een Neurobasal kweekmedium aangevuld met B27 en glutamaat, het grootste deel van de nasale olfactorische stamcellen in neuron-achtige cellen die β-tubuline III (figuur 2G) en MAP2 (figuur 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Algehele opzet van het experiment. Olfactorische slijmvlies biopten worden uitgesneden uit rat of menselijke neusholte. Explanten kan worden gebruikt per se voor vergelijkende moleculaire studies gericht op biomarkers bij hersenziekten te identificeren. Voor het isoleren van olfactorische stamcellen, zijn de interacties tussen de lamina propria en de neuro-epitheel verstoord met de dispase II enzym, en na 45 minuten, het epitheel wordt verwijderd met een micro-spatel. Knaagdier olfactorische stamcellen worden verder geselecteerd door dissociatie van de lamina propria met collagenase IA. Voor menselijk weefsel, zijn stukjes van olfactorische lamina propria gekweekt onder glas dekglaasje totdat ontgroeien stamcellen binnen te dringen het geheel goed. Na de proliferatie, met behulp van een geschikt kweekmedium, kan olfactorische stamcellen te genereren bollen of differentiëren naar neuron-achtige cellen. Olfactorische stamcellen kunnen worden gebruikt om i) te repareren hersenziekten of trauma of ii) identificeren van moleculaire merkers van het centrale zenuwstelsel ziekten. Illustraties zijn gemaakt met de hulp van Servier Medical Art. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Cultuur en differentiatie van nasale menselijke olfactorische stamcellen. Menselijke stamcellen uit de lamina propria explantatie (A) groeit snel delende, toen gecultiveerd in een serum-bevattend medium. Stamcellen express de stemness marker Nestin (B). Wanneer geplateerd op poly-L-lysine-gecoate kunststof en gekweekt in een serum-vrije cultuur medium aangevuld met EGF en FGF2, olfactorische stamcellen te genereren bollen (C). Sphere-afgeleide cellen, wanneer uitgeplaat in serum-bevattende kweekmedium, aanleiding geven tot GFAP expressie cellen (~ 50%), tubuline expressie cellen (~ 10-15%) en O4 expressie cellen (~ 2-5%) 9 (DF). Wanneer ze groeien in een Neurobasal kweekmedium aangevuld met B27 en glutamaat, ze differentiëren tot neuron-achtige cellen die β-III tubuline (G) en MAP2 (H).

