DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

In deze video wordt gedemonstreerd hoe DNA kan worden geëxtraheerd uit in paraffine ingebedde weefselmonsters. Het monster dat in deze demonstratie wordt gebruikt, is een weefselkern met een diameter van drie millimeter en een lengte van zes millimeter. Hoewel in deze demonstratie één enkele kern wordt gebruikt, kunnen grotere monsters van meer dan vijf millimeter in diameter en 10 millimeter in lengte, of twee tot drie kernen van de hier gebruikte grootte, in één enkele reactie worden verwerkt.

Het is echter belangrijk om op te merken dat aanpassingen aan het protocol mogelijk vereist zijn om de volledige verwijdering van paraffine en de weefseldigestie te garanderen. Voordat er iets met het weefsel kan worden gedaan, moet de wasachtige paraffine die het weefsel conserveert, worden opgelost. Dit wordt bereikt door het gebruik van xyleen, aangezien xyleen en fenol toxisch zijn. Al het werk met deze chemicaliën moet in een zuurkast worden uitgevoerd; voeg 800 µL xyleen toe aan de buis met uw monster.

Plaats het monster vervolgens gedurende 10 minuten op een rocker met een zachte schudbeweging. Centrifugeer het monster 3 minuten lang bij 14.000 RPM om het monster te pelletteren, verwijder daarna het xyleen en los de paraffine uit de buis op. Herhaal deze stappen twee of drie keer totdat de paraffine volledig is opgelost.

Het weefsel moet er nat en zacht uitzien. Het is belangrijk om alle paraffine te verwijderen om de uiteindelijke DNA-opbrengst te verhogen. Daarom zijn voor grotere weefselmonsters meer wasbeurten nodig.

Nu de paraffine uit het monster is verwijderd, moet het weefsel opnieuw worden gehydrateerd om weefseldigestie mogelijk te maken. Dit wordt bereikt met een ethanol-rehydratieserie. Voeg eerst 800 µL 100% ethanol toe aan het monster, vortex dit en centrifugeer het monster gedurende drie minuten bij 14.000 RPM.

Verwijder het supernatant. Herhaal deze stappen met 800 µL 70% ethanol en vervolgens met 50% ethanol. De laatste centrifugatiestap moet vijf minuten duren, omdat het weefsel minder solide is en meer kracht vereist om een pellet te vormen.

Nu moet het weefsel worden gedigesteerd om het DNA uit de cellen vrij te maken. Dit gebeurt met behulp van lysisbuffer, een oplossing bestaande uit eiwitdenaturen, zoals SDS en proteinase K, het enzym dat verantwoordelijk is voor de degradatie van het weefsel.

Voeg 200 tot 500 µL lysisbuffer toe aan het monster. Afhankelijk van de grootte is 400 µL een geschikt volume. De componenten van de lysisbuffer en de incubatietemperatuur van 56 °C dienen uiteraard om de activiteit van het eiwit te maximaliseren.

Omdat ACE K een eiwit is, kan ACE K weefsel slechts gedurende een bepaalde tijd afbreken; er moet periodiek meer enzym worden toegevoegd om de reactie voort te zetten. Er worden ochtend en avond 20 µL protein ACE K met een concentratie van 10 mg/mL aan het monster toegevoegd totdat het weefsel volledig is opgelost.

Wanneer er geen vast weefsel meer zichtbaar is, moet het DNA uit de buffer met celresten worden geëxtraheerd. Verzadigd fenol wordt gebruikt om het monster te scheiden in een waterige en een organische fase. De waterige fase bevat het DNA.

Het is belangrijk om buffersverzadigd fenol te gebruiken, omdat de zuurgraad van normaal fenol niet alleen uw DNA degradeert, maar ook de gelaagdheid van de waterige en organische fasen omkeert. Houd er rekening mee dat buffersverzadigd fenol in twee fasen wordt bewaard, waarbij het fenol de onderste laag vormt.

Voeg een gelijk volume bufferverzadigd fenol toe aan het monster en keer de buis meerdere keren om. Plaats het monster vervolgens in de centrifuge en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 14,000 RPM om fasescheiding op te wekken.

