Vibratome Sectioning voor Enhanced Behoud van de Cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti

Het algemene doel van het volgende experiment is om het corti-orgaan in beeld te brengen met een maximale behoud van de cellulaire architectuur. Dit wordt bereikt door gedissekeerde en gefixeerde binnenoortjes te snijden met een vibratoom om dikke secties te verkrijgen, terwijl het aantal snijvlakken per slakkenhuis wordt geminimaliseerd. De vibratoomsecties worden vervolgens gekleurd via immunohistochemie, wat de identificatie van verschillende celtypen en cellulaire structuren in het corti-orgaan mogelijk maakt.

Vervolgens worden de coupes gemonteerd en afgebeeld met confocale microscopie om hogeresolutiebeelden te verkrijgen die de Z-posities definiëren. Door elk dik Vibram-coupe resultaten te verkrijgen, is confocale microscopie van de cellen en structuren in het cortisch orgaan mogelijk met minimale verstoring door het coupeproces. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals paraffine- en cryocoupes, is dat fysieke schade aan de cochlea wordt geminimaliseerd, wat een betere preservering van de cellulaire architectuur van het cortisch orgaan mogelijk maakt. Om het binnenoor te isoleren, wordt eerst een geëuthanaseerde volwassen muis onthoofd met een scheermes.

Open de schedel langs de middenlijn en verwijder vervolgens het brein met een pincet voorzichtig om elk oor bloot te leggen; schep beide binnenoren eruit. Dompel de binnenoren onder in een cryotube met verse 4% paraformaldehydehyde en schud deze overnight zachtjes bij vier graden Celsius. Was de volgende dag het fixeermiddel uit met drie spoelingen met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing en decalcificeer het volwassen weefsel door incubatie in 10% EDTA bij vier graden Celsius gedurende vijf dagen.

Spoel de binnenoren af en bewaar deze in 1x PBS tot ze klaar zijn voor verwerking. Maak 4% laagsmeltende agarose door de agarose aan 1x PBS toe te voegen en in de magnetron te verhitten totdat de agarose volledig is opgelost. Houd de gesmolten agarose in een waterbad van 55 °C tot het gebruik.

Verwijder het binnenoor uit de PBS met een pincet en plaats het op de bodem van een peel-away embedding mold. Pipetteer alle resterende vloeistof weg en vul de mal vervolgens volledig met MolForm om het binnenoor te bedekken, zodat er dwarsdoorsneden door hetst organon Corti kunnen worden gemaakt. Positioneer het binnenoor zodanig dat het lateraal wordt bekeken, met het laterale halvcirkelvormige kanaal in beeld.

Positioneer het binnenoor zodanig dat de lijn gevormd door het meest posterieure deel van de cochlea zich in een hoek van 45 graden bevindt ten opzichte van het beoogde snijvlak. Zodra het agros is gestold, wordt de plastic mal verwijderd. Gebruik een scheermesje om overtollig aros weg te snijden en een kubus te vormen.

Zorg ervoor dat er voldoende agar rondom het weefsel overblijft om het goed te ondersteunen. Bevestig tijdens het snijden de basis van de agarcube met secondelijm aan het Vibram-snijvlak, snijd secties met een dikte van 40 tot 100 micron en verzamel de plakjes in een schaaltje met 1× PBS met 0,1% Triton X 100. Gebruik hiervoor een pincet.

Disseceer de ARO's weg van de weefselcoupes. Breng de coupes over naar een schaal met verse 1x PBS met 0,1% Triton X 100, gebruik hiervoor een pipetpunt met een brede opening en ga verder met de antilichaamkleuring in een weefselkweekplaat. Nadat de antilichaamkleuring is voltooid, worden de weefselcoupes op een microscoopglas gemonteerd.

Om te voorkomen dat de dikke weefselcoupes worden geplet, brengt u een laag vacuümvet in een vierkant rondom de coupe aan om ruimte te creëren tussen het dekglas en het objectglas. Draag de weefselcoupe over naar een objectglas. Druk de randen van het dekglas stevig aan om een afdichting te creëren.

Als alternatief kan men 1 µL van een chromatografiehars met een bekende maaswijdte in elk van de vier hoeken pipetteren waar het dekglas zal rusten, het dekglas neerleggen en de randen met nagellak verzegelen vóór het maken van beelden. In het eerste beeld van een confocale z-stack door een organ van Corti-sectie zijn de binnenste haarcellen, aangrenzende binnenste haarcellen, buitenste haarcellen en Deiterscellen zichtbaar. Bij nucleaire kleuring zijn de pijlercellen zichtbaar door S100-antilichaamkleuring en verschijnen deze geel. Naarmate de z-stack door de sectie vordert met stappen van 3 µm, kan het aantal pijlercellen worden geteld door het verschijnen en verdwijnen van hun kernen te noteren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het binnenoor met een vibrotoom in coupes wordt gesneden, hoe immunohistochemie op deze coupes wordt uitgevoerd en hoe deze vervolgens met confocale microscopie worden afgebeeld. Deze eenvoudige procedure, die generaliseerbaar is naar elke antilichaam, waarborgt een maximale preservering van de cellulaire organisatie van het organ van Corti.