Name: Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer mitofagie monitoren in gist met fluorescentiemicroscopie en de Mt Rosea pH-biosensor. Deze methode visualiseert mitochondriële opname in vacuolen en biedt inzicht in autophagieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Australische Research Council Grant DP0986937.

Het selecteren van geschikte controle giststammen De test is gebaseerd op de experimentator visuele evaluatie van de accumulatie van rode fluorescentie in de gist vacuole. Als zodanig is de assay is subjectief en afhankelijk van de selectie van geschikte stammen controle-en groei-omstandigheden. Een wilde soort controle wordt gebruikt om de niveaus van autofagie normaal te verwachten aan te geven. Als een negatieve controle een stam null voor de expressie van een van de belangrijkste autofagie genen (bijv. ATG3) is geschikt, deze stammen niet kan leveren materiaal (bijvoorbeeld, mitochondria, nucleus) naar de vacuole 1. Transformatie van gistcellen met plasmide-DNA Gistcellen kunnen gemakkelijk worden gemaakt bevoegd voor transformatie door behandeling met LiAcetate. Commerciële kits kunnen worden gekocht (bijvoorbeeld EasyComp, Invitrogen) en de gepubliceerde protocollen zijn beschikbaar 13. In dit protocol gebruiken we wild-type stam BY4741 (MAT een his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), en enkele leden van een uitgebreide bibliotheek van deletie mutant stammen (bijv. Δ atg3) ontleend, ontbreekt elke uiting van een ander niet-essentiële genen. De verwijdering stam bibliotheek is een waardevol instrument voor het onderzoek van autofagie gebruik van Rosella-gebaseerde probes. De verslaggever die in dit protocol is mt-Rosella voor de mitochondriën (Fig. 2A), gecodeerd door pAS1NB: mt-Rosella 12. De volgende stappen zijn gebaseerd op het gebruik van cellen gemaakt met behulp van de bevoegde EasyComp Transformation Kit en bevroren opgeslagen bij -80 ° C voor gemakkelijk gebruik. <ol><li> Equilibreren Solution III (EasyComp Transformation Kit) op kamertemperatuur 30 minuten voor het toevoegen aan gistcellen. </li><li> Voeg 2 tot 2,5 pl (~ 100 ng / ul) van plasmide DNA dat codeert voor de verslaggever (pAS1NB: mt-Rosella) om een ​​steriele 1,7 ml snap-cap plastic microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 5 ul van vers ontdooide opschorting van de bevoegde gistcellen en meng beide door behoedzame pipetteren. </li><li> Voeg 50 ul van Solution III (EasyComp Transformation Kit) en vortex te mengen. 1.5) Incubeer de transformatie reacties gedurende 1 uur bij 28-30 ° C met een krachtig mengen elke 15 minuten met behulp van een vortex-mixer of handmatig door flicking de buis met de vinger. </li><li> Breng voorzichtig de transformatie mengsel tot een YMM agar groeischijf aangevuld met histidine, methionine en uracil, en zachtjes de cellen te verdelen over het oppervlak van de agar met een steriele glazen strooier. Gistcellen zijn kwetsbaar in dit stadium en zachte behandeling kan de opbrengst van de transformanten te verhogen. </li><li> Incubeer groeischijven voor 2 tot 4 dagen bij 28-30 ° C of totdat kolonies verschijnen ongeveer 2-3 mm in diameter. </li></ol> 2. Bevestiging van de expressie van Rosella in gistcellen Alvorens gedetailleerde experimenten de juiste lokalisatie en efficiënte werking van de Rosella moet worden bevestigd. <ol><li> Met behulp van steriel tandenstokers te selecteren voor elke stam vijf afzonderlijke kolonies van de transformatie plaat en resuspendeer cellen in 50 ul steriel water in aparte steriele 1,7 ml snap-cap plastic microcentrifugebuis. </li><li> Plaats 10 pi van elke celsuspensie op aparte label glazen objectglaasjes (76 x 26 mm) en dekking van de celsuspensie met een vierkante dekglaasje (22 x 22 mm). </li><li> Die onverwijld onderzoekt de cellen voor fluorescentie-emissie met behulp van een fluorescentie microscoop (bijv. Olympus Fluoview FV500). Kijk voor sterke groene en rode fluorescentie en de etikettering van mitochondriaal typische lokalisatie (Fig. 2B en 2C). </li><li> De rest van elke kolonie onderzocht fluorescentie op deze manier moet worden geënt op een frisse YMM groeischijf. </li><li> Incubeer de platen bij 28-30 ° C gedurende 2 dagen totdat kolonie zijn ongeveer 2-3 mm in diameter. </li></ol> 3. Celgroei en inductie van autofagie Autofagie kan worden opgewekt met behulp van een aantal verschillende experimentele condities, inclusief toegang tot stationaire fase, verandering in de koolstofbron, toediening van rapamycine, of stikstof honger. We routinematig gebruik van stikstof honger als de methode om mitophagy induceren. <ol><li> Inoculeren een enkele kolonie in 10 ml groeimedium met ethanol en de juiste auxotrofe supplementen. </li><li> Incubeer gistculturen bij 28-30 ° C met een orbitale schudden (200 rpm) gedurende ongeveer 48 uur. De cellen moeten in het midden-log groeifase. </li><li> Pellet cellen van dubbele 1 ml monsters van de cultuur in steriele 1,7 ml snap-cap plastic centrifugebuis door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatant en gooi zonder de cel pellet. </li><li> Was de cellen drie keer met 1 ml