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
<li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li>
<li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+adhesion%2C+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li>
<li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific%2C+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li>
<li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li>
<li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+stem+cells%2C+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li>
<li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li>
<li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+olfactory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li>
<li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li>
<li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li>
<li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li>
<li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De technieken die hier maken het knaagdier-en menselijke reuk slijmvlies een nuttig model voor klinisch onderzoek naar de oorzaken van neurologische en neurodegeneratieve ziekten en als een instrument voor het herstellen van de pathologische of getraumatiseerd hersenen. Het protocol is betrekkelijk eenvoudig en kan gemakkelijk worden uitgevoerd door een ervaren celbioloog. Het slagingspercentage voor de biopsie en de cultuur technieken is hoog. Kritische stappen <ul><li> Voor het verzamelen van knaagdieren olfactorische mucosa, wordt aanbevolen om geen tijdslimiet van 10 minuten tussen euthanasie en de uiteindelijke excisie van de olfactorische weefsel overschrijden. </li><li> De dissociatie van het knaagdieren olfactorische lamina propria wordt gewoonlijk bereikt na 10 minuten. incubatie in collagenase IA. Zo niet, dan raden wij u aan de dag verzamelen na de supernatant waarin ongedissocieerde stukjes van de lamina propria float, het centrifugeren bij 200 g en mechanisch dissociëren de drijvende lamina met behulp van een Pasteur pipet voor replating de cellen in een nieuwe put. De eerste goed met de reeds aan cellen is gevuld met vers kweekmedium. </li><li> Voor de menselijke lamina propria, wat meer is compacter dan de knaagdieren weefsel, raden we een enzymatische dissociatie. Het weefsel is gesneden en elk Explantatie wordt ingevoegd tussen de bodem van de plastic schotel en een glas dekglaasje aan. Succesvolle culturen zijn explantaten waarvan de dikte van 200 tot 500 pm. </li></ul> Eventuele wijzigingen <ul><li> Het huidige protocol kan enigszins worden gewijzigd om olfactorische neuronen in vitro te genereren. Voor dat doel is het neuro-epitheel niet verwijderd en het hele olfactorische mucosa is gesneden met een McIlwain chopper (200 micrometer dikte). Elke Explantatie is bedekt met een schotel, gedeeltelijk gedroogde gedurende een uur en daarna gerehydrateerd met FCS-bevattende kweekmedium. Tijdens de eerste dagen na de plating, epitheliale en mesenchymale cellen groeien uit de explantatie. Dan zal neuron voorouders migreren op de top van deze cel laag en differentiëren tot neuronen. </li><li> Zuivering van olfactorische stamcellen kunnen worden bereikt met behulp van flow cytometrie. Specifieke oppervlakte merkers kunnen worden opgehaald uit de lijst die is gepubliceerd in de karakterisering papier 11. </li><li> Voor de transplantatie-experimenten, is het mogelijk gebruik te maken van een stam van ratten, waarvan olfactorische stamcellen zijn GFP-positief. Deze rat stam (Sprague Dawley, eGFP gedreven door de PGK promoter) is beschikbaar op ITERT (Nantes, Frankrijk). Voor het invoegen van de GFP-gen in menselijke geur stamcellen maken wij gebruik van een methode gebaseerd op lentivirus infectie. </li><li> Dit document is gericht op olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen. Kan echter een ander celtype van belang, de olfactorische ensheathing cellen, worden gezuiverd van hetzelfde weefsel. We beschreven een methode voor de afvoer en zuivering 1,17 en we menselijke neus ensheathing cellen die worden gebruikt voor een fase I / IIa klinische studie bij dwarslaesie patiënten van 18. </li><li> Als lid van de mesenchymale stamcellen superfamilie, OE-MSC&#39;s zijn in staat, onder de juiste kweekomstandigheden, om te differentiëren in adipocyten, osteocyten en myocyten 11. </li></ul> Toekomstige toepassingen <ul><li> We hebben al gebruikt de menselijke reuk biopten cellulaire en moleculaire afwijkingen bij patiënten met autisme, bipolaire stoornis, familiale dysautonomie, de ziekte van Parkinson, Alzheimer en schizofrenie 2-7 te bestuderen. Theoretisch kunnen alle hersenaandoeningen worden bestudeerd met behulp van nasale biopsies of perifere olfactorische stamcellen. </li><li> Knaagdier-en menselijke nasale olfactorische stamcellen zijn al geënt in diermodellen van geheugenverlies, de ziekte van Parkinson, cochleaire schade en het ruggenmerg trauma 12-16. Het is denkbaar om deze cellen te transplanteren in diermodellen van de ziekte van Alzheimer, de hersenen ischemie, Multiple sclerose. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td colspan="3"> Het verzamelen van olfactorische slijmvlies bij ratten </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Natriumpentobarbital </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 gauge naald </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Pincet </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Het verzamelen van olfactorische slijmvlies bij de mens </td></tr><tr><td> Rigide endoscoop </td><td> Karl Storz of Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaïne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epinefrine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut zeefbeen pincet </td><td> Karl Storz of Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Isolatie van olfactorische stamcellen </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro spatel </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Foetaal kalf serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Glazen dekglaasje </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Sphere vorming en neuronale differentiatie </td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> Insuline transferrine selenium (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Neurobasal medium </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 Serum-Free Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isoleren neus olfactorische stamcellen van knaagdieren of mensen

