Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen en behouden van een natuurlijk infectiemodel voor *H. curcurus*. Eerst worden muizen via orale gavage geïnfecteerd met *H. curcurus*-eieren. 21 dagen later worden de geïnfecteerde dieren geëuthanaseerd en worden bloed, mesenteriale lymfeklieren, fecespellets, colons en milt geoogst.

Met behulp van deze monsters kan de immuunrespons die is opgewekt tegen tricks. Mirrors worden geanalyseerd. Serummonsters kunnen via ELISA worden geanalyseerd om TRA-specifieke antilichamen te detecteren.

In vitro restimulatie van lymfeknoocellen kan worden uitgevoerd om cellulaire immuunresponsen te analyseren. Fecale pellets kunnen via Western blot worden gebruikt voor de bepaling van het eiwitgehalte, en genexpressieanalyse kan worden uitgevoerd door middel van QPCR-analyse van het colon. Tot slot kan de tip van het caecum worden gebruikt voor histologie, terwijl de rest van het caecum kan worden gebruikt om de wormlast bij geïnfecteerde muizen te bepalen.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen of een muis resistent of vatbaar is voor een infectie met trais MOUs, en kan de immuunrespons die tegen de parasiet wordt opgebouwd worden gekarakteriseerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals welke factoren de activering van T-helpercellen beheersen, en welke eiwitten vereist zijn voor de differentiatie van TH2-cellen. Trauss MOUs-eieren kunnen worden vermeerderd in immuundeficiënte muizen of genetisch vatbare stammen zoals een KR; 35 dagen na infectie kunnen de eieren worden geoogst uit geëuthanaseerde muizen.

Leg de ventrale zijde van het dier bloot en spoel de buik van de muis met ethanol met behulp van steriele pincetten en een schaar. Pak de huid van de buik vast en maak een kleine incisie. Leg de inhoud van de buikholte bloot, identificeer het cecum en het proximale colon, en verwijder deze vervolgens.

Breng de organen over naar een Petrischaal van 10 centimeter met door penicilline en streptomycine aangevuld DMEM. Snijd vervolgens het cecum en het proximale colon open, waarbij het lumen en de wormen met een pincet worden blootgelegd. Plaats de geopende organen in een bekerglas met PBS en schud voorzichtig om de feces weg te wassen.

Zodra het caecum is gewassen, brengt u het over naar een schone Petrischaal en gebruikt u gladde, gebogen pincetten om de wormen voorzichtig te verwijderen. Breng alle wormen van elke muis over naar één putje van een six-well plaat die vijf milliliter met antibiotica aangevuld DMEM bevat. Plaats de six-well plaat samen met een vochtig papieren handdoekje in een Tupperware-bakje en incubeer dit gedurende vier uur bij 37 °C om de wormen de gelegenheid te geven eieren te leggen.

Gebruik na deze incubatie een pincet om de wormen uit het oorspronkelijke putje te verwijderen en verdeel ze over twee nieuwe putjes met DMEM. Door de wormen op deze manier te verdelen, wordt het herstel van eieren met een pipet gemaximaliseerd. Oogst het resterende medium met het uitgescheiden antigeen en de eieren uit het oorspronkelijke putje en breng dit over naar een Falcon-buis van 15 milliliter.

Centrifugeer de buis bij 3000 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant dat het vier uur oude antigeen bevat en bewaar dit, en resuspendeer het pellet in steriel water. Plaats de zeswellplaat met de wormen opnieuw bij 37 °C en incubeer deze overnacht tot de volgende ochtend.

Nadat de wormen zijn verwijderd, oogst u de inhoud van de putjes zoals eerder beschreven en centrifugeert u het supernatant om de eieren te isoleren. Bewaar het supernatant dat het overnight-antigeen bevat en resuspendeer de eieren in water. Combineer deze eieren, zoals eerder gedaan, met de eieren die zijn verkregen uit de incubatie van vier uur.

Filter de eieren door een zeef van 70 micron om eventuele overgebleven wormen te verwijderen. Breng ze vervolgens over naar een vierkante kolf van 75 centimeter. Bedek de kolf met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen en bewaar de eieren zes weken lang bij kamertemperatuur.

Dit stelt de eitjes in staat om na zes weken te rijpen en te embryoneren. Was de eitjes, giet het water af en tel de levensvatbare eitjes. Hier te zien.

Als voorbeeld van een levensvatbaar geëmbryoneerd ei en een niet-levensvatbaar ei, buigt Reese de Exeter-concentratie van 50 per 50 µL. Op dit punt kunnen de eieren worden bewaard bij 4 °C voordat de muizen worden geïnfecteerd. Zorg ervoor dat de ei-bevattende oplossing grondig wordt opgeschud.