steriel gedistilleerd water door resuspensie gevolgd door centrifugeren om de resterende m te verwijderenedium. </li><li> Na de derde wasbeurt de cellen opnieuw in suspensie in 100 ml groeimedium of stikstof-honger medium. </li><li> Re-beënten de geresuspendeerde cellen in 10 ml vers groeimedium of 10 ml stikstof-uithongering medium. Incubeer met een orbitale schudden voor 6-12 uur de inductie van mitophagy mogelijk te maken. Na de honger te bereiden cellen voor het bekijken van fluorescentie microscopie. </li></ol> Let op: Etikettering van de vacuole met CMAC-Arg Bij de eerste test van de oprichting is het nuttig om te bevestigen onder de fluorescentie microscoop levering van Rosella naar de vacuole. Hoewel de gist vacuole is een groot organel waarvan de locatie kunnen vaak eenvoudig worden bepaald door verwijzing naar de toegezonden lichtbeelden, in sommige stammen van gist en onder bepaalde omstandigheden de groei van de vacuole kan versnipperd en moeilijk te lokaliseren. De vacuole kan gemakkelijk worden geëtiketteerd met een coumarine-based vacuole kleurstof, zoals CMAC-Arg (7-amino-4-chloromethylcoumarin, L-arginine amide). De werking van de vacuole proteasen op de kleurstof resultaten in helder blauwe fluorescentie etikettering van de vacuole. De blauwe emissie kan gemakkelijk worden onderscheiden van de rode en groene uitstoot van Rosella 11. Labeling met CMAC-Arg hoeft niet routinematig worden uitgevoerd, maar het wordt aanbevolen voor diegenen die niet vertrouwd zijn met de locatie en het uiterlijk van de vacuole in gist. 4. Etikettering van de vacuole met CMAC-Arg <ol><li> Voeg de CMAC-Arg (100 mM uiteindelijke concentratie) om aan de groeiende of stikstof-uitgehongerd cellen voorafgaand aan de beeldvorming. De CMAC-Arg oplossing kan worden bereid op voorhand, maar als de oplossing is lichtgevoelig het moet worden beschermd tegen blootstelling aan licht. </li><li> Incubeer bij 28-30 ° C met een orbitale schudden (200 rpm) gedurende 30 minuten. </li><li> Pellet-cellen door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Giet het supernatans af. </li><li> Was de cellen drie keer met steriel gedistilleerd water door resuspensie gevolgd door centrifugeren om resten van het medium en overtollige CMAC-Arg kleurstof te verwijderen. </li><li> Monteer de cellen voor beeldvorming zoals hieronder beschreven. </li></ol> 5. Montage van levende gistcellen voor de confocale laser scanning microscopie (CLSM) <ol><li> Smelt 2 mg van een laag smeltpunt agarose in afzonderlijke 1 ml aliquots groeimedium en stikstof-honger medium door incubatie bij 70 ° C. Het gesmolten agarose wordt gehandhaafd op 70 ° C. </li><li> Voorzichtig pellet de cellen in 1 ml porties van elk celkweek door centrifugatie bij 2000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant. </li><li> Was de cellen drie keer met 1 ml steriel gedistilleerd water door resuspensie en centrifugering zoals in stap 5.2. </li><li> Resuspendeer de gewassen cellen in 100 ul steriel gedistilleerd water. </li><li> Naar de cellen ter plekke 20 ul van gesmolten agarose monteren op een gelabelde glazen microscoopglaasje (76 x 26 mm). </li><li> Onmiddellijk spot 10 ul van de gewassen celsuspensie op het agarose bed. </li><li> Bedek de agarose bed met een dekglaasje (22 x 22 mm). De cellen zullen verspreid over de agarose oppervlak onder het dekglaasje. </li><li> Om uitdroging te voorkomen en de beweging van het dekglaasje tijdens de beeldvorming voorzichtig de randen van dekglaasje met een dunne film van nagellak. </li><li> Wanneer de nagellak volledig droog is (10 min) van de schuif is klaar om te bekijken door middel van fluorescentie microscopie Let op: nagellak kan schade veroorzaken aan microscoop doelstellingen. </li><li> Cellen gemonteerd met behulp van deze techniek kunnen worden waargenomen tot 1 uur na montage. </li></ol> 6. Visualiseren met behulp van autofagie CLSM Het niveau van autofagie in een populatie van cellen wordt routinematig beoordeeld door het bepalen van het aantal cellen met rode vacuolaire fluorescentie voor en na de inductie van autofagie. Idealiter zou de progressie van autofagie wordt toegezien op geselecteerde tijdstippen na inductie van autofagie (afb. 3). Dit wordt het best uitgevoerd door visualiseren door de microscoop verrekijker. Het is belangrijk dat de juiste controles worden toegepast (bijvoorbeeld Δ atg3 mutant) en dat de microscoop instellingen blijven onveranderd tussen het observeren van verschillende monsters (bijvoorbeeld het gebruik van neutrale dichtheid filters, filter selectie). Gistcellen zijn relatief klein die een goede kwaliteit fluorescentie microscoop (bijv. Olympus Fluoview FV500) zijn uitgerust met excitatie / emissie van geschikte filters voor de afzonderlijke visualisatie van GFP en / of pHluorin (groen fluorescentie-emissie) (FITC filter) en DsRed.T3 (rood fluorescentie-emissie) (TRITC filter). <ol><li> Met behulp van een 60x water objectief beeld niet-uitgehongerd wild-type cellen met behulp van afwisselend de FITC en TRITC filters. Wild-type cellen zou moeten vertonen een typische cellulaire verdeling van de mitochondriën