Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van dendritische cellen voor beeldvormingsstudies met gebruik van Q-dot nanokristallen. Dit wordt bereikt door eerst beenmergcellen te isoleren uit milt, femura en tibiae. Vervolgens worden beenmergcelculturen opgezet om de celdifferentiatie tot dendritische cellen in de aanwezigheid van GM-CSF te faciliteren.

Vervolgens worden de dendritische cellen na acht dagen teruggewonnen uit de beenmergcelculturen. De laatste stap van de procedure is het kleuren van de cellen met fluorescente Q nano-kristallen. Uiteindelijk kunnen de helder gekleurde dendritische cellen worden gevisualiseerd middels fluorescentiemicroscopie.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze technologie vergeleken met andere methoden, zoals het gebruik van GFP-gelabelde dendritische cellen, is dat Q-dot nanocristallen hun fluorescentie behouden, zelfs na kleuring met organische oplosmiddelen zoals aceton. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor biologen die onderzoek doen naar dendritische cellen, zoals de migratie-eigenschappen van deze cellen bij of in de context van verschillende ziekten. De kleuringsprocedure zal worden gedemonstreerd door Maria Ali, een promovendus uit mijn laboratorium.

Na de opoffering worden de tibia en femura van twee muizen zorgvuldig gedissecteerd zonder de uiteinden van de botten door te snijden. Gebruik vervolgens vloeipapier om al het aanhechtende weefsel van de botten te verwijderen, waarbij u er alert op bent de botten niet te breken. Voer dit uit in een biologische veiligheidskast.

Vul een Petri-schaal van 35 millimeter met 70% ethanol en dompel de botten vervolgens 10 minuten onder in de ethanol. Nadat de botten zijn gesteriliseerd, worden ze uit de ethanol gehaald en vijf minuten aan de lucht gedroogd in een nieuwe Petri-schaal. Snijd nu het femur in het midden door en de tibia bij het dunste uiteinde.

Infuseer het binnenste van de botten met één milliliter RPMI-medium met behulp van een steriele spuit. Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en was deze twee keer met RPMI-medium door middel van centrifugatie gedurende 10 minuten bij 300 ×g bij vier graden Celsius in een centrifuge met een swinging bucket-rotor. Resuspendeer de cellen na de laatste wasbeurt in twee milliliters van een CK-lysisbuffer en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te elimineren.

Voeg vervolgens 13 milliliters RPMI plus 10%FBS toe en was de cellen nog twee keer in dit medium met dezelfde centrifuge-instellingen als voorheen. Tel de cellen en pas de concentratie aan naar twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Voeg met RPMI plus 10%FBS recombinant muis G-M-C-S-F toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per milliliter.

Voeg vervolgens 10 milliliters van deze suspensie toe aan een steriele Petri-schaal van 10 centimeter van microbiologische kwaliteit en kweek de celsuspensie in een koolstofdioxide-incubator. Voeg drie dagen later aan elk van de voorbereide platen opnieuw 10 milliliters RPMI toe, aangevuld met 10% FBS en 20 nanograms per milliliter recombinant muis G-M-C-S-F.

Herstel drie dagen later 10 milliliter cel-suspensie uit elke Petrischaal, centrifugeer de cellen onder dezelfde condities en resuspendeer de pellet in hetzelfde volume RPMI plus 10%FBS als er uit de Petrischalen is hersteld en vul aan met nieuw recombinant murien G-M-C-S-F. Doe tot slot de cel-suspensie terug in elke oorspronkelijke Petrischaal en kweek de cellen nog twee dagen in de kooldioxide-incubator. Na acht dagen kweek worden de zwevende en los aanhechtende cellen hersteld door de Petrischalen te wassen met vers medium.

Label vervolgens de verzamelde cellen met de Q tracker 6 55 cell labeling kit, strikt volgens de instructies van de fabrikant, om 5 × 10⁶ muizen-beenmergafgeleide dcs te labelen met Q nano-kristallen bij een concentratie van 10 nM. Meng eerst 5 µL van elk van de kitcomponenten A en B in een eppendorfbuisje en incubeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 mL RPMI plus 10% FBS toe en vortex de buis gedurende 30 seconden.

Voeg vervolgens vijf keer 10⁵ Dcs gesuspendeerd in 0,5 milliliters RPMI plus 10% FBS toe aan de einor-buis en incubeer de cellen in de D-oplossing bij 37 degrees Celsius gedurende 60 minuten. Was de cellen daarna twee keer in RPMI plus 10% FBS onder dezelfde omstandigheden als voorheen en resuspendeer het pellet in RPMI.

Deze figuur toont een voorbeeld van een fluorescentiemicrofoto van dcs. Onmiddellijk na het labelen werd een druppel gelabelde cellen op een glazen objectglas geplaatst en afgedekt met een dekglas. Vervolgens werden de monsters geëvalueerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

In deze figuur is een gelabelde fluorescentiemicrofoto van dcs te zien na 48 uur in vitro rijping. Dcs werden 48 uur gekweekt met 100 nanograms per milliliter LPS en 20 nanograms per milliliter TNF alpha in slide culture chambers in een koolstofdioxide-incubator. Vervolgens werden de monsters gewassen met PBS, gefixeerd met aceton, tegengekleurd met DPI en geëvalueerd met een fluorescentiemicroscoop.

Gemarkerde dc's die in vitro waren gerijpt, werden geanalyseerd via flowcytometrie. Met Q-dots gekleurde cellen geven een sterk signaal in het FL3-kanaal; zowel Q-dot-gekleurde als ongekleurde dc's werden meegenomen. De dc's werden bovendien gekleurd met specifieke antilichamen tegen maturatiemarkers, CD 86 en CD 40, en isotypecontroles, waarna de cellen via flowcytometrie werden geanalyseerd. Daarnaast werden de IL-6- en stikstofmonoxideniveaus bepaald in de supernatanten van rijpe Q-dot-gekleurde dc's en controles.

Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van gelabelde DCS in een gedissecteerd weefsel. Mature DCS werden intraveneus geïnjecteerd in C 57 black six muizen. Drie dagen later werden de muizen geofferd en werden de milten verzameld.

Snelbevroren, ingebed in OCT en acht micron dikke secties werden voorbereid met behulp van een cryostaat. De monsters werden vervolgens gefixeerd met aceton, tegengekleurd met DPI en geëvalueerd met een fluorescentiemicroscoop. Volg deze procedures.

Andere methoden, zoals antigeenpresentatie of rijping met verschillende stimuli, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de migratie van dendritische cellen als reactie op verschillende rijpingsstimuli.