Name: DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Leer DNA-extractie uit formaline-gefixeerde paraffine-ingebette weefsels voor genetische en epigenetische analyses. Dit protocol gebruikt xyleen, proteïnase K en fenol-chloroform voor hoogwaardige DNA-isolatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag de leden van het Lam laboratorium bedanken voor hun evaluatie en kritieken van deze video en artikel. Dit werk werd ondersteund met middelen uit het Canadese Institutes for Health Research.

<p class="jove_title"&gt; 1. Procedurele notities</p&gt;<ul&gt;<li&gt; Xyleen en fenol zijn giftige chemische stoffen en moeten worden behandeld in een fumehood. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) voor gebruik.</li&gt;<li&gt; Xyleen lost op bepaalde kunststoffen, polypropyleen buizen moeten worden gebruikt als ze tolereren deze verbindingen.</li&gt;<li&gt; Speciale tips kunnen worden gekocht, dat bevat een interne houtskool stop. Dit voorkomt dat de xyleen uit het oplossen van een rubber componenten in de pipet. Als alternatief kan filteren tips worden gebruikt.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Paraffine verwijderen</p&gt;<ol&gt;<li&gt; In een fumehood, voeg 800 ul van xyleen (VWR, CABDH6216-4) om de gemerkte buis met uw exemplaar en leg ze op een rocker met een zacht schudden gedurende 5 tot 15 minuten om de paraffine te ontbinden.</li&gt;<li&gt; Pellet het monster door het draaien bij max. snelheid (14000 rpm of 16 000 xg) in een microcentrifuge gedurende 3 minuten. Voorzichtig te trekken van de xyleen supernatant en gooi in een polypropyleen buis ontdoen in de xyleen afval. Wees voorzichtig dat u de pellet te verstoren.</li&gt;<li&gt; Herhaal de xyleen wash de stappen 1 en 2until paraffine volledig is opgelost. Dit vereist gewoonlijk twee tot drie wasbeurten, afhankelijk van de grootte van het weefselmonster. Een volledig opgelost monster zal verschijnen zacht, en soms verliest zijn structurele integriteit. De integriteit van het monster kan voorzichtig worden beoordeeld met een pipet tip.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Ethanol rehydratatie</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Voeg 800 pi van 100% ethanol (v / v) moleculaire biologie kwaliteit ethanol, vortex, dan draaien gedurende 3 minuten bij 14.000 rpm in microcentrifuge. Verwijder de ethanol supernatant, zorg dat u de pellet te verstoren.</li&gt;<li&gt; Voeg 800 ul van 70% ethanol (100% (v / v) ethanol opgelost in gedestilleerd water (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vortex, en spin gedurende 3 minuten bij 14.000 rpm. Verwijder voorzichtig het supernatant ethanol.</li&gt;<li&gt; Voeg 800 ul van 50% ethanol (100% (v / v) ethanol opgelost in gedestilleerd water (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vortex, en spin gedurende 5 minuten bij 14.000 rpm. Verwijder voorzichtig zoveel ethanol mogelijk door pipetteren. Wees uiterst voorzichtig van de pellet te verstoren op dit moment zo volledig gerehydrateerd weefsel zal niet pellet evenals gedroogde weefsel.</li&gt;<li&gt; Na het verwijderen van het supernatant ethanol, drogen de pellet gedurende 5 minuten, zorg dat u meer dan drogen.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Tissue spijsvertering</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Voeg 200-500 pi Lysis Buffer (formule hieronder). Resuspendeer de pellet met behulp van een pipet tip of een vortex. Extra inspanning op dit punt om volledig opnieuw te schorsen het weefsel zal resulteren in een meer volledige vertering van het monster en een beter rendement van het DNA.</li&gt;<li&gt; Incubeer monsters bij 56 ° C in een waterbad of verwarming blokkeren.</li&gt;<li&gt; Voor weefsel kernen, spike 20 ul van proteïnase K (20 mg / ml bouillon oplossing, Invitrogen, AM2548), &#39;s morgens en&#39; s avonds.</li&gt;<li&gt; Herhaal bovenstaande stappen voor de spijsvertering 2 tot 5 dagen totdat het weefsel volledig is opgelost.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; Lysis Buffer</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8,0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt; 0,5% SDS</li&gt;<li&gt; 200 ug / ml proteinase K (voeg vlak voor gebruik)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. DNA schoon te maken</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Voeg een gelijk volume van de buffer verzadigd fenol (Fisher, BP1750I-400) en meng door inversie. Spin gedurende ten minste 5 minuten bij 14000 rpm in microcentrifuge.</li&gt;<li&gt; Breng de waterige laag naar een nieuwe buis. Let op de interfase: is er een veel witte materiaal?</li&gt;<li&gt; Herhaal de stappen 1 en 2 op de waterige fractie tot de interfase duidelijk is (meestal drie of meer keer). Voer terug extracties * wanneer de interfase is fuzzy tot de uiteindelijke rendement te verhogen.</li&gt;<li&gt; Zodra de interfase duidelijk is, voeg een gelijk volume van fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) de uitgepakte waterige fractie van uw monster. Mix gedurende 5 minuten en dan draaien gedurende 5 minuten bij 14.000 rpm. Thisreduces resterende fenol en verder de interfase verscherpt, het vergemakkelijken van extractie van de waterlaag</li&gt;<li&gt; De waterige laag op Verwijderen om een ​​nieuwe buis en treatwith RNase A bij 100 ug / ml gedurende 1 uur bij 37 ° C.