aan de rand van de cellen die zowel de rode en groene fluorescentie vertonen. Merk op dat deze verdeling van de mitochondriën is afhankelijk van de pinhole instelling van de confocale microscoop. Wij gebruiken over het algemeen een lagere pinhole waarde van 125 um die alleen kan de mitochondria in acht te nemen als een reeks van punten gelokaliseerd aan de rand van de cel (Fig. 2C), zodat de vacuole niet is 12 verduisterd. Als een hoog pinhole waarde van (200 micrometer) wordt gebruik gemaakt van deze laat de typische filamenteuze mitochondriale netwerk verspreid over het hele cel (en de veranderingen die het ondergaat), in acht te nemen 11. Geen enkele andere structuren in de cel moet fluorescent worden geëtiketteerd. </li><li> Volgorde weergeven cellen voor elk van de tijdstippen na de overdracht tot verhongering medium. Visualiseer afwisselend gebruik van de groene en rode emissie filters. Op de 6 h honger tijdstip rode fluorescentie, maar geen overeenkomstige groen-uitstoot moet herkenbaar zijn in de vacuole. Vacuolaire lokalisatie kan afzonderlijk worden bevestigd met behulp van CMAC-Arg (fig. 2C). Bekijk ~ 200 cellen en tel het aantal dat alleen rode fluorescentie in de vacuole (dat wil zeggen vacuolaire opname van mitochondria) te tonen. </li><li> Count vacuolaire accumulatie voor alle tijdstippen observeren&gt; 200 cellen en dan plot percentage cellen met vacuolaire accumulatie. </li><li> Onderzoek autofagie-negatieve controle cellen die mt-Rosella voor de honger en na 6 uur honger. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Hier tonen we typische resultaten verkregen met behulp van mt-Rosella, uitgedrukt in wild type en Δatg3 mutant cellen. Onder toenemende voorwaarden met ethanol als koolstofbron, zowel wild type en Δatg3 mutant cellen vertonen een cellulaire verdeling van de fluorescentie (rood en groen) typisch voor mitochondria in gistcellen. Rode en groene fluorescentie emissie wordt niet gedetecteerd in de vacuole (Fig. 2B en 2C). Wanneer het wordt blootgesteld aan honger stikstof gedurende 6 uur en verder dan, naast de rode en groene fluorescentie die overeenkomt met mitochondriën, wild-type cellen vertonen ook de ophoping van rood, maar niet groen fluorescentie in het vacuolaire lumen (Fig. 2B;. Fig 3) . Echter, in Δatg3 mutantcellen noch rood, noch groen fluorescentie accumuleert in de vacuolaire lumen (Fig. 2C;. Afb. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Top, regeling van organellen en compartimenten in een gistcel. Bottom, een vacuole-centric weergave van een gistcel wordt gepresenteerd met vermelding van Autofagie afbraak van de verschillende organellen en compartimenten. Sommige van de verschillen tussen de verschillende organel-specifieke vormen van autofagie (bijvoorbeeld mitophagy, nucleophagy) omvatten de specificiteit (vracht selectie) van de overspoeld inhoud, verschillende intracellulaire behoeften en extracellulaire signalen (bijvoorbeeld honger, schade), specifieke signalen, ATG genen en tijd afhankelijkheid. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figuur 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2a"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figuur 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2b"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figuur 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2c"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figuur 2D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2d"> Figuur 2. (A) Schematische weergave van mt-Rosella. Het mitochondriale leader sequentie (in dit geval van citraat synthase) wordt gebruikt om de Rosella biosensor doelstelling om de mitochondriale matrix. Excitatie en emissie maxima voor zowel rood fluorescerend eiwit (DsRed.T3) en groen fluorescerend eiwit (pHluorin) worden aangegeven. Bij een hoge pH (pH mitochondriale ~ 8.2) van de biosensor fluoresceert zowel rood en groen, maar bij een lage pH (pH van de vacuole ~ 5.5) het fluoresceert alleen maar rood. (B) Schematische weergave van de verwachte resultaten in het wild type en Δ atg3 mutant cellen die mt-Rosella. (C) De werkelijke resultaten verkregen door het CLSM voor wild-type cellen onder groeien en stikstof honger voorwaarden. Van links naar rechts:. DIC (verschil in contrast), RFP (DsRed.T3) fluorescentie-emissie, GFP (pHluorin) fluorescentie-emissie, CMAC-Arg fluorescentie en samen te voegen image (D) Werkelijke resultaten die zijn verkregen door middel van fluorescentie microscopie voor Datg3 mutant cellen onder groeien en stikstof honger voorwaarden. Van links naar rechts: DIC (verschil in contrast), RFP (DsRed.T3) fluorescentie-emissie, GFP (pHluorin) fluorescentie-emissie, CMAC-Arg fluorescentie en samenvoegen beeld. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Het percentage van de wild-type en Δ atg3 mutantcellen uitdrukken en mt-Rosella en gegroeid onder stikstof honger, waaruit rode fluorescentie in de vacuole over een tijdsverloop van 48 uur. Het percentage cellen met accumulatie van rode fluorescentie in de vacuole werd opgenomen op 0, 6, 12, 24 en 48 uur na het begin van stikstof honger.

