Name: Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer hoe u beenmergafgeleide dendritische cellen genereert en labelt met Qdot-nanokristallen voor trackingstudies. Deze methode maakt stabiele fluorescentie en visualisatie van celmigratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze werkzaamheden mede ondersteund door de NIH onder Grant R15 CA137499-01 (FB) en een startup fonds van de Ohio University (FB).

1. Dissectie van de muis scheen-en tibiae en de cultuur van beenmergcellen <ol><li> Offer twee muizen door CO 2 stikken en zorgvuldig dij-en bovenbenen ontleden zonder het snijden van de botuiteinden. </li><li> Reinig de botten van alle aangesloten weefsels met behulp van tissue papier. Wees voorzichtig niet naar de botten te breken. </li><li> Steriliseer de botten door onderdompeling in 70% ethanol gedurende 10 minuten in een 35 mm petrischaal. Vanaf dit moment werk binnen een bioveiligheid kap om verontreiniging van het celculturen te vermijden. </li><li> Herstel de botten van de ethanol en laat ze drogen aan de lucht gedurende 5 min in een petrischaal in de bioveiligheid kast. </li><li> Snijd de dijbenen in de helft, en het scheenbeen van zijn dunste punt. Infundeer de binnenkant van het bot met 1 ml RPMI medium (zonder serum, maar met antibiotica) met behulp van een steriele spuit op een steriele petrischaal. </li><li> De celsuspensie wordt verzameld en gewassen 2X in RPMI medium door 10 min centrifugeren in een 15 ml centrifugebuis op 1100 RPM in een gekoelde centrifuge (4 ° C) met een swingende emmer rotor. </li><li> Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de cellen in 2 ml van ACK lysis buffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in om rode bloedcellen te elimineren. </li><li> Voeg 13 ml RPMI met 10% FBS, mengen en wassen 2X in dit medium met dezelfde instellingen, zoals beschreven in 1.6. </li><li> Tellen cellen, aan te passen aan 2 x 10 5 cellen / ml RPMI met 10% FBS, en voeg rm-GM-CSF (20 ng / ml uiteindelijke concentratie) 5. </li><li> Voeg 10 ml van deze suspensie aan een steriele, microbiologische kwaliteit, 10 cm petrischaaltje, en cultuur in een CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Drie dagen later, nog een 10 ml RPMI 10% FBS met 20 ng / l rmGM-CSF aan elk van de bereide platen. </li><li> Drie dagen later 10 ml celsuspensie worden verhaald op elke petrischaal, gecentrifugeerd zoals in 1.6, geresuspendeerd in hetzelfde volume van RPMI 10% FBS met rmGM-CSF en keerde terug naar de petrischaal. Cellen worden gekweekt voor de twee extra dagen in de CO 2-incubator. </li></ol> 2. Inzameling en de etikettering van DC's <ol><li> Na 8 dagen in kweek losjes adherente cellen worden teruggewonnen door het wassen van de petrischalen met vers medium. Dit protocol maakt rond 2-4 x10 8 DC's in onze handen. Cellen kunnen worden geanalyseerd op DC fenotype door flowcytometrie. </li><li> Verzamelde cellen worden dan voorzien van het Qtracker 655 Cell Labeling Kit strikt volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> We hebben uitstekende resultaten etikettering van muizen beenmerg-afgeleide DC's met Qdots op een 10 nM concentratie. Om dit te bereiken, fracties van Qtracker Cell Labeling Kit-onderdelen A en B worden gemengd in gelijke hoeveelheden, geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en onmiddellijk verdund 1 / 100 in vers medium met vortexen voor 30 s. </li><li> Om vlek 5 x 10 6 DC's, mix 5 pi van elke kit onderdelen A en B in een eppendorfbuisje en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Dan, voeg 1 ml RPMI 10% FBS incubeer en vortex voor 30 seconden. </li><li> Voeg 0,5 ml celsuspensie met 5 x10 6 DC's, en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Vervolgens wassen cellen 2X in RPMI 10% FBS (1100 RPM). Cellen kunnen worden gesuspendeerd in RPMI voor verdere cultuur of in PBS voor injectie in een experimentele muizen. </li></ol> 3. Evaluatie van het label DC <ol><li> Cel de etikettering kunnen worden geëvalueerd door middel van fluorescentie microscopie. Om dit te bereiken, is een druppel celsuspensie toegevoegd aan een microscoopglaasje, bedekt met een glazen dekglaasje, en geëvalueerd met een fluorescentiemicroscoop ermee rekening houdend dat deze Qdots emissie en excitatie spectra van 565nm en 405-525nm hebben respectievelijk (afb. 3 ) </li><li> Op dit punt, kan de gelabelde cellen die worden gebruikt om dieren te injecteren, of rijping kan worden geïnduceerd door het incuberen van deze cellen gedurende 48 uur (37 ° C, 5 CO 2) in de aanwezigheid van LPS (100 ng / ml) en TNF-( 20 ng / ml). TL-etikettering is niet beïnvloed door DC rijping (afb. 4). </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Hierbij beschreven we hoe de muis beenmerg-afgeleide DC's voor te bereiden en hoe ze gelabeld