</li&gt;<li&gt; Herhaal de stappen 1 tot 4 om alle resterende RNase A te verwijderen en de waterige fractie te verzamelen. Je moet alleen maar een of twee buffer verzadigde fenol stappen als er veel minder eiwit te verwijderen dan in het oorspronkelijke lysaat worden.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Om terug te voeren extracties toe te voegen 50-100 pl dH<sub&gt; 2</sub&gt; 0 aan de monsterbuis met de interfase en organische gedeelte. Keer de buis te mengen, en het monster draaien op 14.000 rpm in een microcentrifuge gedurende 5 minuten. Verzamel de waterfase en voeg deze toe aan de eerder verworven extractie met water. Ga verder terug extracties tot de interfase is duidelijk.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. DNA neerslag</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Schat de volume van uw verzamelde waterlaag.</li&gt;<li&gt; Voeg 1 / 10 van de volume van 3 M natriumacetaat pH 5,2 en een volume van 100% isopropanol (v / v) moleculaire biologie kwaliteit (of 2,5 volumes van 100% ethanol).</li&gt;<li&gt; Meng en zet op ijs of in een -20 ° C vriezer voor 30 minuten of &#39;s nachts.</li&gt;<li&gt; Spin op maximale snelheid (14000 rpm) bij 4 ° C in microcentrifuge gedurende 10 minuten</li&gt;<li&gt; Verwijder het supernatans.</li&gt;<li&gt; Was de pellet met 70% ijskoude ethanol om ongewenste zouten te verwijderen.</li&gt;<li&gt; Re-schorten de pellet in de buffer van keuze (meestal dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. DNA kwantificering</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Kwantificeer de concentratie van het DNA. De A260: A280-verhouding moet worden ~ 1.8. Voor kleine hoeveelheden DNA, is de meting met behulp van een spectrofotometer NanoDrop voorkeur.</li&gt;<li&gt; Na de kwantificering, gelelektroforese moeten worden uitgevoerd om de kwaliteit van uw DNA-monster te testen en te bepalen of besmetten RNA is volledig afgebroken.</li&gt;<li&gt; Hoge kwaliteit geëxtraheerde DNA is nu geschikt voor downstream-toepassingen, of kan worden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik. Als RNA is nog steeds aanwezig in de steekproef, herhaal dan de DNA schoon te maken en neerslag stappen, en opnieuw te kwantificeren en kwalificeren van de kwaliteit van uw monsters.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Biopsie of chirurgisch weggesneden weefsels voor histopathologische analyse en diagnose zijn vaak formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) voor lange termijn opslag. Met de groeiende belangstelling voor het begrijpen van de genetische basis van de ziekte, de mogelijkheid om DNA extraheren uit deze monsters is een onschatbare bron van diagnostisch materiaal dat gebruikt kan worden voor de genomische analyse en translationeel onderzoek. Historisch FFPE monsters werden niet beschouwd als een levensvatbare bron voor moleculaire analyse nucleïnezuren kunnen zwaar gemodificeerd door eiwit-nucleïnezuur en eiwit-eiwit verknoping 6. Echter, de ontdekking dat protease spijsvertering gefragmenteerde nucleïnezuren die geschikt zijn voor downstream-analyses waaronder PCR, array CGH, sequencing en methylering profilering releases, maakt het gebruik van deze waardevolle exemplaren voor genetische analyse 6. DNA-extractie van paraffine-ingebed weefsel is een deugdelijke procedure die is gebaseerd op differentiële oplosbaarheid aan DNA te zuiveren. Geëxtraheerde DNA kwaliteit en kwantiteit en het succes van de latere DNA-amplificatie is afhankelijk van een aantal parameters voor, tijdens en na de extractie. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot: type en de hoeveelheid weefsel, het type fixatief gebruikt voor weefsel behoud, de duur van de fixatie, de leeftijd van het paraffineblok en opslagcondities, evenals de lengte van het gewenste DNA-segment worden versterkt 1,7. Verwijdering van paraffine uit het weefsel is de meest kritische stap voor een succesvolle extractie als onopgelost paraffine leidt tot slechte kwaliteit staal en remming van de PCR-amplificatie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Xyleen </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1,7 ml SafeSeal Reactievaatjes </td><td> Sorenson BioScience </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 16M Reactievaatjes </td><td> LabNet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Lysis Buffer </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 ug / ml proteïnase K </td></tr><tr><td> Proteinase K Stock Solution </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Proteinase K Stock Solution </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buffer Verzadigde Fenol pH 6.6/7.9 </td><td> Visser </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Visser </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> 3M natriumacetaat pH 5,2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc in 80ml Aan te passen aan de pH 5,2 met ijsazijn Voeg dH 2 O tot 100 ml Autoclaaf </td></tr><tr><td> ND 3300 Spectrofotometer </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