<ol><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li>
<li>Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li>
<li>Camougrand, N., Kissová, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mitophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li>
<li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+live+long+and+prosper%3A+autophagy%2C+mitochondria%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li>
<li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li>
<li>Bhatia-Kissová, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+in+yeast%3A+actors+and+physiological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li>
<li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li>
<li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K%2B%2FH%2B+exchange+activity%2C+osmotic+swelling+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li>
<li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
</ol>

In de representatieve beelden gepresenteerd in Fig. 2B en 2C is duidelijk te zien dat het gebruik van organel-specifieke tl-reporters en fluorescentie microscopie bewijs van mitochondriale lokalisatie / distributie in zowel groeiende en stikstof-uitgehongerd cellen zorgt, en maakt mitophagy kunnen worden gevisualiseerd. Het moet worden benadrukt dat deze methode niet beperkt is tot volgende mitophagy. Autofagie van andere cellulaire componenten of organellen (bijvoorbeeld ribosomen, lipide druppels, peroxisomen, endoplasmatisch reticulum en kern) kan worden gecontroleerd met geschikte etikettering. Details van de Rosella biosensor te bouwen, celcultuur condities en typische resultaten voor de omzet van de kern (nucleophagy) zijn gemeld 11,12 ter illustratie van de bredere toepassing van de methode. Gebruik van organel-specifieke tl-reporters voor het toezicht op autofagie vereist een aantal overwegingen van de bouw het ontwerp te worden gehouden. Deze omvatten: (1) selectie en fusie naar de juiste targeting signaal naar organel-specifieke targeting te bereiken, (2) selectie van een geschikt fluorescerend eiwit (s), (3) sterke fluorescentie-emissie, (4) de juiste organel lokalisatie en / of verdeling binnen de cel. Zodra het organel-specifieke reporter is met succes, uitgedrukt in de gekozen gist gastheerstam een ​​tweede groep van overwegingen te worden: (1) gist groei-omstandigheden, (2) celmonster voorbereiding; (3) beeldvorming parameters zoals het belangrijk is dat de parameters geselecteerde voor CLSM (bijv. laser intensiteit, scan-rate en mode, pinhole-waarde, zoom waarde, gebruikt doelstellingen of blootstelling voor CCD-camera) worden gehandhaafd gedurende een experiment ervoor te zorgen dat vergelijkingen kunnen worden gemaakt tussen controle (groeiende cellen) en uitgehongerd monsters; ( 3) autofagie inductie en succesvolle oplevering van de verslaggever in de vacuole. Het geheel genomen is deze fluorescentie microscopie methode is eenvoudig, relatief snel, en heeft mogelijke toepassing voor high throughput screening naar nieuwe geneesmiddelen die versterken of remmen autofagie, en ook voor de genen die reguleren of moduleren autofagie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformatie Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Yeast nitrogen base zonder aminozuren en ammoniumsulfaat </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Laagsmeltende agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Objectglaasjes (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td></tr><tr><td> Microscoop dekglaasjes (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Confocale laser scanning microscoop Fluoview FV500 </td><td> Olympus </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Probes-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Alle vermelde concentraties zijn w / v, tenzij anders aangegeven. Gist minimaal medium (YMM): 0,67% yeast nitrogen base zonder aminozuren, 2% glucose, 1,5% agar (alleen toegevoegd bij het ​​maken van vaste media) en de eventueel vereiste auxotrofe supplementen (0,01%)]. Saccharomyces Zouten (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%, KH 2 PO 4, 0,10%; MgC1 2 0.6 H2O, 0,07%, NAC1, 0,05%, CaCl2, 0,01%, FeC1 3, 0,0005%. Groeimedium: SS en 2% ethanol (v / v) en geschikte auxotrofe supplementen. Stikstof-verhongering medium: 0,17% yeast nitrogen base zonder aminozuren en ammoniumsulfaat (Difco), 2% ethanol (v / v).