met fluorescerende Qdots. Fig. Een overzicht gegeven van de procedure voor het verkrijgen van de cel, terwijl Fig. 2 geeft de procedure om ze label met Qdots. Zoals getoond in Fig. 3, bijna alle cellen zijn gelabeld door deze procedure, en dit is niet beïnvloed door DC rijping met inflammatoire factoren (afb. 4). Fig. 5 laat zien dat Qdot-lood DC (Fig.5a) gedragen zich vergelijkbaar met niet-gekleurde cellen die worden behandeld met een ontstekingsremmende cocktail. Beide celpreparaten eveneens upregulate uitdrukking van costimulatoire moleculen (Fig. 5b); en produceren vergelijkbare bedragen van IL-6 (Fig. 5c) en stikstofoxide (fig. 5d) na rijping stimuli. Dit is het eens met vorige boekjaarlende gepubliceerde gegevens waaruit blijkt dat Qdot vlekken geen invloed op de capaciteit van DC te zetten tot rijpe cellen die in staat tot het opwekken van immuunreacties [6]. Deze cellen kunnen vervolgens gebruikt worden voor het inspuiten van proefdieren. Zoals getoond in Fig. 6, 2 dagen na de intraveneuze injectie van gelabelde DCs in muizen, konden we Qdot-gekleurde cellen te detecteren in de milt. Dit is ook in overeenstemming met eerder gepubliceerde gegevens waaruit blijkt dat het gebruik van Qdot nanokristallen de migratie van DC te evalueren in vivo [6] door niet-invasieve beeldvorming en flowcytometrie. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van de DC-generatie uit het beenmerg. Hierbij hebben we beschrijven het proces om beenmerg-afgeleide DC te verkrijgen. Zowel de dij-en bovenbenen worden ontleed en schoon uit de omliggende weefsel. Bone tips zijn bewaard gebleven en het interieur van de botten zijn gespoeld met medium. Na eliminatie van rode bloedcellen, worden beenmergcellen gekweekt gedurende 8 dagen in de aanwezigheid van GM-CSF om ze te differentiëren in DC's. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Stroomschema van de etikettering procedure. Gelijke hoeveelheden van Qtracker Cell Labeling Kit-onderdelen A en B worden gemengd in een eppendorfbuisje. Dendritische cellen zijn verzameld uit acht-dagen beenmerg culturen met GM-CSF en gemengd met de etikettering kleurstof voor 60 minuten bij 37C. Dan cellen worden gewassen in de media om overtollige etikettering deeltjes te verwijderen. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Fluorescerend microfotografie van DCs onmiddellijk na labeling. Een daling van gelabelde cellen werd gestort op een glasplaatje en bedekt met een dekglaasje aan. Vervolgens werden monsters geëvalueerd in een fluorescentie microscoop en de beelden werden verworven door middel van een Micropublisher 5.0 Digital Color CCD Camera (Qimaging, Surrey, BC Canada). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Fluorescent microfotografie van DCs na 48 uur rijping in vitro. Gelabelde DC's werden gekweekt gedurende 48 uur met LPS (100 ng / ml) en TNF-α (20 ng / ml) op glas dia's op een CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2). Vervolgens werden monsters gewassen met PBS (5 min, 2X), gefixeerd met aceton (15 min, 4 ° C) en tegengekleurd met DAPI. Cellen werden geëvalueerd in een fluorescentiemicroscoop als hierboven. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Biologische activiteit van Qdot gekleurde rijpe DCs. Label DC gerijpt in vitro als hierboven werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie (A) en (B). (A) Qdot-gekleurde cellen geven een sterk signaal in de FL3 (PercP) kanaal. Shaded histogram: ongekleurd controle. (B) Qdot-gekleurd en onbesmet DC's waren bovendien gekleurd met specifieke antilichamen tegen rijping markers CD86 en CD40 en isotype controles. Cellen werden vervolgens geanalyseerd in een FACSort flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA). Daarnaast zijn IL-6 (C) en stikstofoxide (NO) bepaald in supernatanten van rijpe Qdot bevlekte DC's en controles. Niveaus van IL-6 en stikstofoxide werden bepaald door middel van ELISA-analyse en Griess assay zoals we eerder hebben 7 beschreven, 8. Alle gegevens bleek in deze figuur is representatief voor twee of drie onafhankelijke experimenten met soortgelijke resultaten. De gegevens werden geanalyseerd door ANOVA met behulp van de GraphPad software. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Detectie van gelabelde DC's in ontleed weefsels. Gelabeld rijpe DCs (1x10 6 cellen) werden intraveneus geïnjecteerd in C57BL / 6 muizen. (A) Twee dagen later werden de muizen opgeofferd en de milt worden verzameld, snap bevroren, ingebed in oktober en 8 uM secties bereid met behulp van een cryostaat. Vervolgens werden monsters gefixeerd met aceton (15 min, 4 ° C) en tegengekleurd met DAPI. Cellen werden geëvalueerd in een fluorescentiemicroscoop, zoals hierboven Fig 6a:. 40x vergroting, Fig 6b: 100X vergroting, Fig. 6C, 400X vergroting.