dna-extractie van paraffine embedded materiaal voor genetische en epigenetische analyses

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Ziekte ontwikkeling en progressie worden gekenmerkt door frequente genetische en epigenetische afwijkingen waaronder chromosomale herschikkingen, aantal kopieën winsten en verliezen en DNA-methylatie. Vooruitgang in de high-throughput, genoom-brede profiling technologieën, zoals microarrays, hebben aanzienlijk verbeterd ons vermogen om te identificeren en op te sporen deze specifieke wijzigingen. Maar naarmate de technologie steeds beter, een beperkende factor blijft monster kwaliteit en beschikbaarheid. Bovendien, follow-up klinische informatie en ziekte uitkomsten worden vaak verzameld jaar na de eerste monster collectie. Monsters, zijn meestal in formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE), opgeslagen in het ziekenhuis archieven voor de komende jaren decennia. DNA kan efficiënt en effectief worden verhaald op paraffine ingebedde monsters als de juiste methode van extractie wordt toegepast. Hoge kwaliteit DNA geëxtraheerd uit goed bewaard en opgeslagen monsters kunnen ondersteunen kwantitatieve bepalingen voor vergelijkingen van normale en aangetaste weefsels en genereren van genetische en epigenetische handtekeningen 1. Voor het extraheren van DNA uit paraffine-ingebed monsters weefsel kernen of gemicrodissecteerde weefsel worden onderworpen aan xyleen behandeling, die de paraffine uit het weefsel oplost, en vervolgens gerehydrateerd met behulp van een reeks van ethanol wasbeurten. Eiwitten en schadelijke enzymen zoals nucleasen worden vervolgens verteerd door proteïnase K. De toevoeging van lysis buffer, die denaturerende middelen zoals natriumdodecylsulfaat (SDS) bevat, bevordert de spijsvertering 2. Nucleïnezuren worden gezuiverd uit het weefsel lysaat met behulp van buffer-verzadigde fenol en een hoge snelheid centrifugeren, die een bifasische oplossing genereert. DNA en RNA te blijven in de bovenste waterige fase, terwijl de eiwitten, lipiden en polysachariden worden afgezonderd in de inter-en organische-fase respectievelijk. Behoud van de waterige fase en herhaalde fenol extracties genereert een schoon monster. Naar aanleiding van fenol extractie, wordt RNase A toegevoegd aan besmettelijke RNA te elimineren. Extra fenol extracties na incubatie met RNase A worden gebruikt om de resterende enzym te verwijderen. De toevoeging van natriumacetaat en isopropanol precipitaten DNA, en de hoge snelheid centrifugeren wordt gebruikt om de DNA-pellet en vergemakkelijken isopropanol verwijdering. Overtollige zouten over van neerslag uitgevoerd kunnen interfereren met de volgende enzymatische assays, maar kan worden verwijderd uit het DNA door wassen met 70% ethanol, gevolgd door centrifugatie opnieuw pellet het DNA 3. DNA wordt opnieuw gesuspendeerd in gedestilleerd water of de buffer van keuze, gekwantificeerd en opgeslagen bij -20 ° C. Gezuiverde DNA kan vervolgens worden gebruikt in downstream toepassingen die omvatten, maar zijn niet beperkt tot, PCR, array comparative genomic hybridisatie 4 (array CGH), gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie (MeDIP) en sequencing, waardoor een integratieve analyse van weefsel / tumor monsters.