een fluorescentie microscopie assay voor de bewaking mitophagy in de gist saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autofagie belangrijk is voor de omzet van cellulaire componenten onder een waaier van verschillende omstandigheden. Het dient een essentiële homeostatische functie, evenals een kwaliteitscontrole mechanisme dat kan gericht en selectief degraderen cellulair materiaal met inbegrip van organelles1-4. Bijvoorbeeld, beschadigde of overbodige mitochondriën (afb. 1), niet verwijderd door autofagie, kan een bedreiging voor de cellulaire homeostase en overleving van de cel te vertegenwoordigen. In de gist, Saccharomyces cerevisiae, voedingsstoffen deprivatie (bijvoorbeeld stikstof verhongering) of schade kan selectieve omzet van de mitochondria te bevorderen door autofagie in een proces genoemd mitophagy 5-9. Beschrijven we een eenvoudige fluorescentie microscopie benadering van autofagie te beoordelen. Voor de duidelijkheid hebben we beperken onze beschrijving hier om te laten zien hoe de aanpak kan worden gebruikt om mitophagy in gistcellen bewaken. De test maakt gebruik van een TL-verslaggever, Rosella, dat is een dual-emissie biosensor bestaat uit een relatief stabiele pH-rood fluorescerend eiwit gekoppeld aan een pH-gevoelige groen fluorescerend eiwit. De werking van deze verslaggever is gebaseerd op de verschillen in pH tussen de vacuole (pH ~ 5,0 tot 5.5) en mitochondriën (pH ~ 8.2) in levende cellen. Onder de groeiomstandigheden, wild-type cellen vertonen zowel de rode en groene fluorescentie verspreid op een manier die kenmerkend is voor de mitochondriën. Fluorescentie-emissie is niet geassocieerd met de vacuole. Wanneer het wordt blootgesteld aan stikstof honger, een aandoening die mitophagy induceert, in aanvulling op rood en groen fluorescentie labelen van de mitochondria, de cellen vertonen de accumulatie van rood, maar niet groene fluorescentie, in de zure vacuolaire lumen die de levering van mitochondriën naar de vacuole. Scoren cellen met rood, maar niet groen fluorescerend vacuolen kan worden gebruikt als een maat voor mitophagic activiteit in cellen 5,10-12.