<ol><li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Bonasio, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+migration+and+function+of+circulating+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation, migration and function of circulating dendritic cells.</a> Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).</li>
<li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+instructive+role+of+dendritic+cells+on+T+cell+responses%3A+lineages%2C+plasticity+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics.</a> Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).</li>
<li>Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+dendritic+cell+precursors+recruited+by+a+beta-defensin+contribute+to+vasculogenesis+under+the+influence+of+Vegf-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.</a> Nat Med. 10, 950-958 (2004).</li>
<li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+near-infrared+fluorescent+semiconductor+nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals.</a> Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).</li>
<li>Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV+oncolytic+therapy+upregulates+interferon-inducible+chemokines+and+recruits+immune+effector+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer.</a> Mol Ther. 12, 789-802 (2005).</li>
<li>Gilboa, E., Vieweg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+with+mRNA-transfected+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells.</a> Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).</li>
<li>Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+murine+dendritic+cell+antitumor+dysfunction+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging.</a> Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).</li>
<li>Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+infection+of+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells%3A+influence+on+antigen+presentation+and+initiating+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).</li>
<li>Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li>
<li>Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+tumor+antigen+vaccination+using+dendritic+cells%3A+comparison+of+RNA+electroporation+and+pulsing+with+UV-irradiated+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells.</a> J Transl Med. 6, 21-21 (2008).</li>
<li>Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+CD11c-DTR%2FGFP+mice+after+in+vivo+depletion+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells.</a> Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).</li>
<li>Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+angiogenesis+and+promote+lesion+growth+in+a+murine+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis.</a> Faseb J. 22, 522-529 (2008).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+dendritic+cells+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Vascular dendritic cells and atherosclerosis.</a> Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).</li>
<li>Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+augment+choroidal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells augment choroidal neovascularization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).</li>
<li>Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+dendritic+cells+delays+ovarian+cancer+progression+by+boosting+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity.</a> Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).</li>
<li>Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+derived+from+peripheral+monocytes+express+endothelial+markers+and+in+the+presence+of+angiogenic+growth+factors+differentiate+into+endothelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells.</a> Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).</li>
<li>Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+tumour-associated+dendritic+cells+into+endothelial-like+cells%3A+an+alternative+pathway+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis.</a> Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+vascular+dendritic+cells+in+atherosclerotic+arteries+suggests+their+involvement+in+local+immune-inflammatory+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions.</a> Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).</li>
<li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-accumulation+of+dendritic+cells+and+natural+killer+T+cells+within+rupture-prone+regions+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.</a> J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).</li>
</ol>