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Ziekteontwikkeling en -progressie worden gekenmerkt door frequente genetische en epigenetische aberraties, waaronder chromosomale herschikkingen, kopie-aantal...

In deze video wordt gedemonstreerd hoe DNA kan worden geëxtraheerd uit in paraffine ingebedde weefselmonsters. Het monster dat in deze demonstratie wordt gebruikt, is een weefselkern met een diameter van drie millimeter en een lengte van zes millimeter. Hoewel in deze demonstratie één enkele kern wordt gebruikt, kunnen grotere monsters van meer dan vijf millimeter in diameter en 10 millimeter in lengte, of twee tot drie kernen van de hier gebruikte grootte, in één enkele reactie worden verwerkt.Het is echter belangrijk om op te merken dat aanpassingen aan het protocol mogelijk vereist zijn om de volledige verwijdering van paraffine en de weefseldigestie te garanderen. Voordat er iets met het weefsel kan worden gedaan, moet de wasachtige paraffine die het weefsel conserveert, worden opgelost. Dit wordt bereikt door het gebruik van xyleen, aangezien xyleen en fenol toxisch zijn. Al het werk met deze chemicaliën moet in een zuurkast worden uitgevoerd; voeg 800 µL xyleen toe aan de buis met uw monster.Plaats het monster vervolgens gedurende 10 minuten op een rocker met een zachte schudbeweging. Centrifugeer het monster 3 minuten lang bij 14.000 RPM om het monster te pelletteren, verwijder daarna het xyleen en los de paraffine uit de buis op. Herhaal deze stappen twee of drie keer totdat de paraffine volledig is opgelost.Het weefsel moet er nat en zacht uitzien. Het is belangrijk om alle paraffine te verwijderen om de uiteindelijke DNA-opbrengst te verhogen. Daarom zijn voor grotere weefselmonsters meer wasbeurten nodig.Nu de paraffine uit het monster is verwijderd, moet het weefsel opnieuw worden gehydrateerd om weefseldigestie mogelijk te maken. Dit wordt bereikt met een ethanol-rehydratieserie. Voeg eerst 800 µL 100% ethanol toe aan het monster, vortex dit en centrifugeer het monster gedurende drie minuten bij 14.000 RPM.Verwijder het supernatant. Herhaal deze stappen met 800 µL 70% ethanol en vervolgens met 50% ethanol. De laatste centrifugatiestap moet vijf minuten duren, omdat het weefsel minder solide is en meer kracht vereist om een pellet te vormen.Nu moet het weefsel worden gedigesteerd om het DNA uit de cellen vrij te maken. Dit gebeurt met behulp van lysisbuffer, een oplossing bestaande uit eiwitdenaturen, zoals SDS en proteinase K, het enzym dat verantwoordelijk is voor de degradatie van het weefsel.Voeg 200 tot 500 µL lysisbuffer toe aan het monster. Afhankelijk van de grootte is 400 µL een geschikt volume. De componenten van de lysisbuffer en de incubatietemperatuur van 56 °C dienen uiteraard om de activiteit van het eiwit te maximaliseren.Omdat ACE K een eiwit is, kan ACE K weefsel slechts gedurende een bepaalde tijd afbreken; er moet periodiek meer enzym worden toegevoegd om de reactie voort te zetten. Er worden ochtend en avond 20 µL protein ACE K met een concentratie van 10 mg/mL aan het monster toegevoegd totdat het weefsel volledig is opgelost.Wanneer er geen vast weefsel meer zichtbaar is, moet het DNA uit de buffer met celresten worden geëxtraheerd. Verzadigd fenol wordt gebruikt om het monster te scheiden in een waterige en een organische fase. De waterige fase bevat het DNA.Het is belangrijk om buffersverzadigd fenol te gebruiken, omdat de zuurgraad van normaal fenol niet alleen uw DNA degradeert, maar ook de gelaagdheid van de waterige en organische fasen omkeert. Houd er rekening mee dat buffersverzadigd fenol in twee fasen wordt bewaard, waarbij het fenol de onderste laag vormt.Voeg een gelijk volume bufferverzadigd fenol toe aan het monster en keer de buis meerdere keren om. Plaats het monster vervolgens in de