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autofagie is belangrijk voor de omzetting van cellulaire componenten onder uiteenlopende omstandigheden. Het vervult een essentiële homeostatische functie, evenals een ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de opname van mitochondriën in het vacuole te volgen als middel om de autofagie van mitochondriën te bestuderen, een proces dat bekend staat als mitofagie. Dit wordt bereikt door in gistcellen een genetisch gecodeerde en op mitochondriën gerichte duale emissie fluorescentie pH-biosensor genaamd Mt Rosea tot expressie te brengen, die mitochondriën labelt met rode en groene fluorescentie. Als tweede stap worden de gistcellen blootgesteld aan stikstofuithongering om autofagie te induceren.Vervolgens bekijken we de cellen via fluorescentiemicroscopie of confocale laserscanningmicroscopie om de opname van mitochondriën in de va te visualiseren. De resultaten laten een accumulatie zien van rode, maar geen groene fluorescentie in de VA's van stikstofgebrekkige cellen. Dit is indicatief voor autofagie; door cellen in een populatie te scoren kan de mate van mitofagie worden bepaald.Het gebruik van rosea om de opname van mitochondriën in de vacuole van gistcellen te monitoren, kan mechanistische inzichten bieden in het proces van mii. De aanpak kan worden aangepast om de autofagie van andere cellulaire compartimenten, zoals de nucleus, te monitoren; de procedure zal worden gedemonstreerd door dalibor alica, een postdoctoral onderzoeker uit ons laboratorium. In dit protocol gebruiken we wildtype-stam BY 4 7 41 en een deletiemutante stam delta A TG drie, afgeleid van dezelfde genetische achtergrond, om de lokalisatie van mitochondriën te visualiseren.In deze stammen zijn ze gelabeld met een fluorescent reportereiwit. Rosea Rosea is een biosensor met duale kleuremissie, bestaande uit een relatief pH-stabiel rood fluorescent eiwit en een pH-gevoelig groen fluorescent eiwit. De mitochondriale doelsequentie wordt gebruikt om de Rosea-biosensor naar de mitochondriale matrix te richten.Deze reporter is Mt.Rosea genoemd; bij een hoge pH fluoresceert de biosensor zowel rood als groen. Bij een lage pH fluoresceert deze echter alleen rood. De wildtype-stam dient als controle om de normaal gesproken verwachte autofagieniveaus aan te geven als negatieve controle.Een stam waarin de expressie van een essentieel autofagiegen is uitgeschakeld is geschikt. Aangezien een dergelijke stam geen mitochondriën naar de vacuole kan transporteren, worden standaardprocedures gebruikt om de giststammen te transformeren met het plasmide dat de mitochondriaal getargete rosala-reporter draagt; groeplaten worden twee tot vier dagen geïncubeerd bij 28 tot 30 °C tot er kolonies van ongeveer twee tot drie millimeter in diameter verschijnen. Om cellen te kweken voor de inductie van autofagie, wordt voor elke stam een enkele gistkolonie geïnoculeerd in 10 mL groeimedium dat een niet-fermenteerbare koolstofbron bevat.In dit geval worden ethanol en de juiste oxatrophic supplementen gebruikt. Voor elke stam worden dubbele culturen gekweekt, wat resulteert in in totaal vier culturen. Incubeer de gistculturen gedurende ongeveer 48 uur bij 28 tot 30 °C met orbitale schudding, zodat de culturen tegen die tijd in de midden-logfase van de groei verkeren.Aan het einde van de incubatieperiode worden twee monsters van één milliliter van elke cultuur overgebracht naar 1,7 milliliter snap-cap plastic centrifugebuisjes. Pelleteer de cellen voorzichtig door centrifugatie bij een lage snelheid. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant uit elke buis en gooi dit weg zonder het celpellet te verstoren.Was de cellen door resuspensie in één milliliter steriel gedestilleerd water, gevolgd door centrifugatie. Herhaal het wassen nog twee keer om restanten medium te verwijderen. Resuspendeer de cellen na de derde wasbeurt in ofwel 100 µL groeimedium of stikstofarme medium.Het stikstofarme medium bevat de koolstofbron ethanol, maar is verstoken van stikstofsupplementen en zal autofagie in de cellen induceren. Inoculeer vervolgens de geresuspendeerde cellen opnieuw in 10 milliliter vers groeimedium of in 10 milliliter stikstofarm medium.Incubeer de culturen met orbitale schudding gedurende zes tot 12 uur na de inductie van autofagie. Het is nuttig om de afgifte van Mt Rosea aan de vae te bevestigen onder de fluorescentiemicroscoop. De vae kunnen worden gelokaliseerd door labeling met een coumarine-gebaseerde blauwe fluorescerende kleurstof, zoals seven amino four chloro methyl coumarine, afgekort als L arginine