Murine myeloïde) DCs zijn uitgebreid gebruikt om de werkzaamheid en de verbetering van de DC-gebaseerde vaccins te bepalen; DC te onderzoeken: T-cel interacties of DC ontwikkeling, en hun rol te bepalen in verschillende ziekten 9-11. Hiermee laten we zien hoe DC&#39;s van de voorlopers hersteld van het bot courgettes van de dij-en bovenbenen te genereren. We herstellen de botten, zonder het snijden van de tips, waardoor we om ze te steriliseren door onderdompeling in ethanol 70%, waardoor de kans op besmetting. Om onderscheid te maken DC&#39;s van beenmergcellen we alleen gebruik maken van GM-CSF zoals eerder beschreven 5. Hoewel sommige protocollen ook gebruik maken van IL-4, is gemeld dat dit cytokine niet nodig is bij het ​​werken met een hoog niveau van GM-CSF 12. Inderdaad, we hebben eerder aangetoond dat deze DC&#39;s in staat zijn om de immuunrespons 13 induceren. Ook zorg worden genomen om slechts losjes hechtende cellen te herstellen van 8-dagen culturen door het wassen van de petrischalen met medium sinds bevestigd cellen vertonen een meer monocyt-achtig fenotype. Hier laten we de etikettering van DCs met fluorescerende Qdot deeltjes. Deze labeling heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere methoden. Eerst worden de Qdots deeltjes gemakkelijk opgenomen in de cellen. Ten tweede, het fluorescerende signaal is zeer hoog en wordt niet veranderd door DC rijping. Ten derde, is de fluorescentie niet verloren wanneer de cellen of weefsels worden bevestigd met oplosmiddelen zoals aceton, in tegenstelling tot wat er gebeurt als GFP wordt gebruikt om de DC 14-tag, het geven van meer flexibiliteit op het moment dat voor vlekken protocollen te kiezen. Ten slotte is de hoge fluorescerende signaal gegeven door deze deeltjes maakt visualisatie van de cellen, ondanks weefsel auto-fluorescentie. Zoals eerder beschreven zes, heeft Qdot vlekken geen invloed op de rijping vermogen van deze cellen. Hiermee laten we zien dat Qdot gekleurd DC&#39;s gedragen zich op een soortgelijke manier als niet-gekleurde DC&#39;s, opregulerende costimulatoire moleculen, en het produceren van IL-6 en stikstofoxide in reactie op inflammatoire stimuli. Hoewel de DC&#39;s zijn cellen die gespecialiseerd zijn in het stimuleren van immuunreacties, zijn ze getoond om deel te nemen in pathologische aandoeningen zoals kanker en atherosclerose 4, 15, 16. Ze zijn ook beweerd om deel te nemen in angiogene proces 17, 18, ​​zelfs voorgesteld als structureel deel te nemen aan het ontwikkelen van nieuwe schepen 19, 20. Zo, methoden die het mogelijk maken voor DC tracking in vivo, en het bepalen van hun geografische lokalisatie in verschillende weefsels 4, 21, 22 zijn zeer waardevol.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> C57BL / 6 muizen </td><td> Jackson laboratoria </td><td></td><td> Vrouwtjes, 6-8 weken oud </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum, gekwalificeerde </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica-antimycotische </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> ACK lyserende Buffer </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant muizen GM-CSF </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 Cel Labeling Kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant muizen TNF-alfa </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Griess reagens systeem </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 capture antilichaam </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 detectieantilichaam </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en etikettering van muriene bone marrow-afgeleide dendritische cellen met qdot nanokristallen voor tracking studies