Het DNA en RNA bevinden zich in de bovenste waterige fase, terwijl eiwitten, lipiden en polysachariden zich in de interfase en de onderste organische fase bevinden. Verwijder voorzichtig de waterige laag zonder de interfase te verstoren en breng deze over in een nieuwe buis. Vaak is de interfase na de eerste centrifugatie los en instabiel.

Extracties moeten worden uitgevoerd met kleine volumes water. Het protocol voor tegenextracties is te vinden in de tekst bij deze video. Herhaal deze stappen totdat de interface helder is, wat gewoonlijk na drie tot vijf herhalingen wordt bereikt; ga verder door een gelijk volume fenol-chloroform-isoamylalcohol aan het DNA-monster toe te voegen.

Dit dient hetzelfde doel als fenol alleen, maar verscherpt de interface om de opbrengst van DNA te maximaliseren. Herhaal deze procedure één of twee keer totdat de interface helder en scherp is. Nu uw monster eiwitvrij is, moet eventueel contaminerend RNA worden verwijderd.

Dit wordt bereikt door RNA's. Een RNA-degradatie-enzym A wordt aan het monster toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 µg/ml, waarna het monster één uur wordt geïncubeerd bij 37 °C. Nu het RNA is gedegradeerd, moet het RNAA-enzym worden verwijderd.

De procedure voor het zuiveren van het DNA wordt herhaald zoals voorheen. Door eerst met buffer-verzadigd fenol te werken en vervolgens over te gaan op fenol-chloroform-isoamylalcohol, zijn er minder zuiveringsstappen nodig, aangezien de enige contaminatie nu het RNA A-enzym en het gedegradeerde RNA zijn. Nu het monster alleen DNA bevat, moet het DNA uit de oplossing worden geprecipiteerd; voeg hiervoor één tiende van het volume natriumacetaat en één volume isopropanol toe.

Als alternatief kunnen tweeënhalve volume ethanol worden toegevoegd, maar is er dan een grotere buis nodig. Incubeer het monster bij -20 °C gedurende 30 minuten tot een uur, of indien u laat in de avond werkt, gedurende de nacht. Aangezien u nu met DNA werkt, dient u ervoor te zorgen dat het monster op ijs blijft om degradatie te voorkomen.

Centrifuge het monster 10 minuten bij 14.000 RPM bij vier graden Celsius om het neergeslagen DNA te pelletteren. Verwijder het supernatant zorgvuldig, zonder de pellet te verstoren, om overtollige zouten te verwijderen die latere experimenten zoals sequencing kunnen beïnvloeden. Voeg bijvoorbeeld 1 ml gekoelde, 70% ethanol toe en resuspendeer het monster voorzichtig.

Centrifuge het monster opnieuw bij 14,000 RPM gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat eventueel overtollig ethanol tot vijf minuten aan de lucht drogen. Het is belangrijk om het monster niet te overdrogen.

Ten slotte wordt het DNA gezuiverd en is het klaar om opnieuw opgelost te worden in de buffer naar keuze. Hier maken we gebruik van autoclaaf-gedestilleerd water. Dat is alles.

Bewaar DNA-monsters bij -20 °C voor later gebruik. Nadat de extractie is voltooid, moet u de kwaliteit en kwantiteit van uw DNA beoordelen. Dit gebeurt via spectrometrie waarbij u de NanoDrop 2000 gebruikt; stel het meettype in op nucleïnezuren, selecteer DNA 50 als berekening en initialiseer het instrument met 1,5 µL water.

Reinig het voetstuk en voer een blanco meting uit met 1,5 µL verdunner. In dit geval gedestilleerd water. Reinig het voetstuk, breng 1,5 µL monster aan en druk op meten. Ja. Uitstekend.

Een A260/A280-ratio van 1,8 is op dit punt ideaal. Uw DNA is klaar voor gebruik in downstream-applicaties, waaronder maar niet beperkt tot: arrays, comparatieve genomische hybridisatie, methylatie-specifieke DNA-immunoprecipitatie en sequencing.

De links naar deze protocollen worden hier getoond, indien ze niet onmiddellijk nodig zijn. Bewaar uw monsters bij -20 °C voor later gebruik.