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

De olfactorische mucosa, gelegen in de neusholte, is belast met het opsporen van geuren. Het is ook de enige zenuwweefsel dat is blootgesteld aan de externe omgeving en goed bereikbaar in elk levend individu. Als gevolg hiervan, dit weefsel is uniek voor iedereen gericht op moleculaire afwijkingen in de hersenen pathologische identificeren of volwassen stamcellen te isoleren voor celtherapie. Moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten zijn vaak bestudeerd met behulp van zenuwweefsel monsters verzameld post-mortem. Echter, dit materiaal heeft tal van beperkingen. In tegenstelling, de olfactorische slijmvlies is gemakkelijk toegankelijk en kan veilig worden gebiopteerd, zonder enig verlies van reukvermogen 1. Dienovereenkomstig, de olfactorische slijmvlies biedt een &quot;open venster&quot; in het volwassen menselijk waardoor men kan studeren ontwikkelingsstoornissen (bijv. autisme, schizofrenie), 2-4 of neurodegeneratieve (bijvoorbeeld Parkinson, Alzheimer) ziekten 4,5. Olfactorische mucosa kan worden gebruikt voor zowel vergelijkende moleculaire studies 4,6 of in vitro experimenten op neurogenese 3,7. Het reukepitheel is ook een zenuwweefsel dat nieuwe neuronen produceren elke dag te vervangen die beschadigd zijn door vervuiling, bacteriële van virale infecties. Deze permanente neurogenese wordt ondersteund door voorlopers, maar ook stamcellen die binnen beide compartimenten van het slijmvlies, namelijk de neuroepithelium en de onderliggende lamina propria 8-10. We hebben onlangs een methode ontwikkeld om de volwassen stamcellen zich in de lamina propria zuiveren en, nadat aangetoond dat ze nauw verbonden zijn met het beenmerg mesenchymale stamcellen (BM-MSC), noemden we ze olfactorische ecto-mesenchymale stamcellen (OE- MSC) 11. Interessant is dat in vergelijking met de BM-MSC&#39;s, OE-MSC&#39;s tonen een hoge proliferatie tarief, een verhoogde clonogenicity en een neiging om te differentiëren naar neurale cellen. We hebben voordeel van deze kenmerken studies gewijd aan de nieuwe kandidaat-genen in schizofrenie en de ziekte van Parkinson 4 onthullen uit te voeren. Wij en anderen hebben ook aangetoond dat de OE-MSC&#39;s in aanmerking komen voor celtherapie veelbelovend, na een ruggenmerg trauma 12,13, een cochleaire schade 14, of in een diermodellen van de ziekte van Parkinson 15 of 16 geheugenverlies. In deze studie presenteren we methoden om olfactorische slijmvlies biopsie bij ratten en mensen. Na het verzamelen, is de lamina propria enzymatisch gescheiden van het epitheel en de stamcellen worden gezuiverd met behulp van een enzymatische of een niet-enzymatische methode. Gezuiverde olfactorische stamcellen kunnen dan ofwel die in grote aantallen en opgeslagen in vloeibare stikstof of aangezet tot sferen vorm of gedifferentieerd in neurale cellen. Deze stamcellen kunnen ook worden gebruikt voor vergelijkende omica (genomische, transcriptoom, epigenomisch, proteoom) studies.