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritische cellen (DC&#39;s) zijn professionele antigeen presenterende cellen (APC&#39;s) gevonden in de perifere weefsels en in de immunologische organen zoals zwezerik, beenmerg, milt, lymfeklieren en plaques van Peyer 1-3. DC&#39;s aanwezig in de perifere weefsels monster van het organisme op de aanwezigheid van antigenen, die ze opnemen, verwerken en presenteren van hun oppervlakte in het kader van major histocompatibility moleculen (MHC). Dan, antigeen-beladen DC&#39;s te migreren naar immunologische organen, waar ze de verwerkte antigeen presenteren aan T-lymfocyten activeren specifieke immuunrespons. Een manier om de migratie mogelijkheden van DC&#39;s te beoordelen is om ze het etiket met fluorescerende kleurstoffen 4. Hiermee tonen we het gebruik van fluorescerende Qdot nanokristallen voor muriene beenmerg-afgeleide DC label. Het voordeel van deze etikettering is dat Qdot nanokristallen stabiele en langdurige fluorescentie die maken ze ideaal voor het opsporen van gelabelde cellen in weefsels hersteld bezitten. Om dit te bereiken, eerst cellen worden verhaald op muizen bot courgettes en gekweekt gedurende 8 dagen in de aanwezigheid van granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor om DC differentiatie te induceren. Deze cellen worden vervolgens gelabeld met fluorescerende Qdots door korte in-vitro incubatie. Gekleurde cellen kan worden gevisualiseerd met een fluorescentie microscopie. Cellen kunnen worden geïnjecteerd in proefdieren op dit punt of kan tot rijpe cellen die bij in vitro incubatie worden met een inflammatoire stimuli. In onze handen, heeft DC rijping niet bepalen verlies van fluorescent signaal noch Qdot vlekken van invloed op de biologische eigenschappen van DCs. Na injectie kunnen deze cellen worden geïdentificeerd in het immuunsysteem van organen door fluorescentie microscopie volgende typische dissectie en fixatie.

Dendritische cellen opname van antigenen en migreren naar immuun organen verwerkte antigenen presenteren aan T-cellen. Qdot nanokristallen etiket zorgt voor een langdurige en stabiele fluorescerende signaal. Dit maakt het volgen van dendritische cellen om verschillende organen van fluorescentie microscopie.

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Dendritische cellen (DC's) zijn professionele antigeenpresenterende cellen (APC's) die worden aangetroffen in perifere weefsels en in immunologische organen zoals de thymus, het beenmerg...