Breng de gewenste hoeveelheid inoculum over in een snap cap buis van 14 milliliter en keer de buis om om te mengen. Trek 200 microliters eieren op in een voedingsnaald van passende grootte voor de grootte van het dier, bevestigd aan een spuit van één milliliter. Pak de muis in de nekvelhuid en dien de eieren toe via orale gavage.

Plaats de geïnfecteerde muis terug in de kooi en laat de infectie 21 dagen voortschrijden. Na 21 dagen wordt het bloed van de geïnfecteerde muizen geoogst via een hartpunctie met een niet-gehepariniseerde spuit. Na euthanasie met koolstofdioxide kunnen de bloedmonsters worden bewaard bij 4 °C.

Voor de isolatie van serum en de analyse van tra-specifieke IgGs en IgE via ELISA. Leg de buikholte van de muis vrij zoals eerder beschreven. Gebruik vervolgens een pincet om het caecum met een schaar of een tweede pincet naar buiten te trekken.

Duw de dunne darm naar rechts om de mesenteriale lymfeklieren bloot te leggen. Verwijder de lymfeklieren voorzichtig, waarbij u erop let dat u de darmen niet doorsnijdt, en plaats deze in een Falcon-buis van 15 milliliter met twee milliliter medium. Lymfekliercellen kunnen later in vitro worden gestimuleerd met supernatant van antigen S uit de wormculturen na vier uur om de cellulaire immuunrespons op de parasiet te analyseren.

Zodra de lymfeklieren zijn geoogst, exciseert u het caecum en het colon zoals eerder beschreven. Gebruik een pincet om fecespellets uit het distale colon te verwijderen en plaats deze in een 2 mL zuurstofbuis; pellets kunnen worden bewaard bij -20 °C en via western blot worden geanalyseerd op eiwitgehalte. Knip met een schaar ongeveer 1 cm van het proximale colon af en plaats dit in een buis met RNA-stabilisator. Bewaar dit vervolgens bij 4 °C.

Snijd ongeveer vijf millimeter van de punt van het caecum af terwijl u de punt van het caecum met een pincet vasthoudt. Gebruik een spuit van drie milliliter en een naald van 22 gauge om het monster door te spoelen met PBS. Draag het vervolgens over naar een flk-buis met klikdop van vijf milliliter die 4%paraldehyde bevat.

Het met paraldehyde gefixeerde blindedarmsample kan worden bewaard bij vier graden Celsius en gebruikt worden voor histologische analyse. Plaats het resterende deel van de blindedarm in een Petrischaal en vries dit in bij minus 20 graden Celsius om de wormen te doden. Voor een eenvoudigere telling van de wormen wordt de blindedarm ontdooid en met een schaar in een Petrischaal met ongeveer vijf milliliters water geplaatst.

Snijd het caecum open om het lumen bloot te leggen en schud dit om de feces in een schaaltje te verzamelen. Plaats het schone caecum in een nieuwe Petrischaal met water en gebruik gladde, gebogen pincetten om de epitheelcellen van de darm af te schrapen. Verplaats het caecum naar een nieuwe Petrischaal met water en scheur het weefsel in kleine stukjes.

Observeer de feces, darmepitheelcellen en het caecumweefsel onder een dissectiemicroscoop en tel de wormen; verwijder deze tijdens het tellen en plaats ze in een schone schaal. Zo zouden de wormen in het caecum eruit moeten zien voor en na isolatie, zoals hier getoond. Na infectie zijn tragus mirrors black six-muizen in staat om de parasieten te beheersen, terwijl KR-muizen een verhoogde parasitaire last ontwikkelen.

Eveneens vatbare AKR-muizen ontwikkelen, zoals bepaald via serum-ELISA, merkbaar hogere TRA-specifieke IgG2a-titers dan C57BL/6-muizen. In dit experiment onthulde Western blot-analyse dat de hoeveelheid gobletcel-specifiek eiwit RelMβ verhoogd was in de feces van C57BL/6-muizen, maar niet in AKR-muizen na infectie. Histologische analyse van het distale caecum toont gobletcelhyperplasie en mucusproductie in resistente TRA-muizen en geïnfecteerde C57BL/6-muizen, maar niet in vatbare AKR-muizen.

Na het bekijken van deze video moet u een goed inzicht hebben in het vermeerderen van trismus-eieren, het infecteren van experimentele muizen en het oogsten van het darmweefsel, het mesenterium, de enterische lymfeklieren en bloed voor de analyse van de infectie in vatbare of resistente muizen.