centrifuge en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 14,000 RPM om fasescheiding op te wekken.Het DNA en RNA bevinden zich in de bovenste waterige fase, terwijl eiwitten, lipiden en polysachariden zich in de interfase en de onderste organische fase bevinden. Verwijder voorzichtig de waterige laag zonder de interfase te verstoren en breng deze over in een nieuwe buis. Vaak is de interfase na de eerste centrifugatie los en instabiel.Extracties moeten worden uitgevoerd met kleine volumes water. Het protocol voor tegenextracties is te vinden in de tekst bij deze video. Herhaal deze stappen totdat de interface helder is, wat gewoonlijk na drie tot vijf herhalingen wordt bereikt; ga verder door een gelijk volume fenol-chloroform-isoamylalcohol aan het DNA-monster toe te voegen.Dit dient hetzelfde doel als fenol alleen, maar verscherpt de interface om de opbrengst van DNA te maximaliseren. Herhaal deze procedure één of twee keer totdat de interface helder en scherp is. Nu uw monster eiwitvrij is, moet eventueel contaminerend RNA worden verwijderd.Dit wordt bereikt door RNA's. Een RNA-degradatie-enzym A wordt aan het monster toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 µg/ml, waarna het monster één uur wordt geïncubeerd bij 37 °C. Nu het RNA is gedegradeerd, moet het RNAA-enzym worden verwijderd.De procedure voor het zuiveren van het DNA wordt herhaald zoals voorheen. Door eerst met buffer-verzadigd fenol te werken en vervolgens over te gaan op fenol-chloroform-isoamylalcohol, zijn er minder zuiveringsstappen nodig, aangezien de enige contaminatie nu het RNA A-enzym en het gedegradeerde RNA zijn. Nu het monster alleen DNA bevat, moet het DNA uit de oplossing worden geprecipiteerd; voeg hiervoor één tiende van het volume natriumacetaat en één volume isopropanol toe.Als alternatief kunnen tweeënhalve volume ethanol worden toegevoegd, maar is er dan een grotere buis nodig. Incubeer het monster bij -20 °C gedurende 30 minuten tot een uur, of indien u laat in de avond werkt, gedurende de nacht. Aangezien u nu met DNA werkt, dient u ervoor te zorgen dat het monster op ijs blijft om degradatie te voorkomen.Centrifuge het monster 10 minuten bij 14.000 RPM bij vier graden Celsius om het neergeslagen DNA te pelletteren. Verwijder het supernatant zorgvuldig, zonder de pellet te verstoren, om overtollige zouten te verwijderen die latere experimenten zoals sequencing kunnen beïnvloeden. Voeg bijvoorbeeld 1 ml gekoelde, 70% ethanol toe en resuspendeer het monster voorzichtig.Centrifuge het monster opnieuw bij 14,000 RPM gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat eventueel overtollig ethanol tot vijf minuten aan de lucht drogen. Het is belangrijk om het monster niet te overdrogen.Ten slotte wordt het DNA gezuiverd en is het klaar om opnieuw opgelost te worden in de buffer naar keuze. Hier maken we gebruik van autoclaaf-gedestilleerd water. Dat is alles.Bewaar DNA-monsters bij -20 °C voor later gebruik. Nadat de extractie is voltooid, moet u de kwaliteit en kwantiteit van uw DNA beoordelen. Dit gebeurt via spectrometrie waarbij u de NanoDrop 2000 gebruikt; stel het meettype in op nucleïnezuren, selecteer DNA 50 als berekening en initialiseer het instrument met 1,5 µL water.Reinig het voetstuk en voer een blanco meting uit met 1,5 µL verdunner. In dit geval gedestilleerd water. Reinig het voetstuk, breng 1,5 µL monster aan en druk op meten. Ja. Uitstekend.Een A260/A280-ratio van 1,8 is op dit punt ideaal. Uw DNA is klaar voor gebruik in downstream-applicaties, waaronder maar niet beperkt tot: arrays, comparatieve genomische hybridisatie, methylatie-specifieke DNA-immunoprecipitatie en sequencing.De links naar deze protocollen worden hier getoond, indien ze niet onmiddellijk nodig zijn. Bewaar uw monsters bij -20 °C voor later gebruik.