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van dendritische cellen voor beeldvormingsstudies met gebruik van Q-dot nanokristallen. Dit wordt bereikt door eerst beenmergcellen te isoleren uit milt, femura en tibiae. Vervolgens worden beenmergcelculturen opgezet om de celdifferentiatie tot dendritische cellen in de aanwezigheid van GM-CSF te faciliteren.Vervolgens worden de dendritische cellen na acht dagen teruggewonnen uit de beenmergcelculturen. De laatste stap van de procedure is het kleuren van de cellen met fluorescente Q nano-kristallen. Uiteindelijk kunnen de helder gekleurde dendritische cellen worden gevisualiseerd middels fluorescentiemicroscopie.Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze technologie vergeleken met andere methoden, zoals het gebruik van GFP-gelabelde dendritische cellen, is dat Q-dot nanocristallen hun fluorescentie behouden, zelfs na kleuring met organische oplosmiddelen zoals aceton. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen voor biologen die onderzoek doen naar dendritische cellen, zoals de migratie-eigenschappen van deze cellen bij of in de context van verschillende ziekten. De kleuringsprocedure zal worden gedemonstreerd door Maria Ali, een promovendus uit mijn laboratorium.Na de opoffering worden de tibia en femura van twee muizen zorgvuldig gedissecteerd zonder de uiteinden van de botten door te snijden. Gebruik vervolgens vloeipapier om al het aanhechtende weefsel van de botten te verwijderen, waarbij u er alert op bent de botten niet te breken. Voer dit uit in een biologische veiligheidskast.Vul een Petri-schaal van 35 millimeter met 70% ethanol en dompel de botten vervolgens 10 minuten onder in de ethanol. Nadat de botten zijn gesteriliseerd, worden ze uit de ethanol gehaald en vijf minuten aan de lucht gedroogd in een nieuwe Petri-schaal. Snijd nu het femur in het midden door en de tibia bij het dunste uiteinde.Infuseer het binnenste van de botten met één milliliter RPMI-medium met behulp van een steriele spuit. Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 milliliter en was deze twee keer met RPMI-medium door middel van centrifugatie gedurende 10 minuten bij 300 ×g bij vier graden Celsius in een centrifuge met een swinging bucket-rotor. Resuspendeer de cellen na de laatste wasbeurt in twee milliliters van een CK-lysisbuffer en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te elimineren.Voeg vervolgens 13 milliliters RPMI plus 10%FBS toe en was de cellen nog twee keer in dit medium met dezelfde centrifuge-instellingen als voorheen. Tel de cellen en pas de concentratie aan naar twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Voeg met RPMI plus 10%FBS recombinant muis G-M-C-S-F toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per milliliter.Voeg vervolgens 10 milliliters van deze suspensie toe aan een steriele Petri-schaal van 10 centimeter van microbiologische kwaliteit en kweek de celsuspensie in een koolstofdioxide-incubator. Voeg drie dagen later aan elk van de voorbereide platen opnieuw 10 milliliters RPMI toe, aangevuld met 10% FBS en 20 nanograms per milliliter recombinant muis G-M-C-S-F.Herstel drie dagen later 10 milliliter cel-suspensie uit elke Petrischaal, centrifugeer de cellen onder dezelfde condities en resuspendeer de pellet in hetzelfde volume RPMI plus 10%FBS als er uit de Petrischalen is hersteld en vul aan met nieuw recombinant murien G-M-C-S-F. Doe tot slot de cel-suspensie terug in elke oorspronkelijke Petrischaal en kweek de cellen nog twee dagen in de kooldioxide-incubator. Na acht dagen kweek worden de zwevende en los aanhechtende cellen hersteld door de Petrischalen te wassen met vers medium.Label vervolgens de verzamelde cellen met de Q tracker 6 55 cell labeling kit, strikt volgens de instructies van de fabrikant, om 5 × 10⁶ muizen-beenmergafgeleide dcs te labelen met Q nano-kristallen bij een concentratie van 10 nM. Meng eerst 5 µL van elk van de kitcomponenten A en B in een eppendorfbuisje en incubeer het mengsel vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 1 mL RPMI plus 10% FBS toe en vortex de buis gedurende 30 seconden.Voeg vervolgens vijf keer 10⁵ Dcs gesuspendeerd in 0,5 milliliters RPMI plus 10% FBS toe aan de einor-buis en incubeer de cellen in de D-oplossing bij 37 degrees Celsius gedurende 60 minuten. Was de cellen daarna twee keer in RPMI plus 10% FBS onder dezelfde omstandigheden als voorheen en resuspendeer het pellet in RPMI.Deze figuur toont een voorbeeld van een fluorescentiemicrofoto van dcs. Onmiddellijk na het labelen werd een druppel gelabelde cellen op een glazen objectglas geplaatst en afgedekt met een dekglas. Vervolgens werden de monsters geëvalueerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop.In deze figuur is een gelabelde fluorescentiemicrofoto van dcs te zien na 48 uur in vitro rijping. Dcs werden 48 uur gekweekt met 100 nanograms per milliliter LPS en 20 nanograms per milliliter TNF alpha in slide culture chambers in een koolstofdioxide-incubator. Vervolgens werden de monsters gewassen met PBS, gefixeerd met aceton, tegengekleurd met DPI en geëvalueerd met een fluorescentiemicroscoop.Gemarkerde dc's die in vitro waren gerijpt, werden geanalyseerd via flowcytometrie. Met Q-dots gekleurde cellen geven een sterk signaal in het FL3-kanaal; zowel Q-dot-gekleurde als ongekleurde dc's werden meegenomen. De dc's werden bovendien gekleurd met specifieke antilichamen tegen maturatiemarkers, CD 86 en CD 40, en isotypecontroles, waarna de cellen via flowcytometrie werden geanalyseerd. Daarnaast werden de IL-6- en stikstofmonoxideniveaus bepaald in de supernatanten van rijpe Q-dot-gekleurde dc's en controles.Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van gelabelde DCS in een gedissecteerd weefsel. Mature DCS werden intraveneus geïnjecteerd in C 57 black six muizen. Drie dagen later werden de muizen geofferd en werden de milten verzameld.Snelbevroren, ingebed in OCT en acht micron dikke secties werden voorbereid met behulp van een cryostaat. De monsters werden vervolgens gefixeerd met aceton, tegengekleurd met DPI en geëvalueerd met een fluorescentiemicroscoop. Volg deze procedures.Andere methoden, zoals antigeenpresentatie of rijping met verschillende stimuli, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de migratie van dendritische cellen als reactie op verschillende rijpingsstimuli.