mi cmac arg.Labeling met cmac ARG hoeft niet routinematig te worden uitgevoerd, maar wordt aanbevolen voor hen die niet bekend zijn met de locatie en het uiterlijk van de vacuole in gist. Om de procedure voor het labelen van de vacuole te starten, brengt u monsters van één milliliter van elke cultuur over in afzonderlijke plastic centrifugebuisjes van 1,7 milliliter met een snap-cap. Voeg vervolgens cmac arg toe aan elk buisje.Incubeer de buisjes bij 28 tot 30 °C met orbitale schudding gedurende 30 minuten. Pelleteer na 30 minuten de cellen door centrifugatie, verwijder het supernatant en was de cellen door suspensie in één milliliter steriel gedestilleerd water, gevolgd door centrifugatie. Was de cellen nog twee keer met steriel gedestilleerd water.Deze stap verwijdert resterend medium en overtollige cmac arg-kleurstof. Na de derde wasbeurt worden de cellen geresuspendeerd in 100 µL steriel gedestilleerd water. De cellen zijn nu klaar om te worden gemonteerd voor beeldvorming via fluorescentiemicroscopie.Bij het uitvoeren van dit protocol is het zeer belangrijk om vers getransformeerde gistculturen te gebruiken om te garanderen dat u T-cellen verkrijgt met sterk fluorescerende mitochondriën. Om levende gistcellen voor te bereiden voor beeldvorming via fluorescentiemicroscopie, smelt u eerst 2 mg laagsmeltende agarose in afzonderlijke aliquots van 1 mL groeimedium en stikstofarme medium door deze één uur lang te incuberen bij 70 °C; de gesmolten agarose wordt op 70 °C gehouden. Om de cellen te monteren, brengt u 20 µL gesmolten agarose aan op een gelabeld glazen microscoopglas van 76 bij 26 mm.Pipetteer onmiddellijk 10 µL van de gewassen celсусpensie op het aros-bed. Dek het aros-bed af met een glasdekglaasje van 22 bij 22 millimeter. De cellen zullen zich over het aros-oppervlak onder het dekglas verspreiden.Verzegel vervolgens voorzichtig de randen van het dekglas met een dunne laag nagellak. Dit voorkomt uitdroging en verschuiving van het dekglas tijdens de beeldvorming. Wanneer de nagellak volledig droog is, zijn de preparaten klaar om met fluorescentiemicroscopie te worden bekeken. Met deze techniek kunnen de gemonteerde cellen tot één uur na de montage worden geobserveerd zonder dat er duidelijke nadelige effecten op de cellen optreden.Aangezien gistcellen relatief klein zijn, heeft u een fluorescentiemicroscoop van goede kwaliteit nodig, uitgerust met excitatie- en emissiefilters die geschikt zijn voor de afzonderlijke visualisatie van GFP-emissie en RFP-emissie, en een 60 x waterimmersie-objectief met een numerische apertuur van 1,2. Typische resultaten verkregen met MT Rosea tot expressie gebracht in wild-type cellen en met behulp van confocale laserscanscan-microscopie worden hier getoond onder niet-uitgehongerde omstandigheden met ethanol als koolstofbron, waarbij wild-type cellen een typische cellulaire distributie van mitochondriën aan de periferie van de gistcellen vertonen die zowel rode als groene fluorescentie vertonen.Rode en groene fluorescentie-emissie wordt niet gedetecteerd in de vacuole. Wanneer MT.Rosea-expresserende wildtype-cellen gedurende zes uur of langer worden blootgesteld aan stikstoftekort, vertonen zij, naast rode en groene fluorescentie die overeenkomt met de mitochondriën, een ophoping van rode, maar geen groene fluorescentie in de vacuole.Dit cellulaire signaal is indicatief voor autofagie. De autofagische opname van de mitochondria is cellulair. De lokalisatie van rosea kan afzonderlijk worden bevestigd met behulp van CMAC arg.In tegenstelling hiermee vertoonden mitofagie-negatieve controlecellen die MT.Rosea tot expressie brengen, waargenomen vóór uithongering en na zes uur en langer van uithongering, geen accumulatie van rode fluorescentie in de vacuole. Terwijl de mitochondriële labeling sterk bleef om het niveau van autofagie in de wild-type en A TG three mutantstammen te beoordelen, werden meer dan 200 cellen per stam geobserveerd op accumulatie van rode fluorescentie in de vacuole vóór de inductie van autofagie en op geselecteerde tijdspunten na de inductie van autofagie. Het uitzetten van de proportie cellen die vacuolaire accumulatie vertonen, onthult dat de graad van vacuolaire opname toeneemt met de tijd in wild-type cellen, maar niet in delta ATG three mutantcellen die mitochondria na hun ontwikkeling niet naar de vacuole kunnen transporteren. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het veld van autofagie om het transport van mitochondria en andere organellen, zoals de nucleus, naar de vacuole en de verschillende groeicondities in deze cellen te onderzoeken.