dna-extraction-from-paraffin-embedded-material-for-genetic-epigenetic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

In this video, we demonstrate the processing of FFPE or formalin-fixed paraffin-embedded sections obtained from gastrointestinal tumor tissue. The deparaffinization and rehydration steps allow the processing of the tissue specimen for subsequent analytical applications.

Deparaffinization and Rehydration of Tissue Sections: A Two-step Procedure to Remove Paraffin Wax from FFPE Tissue Slides Followed by Tissue Rehydration

De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Een protocol wordt gepresenteerd te verzamelen en te ontsmetten permafrost kernen van de bodem en ijs. De afwezigheid van exogeen DNA kolonies en suggereren dat microorganismen gedetecteerd vertegenwoordigt de theorie en minder contaminatie door boren of verwerking.

Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek

Deze gewijzigde extractie protocol verbetert RNA en DNA opbrengst van meer doelgerichte regio's van belang in histopathologische weefsel blokken.

Bereiding van formaline gefixeerde paraffine-ingebed weefsel Cores voor zowel RNA en DNA-extractie

Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Dit protocol presenteert een methode om het percentage tumorgehalte van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefselmonsters te verhogen.

Tumorinhoud verbeteren door tumormacrodissectie

Dit protocol maakt efficiënte histonextractie uit verschillende klinische monsters mogelijk voor latere posttranslationele modificatieanalyse door LC-MS/MS. Door robuuste detectie van belangrijke histonmodificaties te faciliteren, dient het als een waardevol hulpmiddel voor uitgebreide epigenetische profilering in grote klinische cohorten.

Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol om de isolatie van zeldzame kankercellen uit een geconstrueerd monster met volbloed en spiked in longkankercellen te illustreren. Het protocol maakt gebruik van een semi-geautomatiseerd, labelvrij celisolatieplatform. Verrijkte cellen worden vervolgens geanalyseerd op mutaties in de epidermale groeifactorreceptor met behulp van druppeldigitale PCR.

Profilering van epidermale groeifactor-DNA-mutaties in circulerende zeldzame cellen met behulp van een celisolatiesysteem en druppeldigitale PCR

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Leer DNA-extractie uit formaline-gefixeerde paraffine-ingebette weefsels voor genetische en epigenetische analyses. Dit protocol gebruikt xyleen, proteïnase K en fenol-chloroform voor hoogwaardige DNA-isolatie.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Meer video's verkennen