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

Het volgen van cellen met behulp van MRI heeft opgedaan opmerkelijke aandacht in de afgelopen jaren. Dit protocol beschrijft de etikettering van dendritische cellen met fluor...

Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

We beschrijven een protocol voor isolatie en zuivering van neutrofielen van muizen beenmerg door dichtheidsgradiënt centrifugatie en neutrofielen labeling met CellTracker kleurstoffen. Dit is een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en economische methode voor het verkrijgen van grote aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies of adoptieve overdracht en experimenten volgen.

Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Na de bereiding van een 64 Cu-gemodificeerd monoklonaal antilichaam dat aan een transgene muizen T-celreceptor, T-cellen radiogelabeld in vivo geanalyseerd op levensvatbaarheid functionaliteit labeling stabiliteit en apoptose en adoptief overgebracht in muizen met een luchtweg vertraagde hypersensitiviteit reactie voor niet-invasieve beeldvorming met positron emission tomography / computed tomography (PET / CT).

Muizen-lymfocyt Labeling door<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor targeting voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Celverkeer PET / CT

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

In dit artikel geven wij dat een gedetailleerd protocol voor de expressie van fluorescerende fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen. De methode is gebaseerd op de transductie van het beenmerg progenitoren met retrovirale constructies gevolgd door differentiatie in macrofagen en dendritische cellen in vitro.

Expressie van fluorescerende Fusion eiwitten in lymfkliertest beenmerg-afgeleide dendritische cellen en macrofagen

Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.

Een muismodel In Vivo maatregel naïef CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door het beenmerg-afgeleide dendritische cellen

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Leer hoe u beenmergafgeleide dendritische cellen genereert en labelt met Qdot-nanokristallen voor trackingstudies. Deze methode maakt stabiele fluorescentie en visualisatie van celmigratie mogelijk.

Generatie en etikettering van Muriene Bone Marrow-afgeleide dendritische cellen met Qdot Nanokristallen voor Tracking Studies

Meer video's verkennen