a-fluorescence-microscopy-assay-for-monitoring-mitophagy-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Dit artikel beschrijft het gebruik van een vuurvlieg luciferase-GFP-fusie-eiwit te...

Gekoppeld Testen voor Monitoring Protein Refolding in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Hier beschrijven we in detail een time-lapse videomicroscopie-benadering om de temporele recrutering van EYFP-Parkin te meten tijdens de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën. Dit dynamische proces van EYFP-Parkin-afhankelijke verwijdering van beschadigde mitochondriën kan worden gebruikt als een indicator van cellulaire gezondheid onder verschillende experimentele omstandigheden.

Time-lapse video microscopie voor de Beoordeling van EYFP-Parkin Aggregation als marker voor Cellular mitofagie

Mitophagy, het proces van clearing beschadigd de mitochondriën, is noodzakelijk voor mitochondriale homeostase en gezondheid onderhoud. Dit artikel presenteert een aantal van de meest recente mitophagy detectiemethoden in menselijke cellen, Caenorhabditis elegansen muizen.

In Vitro en In Vivo opsporing van Mitophagy in menselijke cellen, C. Elegansen muizen

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.

Mitofagie visualiseren met fluorescerende kleurstoffen voor mitochondriën en lysosoom

Het verkennen van mitofagie door middel van elektronenmicroscopie, genetische sensoren en immunofluorescentie vereist dure apparatuur, geschoold personeel en een aanzienlijke tijdsinvestering. Hier demonstreren we de werkzaamheid van een commerciële fluorescentiekleurstofkit bij het kwantificeren van het mitofagieproces in zowel Caenorhabditis elegans als een leverkankercellijn.

Detectie van mitofagie in Caenorhabditis elegans en zoogdiercellen met behulp van organel-specifieke kleurstoffen

Waterstofperoxide (H2O2) is zowel een bron van oxidatieve schade als een signaalmolecuul. Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale H 2 O2kan worden gemeten met behulp van mitochondriën-gerichte HyPer7 (mtHyPer7), een genetisch gecodeerde ratiometrische biosensor, in levende gist. Het beschrijft hoe beeldvormingsomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd en kwantitatieve cellulaire en subcellulaire analyses kunnen worden uitgevoerd met behulp van vrij beschikbare software.

Beeldvorming van mtHyPer7, een ratiometrische biosensor voor mitochondriaal peroxide, in levende gistcellen

Leer mitofagie monitoren in gist met fluorescentiemicroscopie en de Mt Rosea pH-biosensor. Deze methode visualiseert mitochondriële opname in vacuolen en biedt inzicht in autophagieprocessen.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Meer video's verkennen