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

Het reukepitheel, gelegen in de neusholte, is verantwoordelijk voor het detecteren van geuren. Het is bovendien het enige zenuwweefsel dat is blootgesteld aan de externe ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van nasale olfactorische stamcellen van ratten of mensen om moleculaire anomalieën te identificeren of het pathologische of getraumatiseerde brein te herstellen. Dit wordt bereikt door eerst chirurgisch biopsieën van het olfactorische slijmvlies uit de neusholte te verzamelen. Vervolgens wordt het olfactorische epitheel en de bijbehorende epitheliale stamcellen geëlimineerd om ons te concentreren op ectomesenchymale stamcellen in de onderliggende lamina propria, waarna deze cellen worden geïsoleerd door het weefsel van knaagdieren te dissociëren of door uitgroeiende cellen van menselijke implantaten te verzamelen die zijn gekweekt onder glazen dekglasjes.De laatste stap van de procedure is het kweken van stamcelbolletjes waarbij differentiatie naar neuron-achtige cellen wordt geïnduceerd. Uiteindelijk vindt er een explantatie plaats van het volledige reuksluimvlies, met geïndividualiseerde stamcellen. Zwevende bolletjes of neuron-achtige cellen kunnen worden gebruikt voor het identificeren van moleculaire markers bij hersenziekten of voor het herstellen van schade aan het zenuwstelsel.We beschrijven haar methode voor het isoleren van nasale stamcellen van mensen en knaagdieren uit het reukepitheel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de stamcellen tot het zenuwweefsel behoren, gemakkelijk toegankelijk zijn bij elk levend individu en gebruikt kunnen worden voor het diagnosticeren of herstellen van het pathologische brein. Als KNO-chirurg heb ik honderden neusbiopsieën uitgevoerd voor diverse klinische studies.De procedure is veilig en kan worden uitgevoerd. En de lokale algehele anesthesie. Ik ben een beginnend wetenschapper met expertise in de kweek van menselijke of rod, nasale of factor stamcellen.Deze vertonen een hoge proliferatiesnelheid en een neiging om te differentiëren in neurale celtypen. Ze zijn effectief gebleken in diermodellen voor amnesie en bij het ondersteunen van zintuiglijke aandoeningen. Voordat het slijmvlies wordt verzameld, worden drie Petri-schalen van 35 millimeter klaargezet met DMEM Ham, F 12-kweekmedium in een steriele kweekkast.Nadat via de teenknijptest is vastgesteld dat de rat in een diepe anesthesie is door natriumpentobarbital, wordt het dier geëuthanaseerd door onthoofding. Isoleer de kop en verwijder de huid. Verwijder de onderkaak met een schaar en verwijder, met behulp van een pincet, de gezichtsspieren aan beide zijden, beginnend vanaf de achterzijde van de snijtanden.Gebruik de Ron Jur. Verwijder het bot dat de neusholte bedekt, één zijde per keer. De reukturbinalia worden zichtbaar als oranje-bruine organen in het achterste gedeelte van de neus; verwijder de turbinalia voorzichtig met een pincet.Isoleer met een naald van 26 gauge het reukepitheel op het septum door het weefsel langs drie lijnen in te snijden: de boog van de loodrechte plaat, de cribriforme plaat en het plafond van de neusholte. Neem biopten van beide zijden en breng deze over naar een Petri-schaal gevuld met A-D-M-E-M ham F 12. Deze procedure mag niet langer dan 10 minuten duren vanaf het begin van de euthanasie.Om nu het slijm te verwijderen, worden de biopsieaten twee keer overgebracht naar met medium gevulde Petrischalen. In overeenstemming met de relevante lokale ethische commissies dient een KNO-arts deze procedure uit te voeren, waarbij elke poliklinische patiënt een formulier voor geïnformeerde toestemming moet ondertekenen, met gebruik van een rigide endoscoop van 0 graden of 30 graden. Inspecteer beide neusholten en beoordeel de vermoedelijke aanwezigheid van poliepen of enige ontstekinghaard.Kies de meest geschikte neusholte, rekening houdend met de afwijking van het septum. Breng met een wattenstaafje een plaatselijk anestheticum aan, zoals lidocaïne met epinefrine, en laat dit 10 minuten inwerken met een diepe incisie. Met een ethmoïdtang wordt een biopsie van twee vierkante millimeter genomen, ofwel bij de wortel van het mediale aspect van de middelste neusschelp, ofwel op het septum in het dorsomediale gebied.Hier tonen we het biopt uit het wortelgebied. Het olfactorische biopt wordt vervolgens met een steriele naald overgebracht naar een steriele buis van twee milliliter, gevuld met één milliliter DMEM hem F 12. Keer de buis ondersteboven om er zeker van te zijn dat het biopt is ondergedompeld in het kweekmedium.Plaats de buis in een gekoelde houder en transporteer deze naar het onderzoekslaboratorium. In dit stadium kan de biopsie zodanig worden gebruikt voor vergelijkende moleculaire studies gericht op specifieke hersenziekten, of worden verwerkt voor het genereren van stamcellen. Was de menselijke of rattenbiopsieën en DMEM ham F 12 en incubeer de biopsieën in een Petrischaal gevuld met één milliliter van de pasta.Twee oplossingen gedurende één uur bij 37 °C. Vervolgens wordt het menselijke of rattenolfactorische epitheel van de onderliggende lamina propria verwijderd met een microspatel onder een dissectiemicroscoop met diffuus invergeerd licht. Het olfactorische epitheel is doorschijnend tegen een zwarte achtergrond in vergelijking met de lamina propria, die gestreept oranje-bruin is tegen een witte achtergrond.Het epitheel ziet er grijs uit en de lamina propria bruin na zuivering; breng de lamina propria over naar een Petrischaal gevuld met DMEM hem F 12. Als het weefsel van een knaagdier is, snijd de lamina propria dan in kleine stukjes met twee naalden van 25 gauge. Breng de stukjes vervolgens over naar een buis van 15 milliliter gevuld met één milliliter collagenase one A en gebruik een steriele plastic pipette om het weefsel te dissociëren.Incubeer de buis vervolgens 10 minuten bij 37 °C. Om de dissociatie te beëindigen, schudt u de buis voorzichtig, voegt u milliliters calcium- en magnesiumvrije PBS toe en centrifugeert u 5 minuten bij 200 Gs. Resuspendeer de celpellet in cultuurmedium en breng deze aan op plastic kweekschaaltjes.Als het weefsel menselijk is, snijd het citroenplakje dan in drie tot vier geschikte stukken. Plaats elke strip in een eigen put met een diameter van twee centimeter in een four-well plaat en bedek het weefsel met steriele glazen dekglasjes met een diameter van 1,3 centimeter.Voeg vervolgens 500 µL kweekmedium toe aan elke kweekschaal voor beide weefseltypen. Vernieuw het kweekmedium elke twee tot drie dagen. Na vijf tot zeven dagen kweken zullen de stamcellen de kweekschaal beginnen binnen te dringen.Na twee weken zouden ze confluent moeten zijn. Wanneer confluentie is bereikt, worden de cellen gesubcultured en overgebracht naar kweekcolven om stamcelsferen te genereren.Zaai de cellen elke twee dagen opnieuw uit in voorbehandelde flessen met een dichtheid van 16 000 cellen per vierkante centimeter. Voed de cellen met 0,2 milliliters per vierkante centimeter aangevuld medium. Verzamel twee tot vijf dagen later de drijvende celsferen en zaai deze opnieuw uit of dissocieer ze vóór het transplanteren.Een diermodel voor celtherapie om olfactorische stamcellen te differentiëren tot neuronachtige cellen. Kweek de cellen gedurende 21 dagen in neurobasaal medium met B 27, penicilline, streptomycine, glutamine en glutamaat, en ververs het medium elke drie dagen. Neuronachtige cellen zouden na twee tot drie weken, vijf tot zeven dagen na het uitplaten, zichtbaar moeten zijn.Neus-olfactorische stamcellen van de mens groeiden uit het explantaat uit en prolifereerden snel. Een volledige confluentie kon binnen een week of twee worden bereikt. Een kenmerkend aspect van stamcellen, nestvorming en expressie, werd geëvalueerd wanneer ze werden gekweekt op polylysine met een serumvrij kweekmedium aangevuld met EGF en FGF2; de olfactorische stamcellen vormden sferoïden wanneer deze sferoïden werden geplaatst in een kweekmedium dat serum bevatte.Medium; zij gaven aanleiding tot celpopulaties die ongeveer 50% GFAP-expresserende cellen, tot 15% tubuline-expresserende cellen en tot 5% ol4-expresserende cellen bevatten. Wanneer de uit sferen afgeleide cellen werden gekweekt in aangevuld neurobasaal kweekmedium, werd het grootste deel van de populatie neuronale cellen die bèta III-tubuline tot expressie brachten. Dezelfde neuronale cellen brachten ook map2 tot expressie.Zo kon het lot van de stamcellen gedurende één semester worden beïnvloed. Met deze techniek kunnen eenvoudig miljoenen stamcellen in minder dan vier weken worden gegenereerd, waardoor clinici in de toekomst autologe celtransplantaties kunnen uitvoeren. Refractaire neusbiopten zijn zeer nuttig voor het identificeren van biomarkers en hersenziekten.Onlangs zijn we erin geslaagd nieuwe kandidaatgenen voor autisme te vinden. We hebben al een bank van olfactorische stamcellen van autistische personen en controlegroepen opgezet, en deze kan worden uitgebreid naar andere hersenaandoeningen bij de mens.

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

Olfactorische ensheathing cellen (OECS) zijn neurale lijst cellen die de groei van de primaire olfactorische neuronen mogelijk te maken. Deze specifieke eigenschap kan worden gebruikt voor cellulaire transplantatie. We presenteren hier een model van cellulaire transplantatie gebaseerd op het gebruik van OECS in een laryngeal zenuwletsel model.

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's), betrokken bij type 2-ontsteking, nemen voornamelijk deel aan de reactie op worminfectie, allergische aandoeningen, metabole homeostase en weefselherstel. In deze studie wordt een procedure aangetoond om ILC2's te isoleren van murine neusslijmvlies en de expressie van CD226 te detecteren.

Isolatie van groep 2 aangeboren lymfoïde cellen van muis neusslijmvlies om de expressie van CD226 te detecteren

Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.

De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC's) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC's aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

Leer het isoleren van nasale olfactorische stamcellen uit knaagdieren of mensen voor hersenziekteonderzoek. Deze methode maakt veilige biopsie en differentiatie naar neuron-achtige cellen mogelijk.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

Meer video's verkennen