Name: Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Leer isotherme titratiecalorimetrie voor het bestuderen van ligand-macromolecuulbindingen. Deze methode bepaalt enthalpie en entropie in één experiment met E. coli dihydrofolaatreductase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie ​​MCB-0817827.

Isotherme titratie calorimetrie (ITC) is een gevestigde techniek die al de thermodynamische parameters (affiniteit, enthalpie en stoichiometrie) van een bindende interactie kan bepalen in een experiment. 1 ITC werkt door het titreren van een reactant in een tweede reactant onder isotherme omstandigheden. De gemeten signaal wordt de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd op interactie (binding) van de twee reactanten. Een reeks van injecties worden uitgevoerd en de warmte signaal zal nul nadert als de beperking van reactant verzadigd raakt. Montage van de isotherm geeft de thermodynamische parameters. Meerdere reviews beschikbaar die beschrijven de instrumentatie als de wiskunde van de gegevensverzameling en-analyse. 2,3 Terwijl andere calorimeters zijn beschikbaar (met name het ITC 200 met kleine volumes), hier beschrijven we een algemeen protocol voor de VP-ITC vervaardigd door MicroCal (nu onderdeel van GE Healthcare). 1. Voorbereiding van de monsters <ol><li> Met het oog op het macromolecuul en ligand in buffer voor te bereiden, een aantal potentiële problemen moeten worden aangepakt. Nauwkeurige past vereisen de juiste concentraties van het macromolecuul, de soorten die typisch gaat in de steekproef cel van de ITC, en ligand, de soorten in de injectiespuit. Omdat sommige eiwitten samenklonteren aan de hoge concentraties die nodig is voor de soorten in de injectiespuit, is meestal het eiwit geladen in het monster cel. De optimale macromolecuul concentratie wordt bepaald uit "c", het product van de voorspelde affiniteit van het systeem, die kan worden geschat met behulp van orthogonale methoden voorafgaand aan het gebruik van ICT, en de totale concentratie macromolecuul, waarbij c = K a * [M]. Optimale waarden van c range 10 tot 1000, een al is het mogelijk om accurate gegevens voor zwakke-bindende systemen te krijgen onder specifieke experimentele condities met c-waarden onder de ondergrens. 4 Zo moet de macromolecuul concentratie worden bepaald met deze reeks van c-waarden in het achterhoofd (dat wil zeggen, voor een K een van de 10 6 M -1, macromolecuul concentraties van 10 tot 1000 pm moet worden gebruikt). Voorkennis van de bindingsaffiniteit van het systeem kan helpen bij het minimaliseren van de eiwit gebruikt voor ITC dankzij een beter ontwerp van het ITC-experiment. De concentratie van het ligand groot genoeg moet zijn (7-25 keer meer geconcentreerd dan de K d voor de zwakste ligand-bindende site), zodat de verzadiging optreedt binnen het eerste derde tot de helft van de titratie. Nauwkeurige montage van de gegevens vereist ook de verzadiging van het signaal. Voor systemen met een hogere bindingsaffiniteit, moet een lagere concentratie ligand worden gebruikt om de verzadiging te vermijden te vroeg in de titratie, waardoor onjuiste past geven. Zodra de hitte van verdunning control (dat wil zeggen titratie van ligand in de buffer) is afgetrokken van de titratie, moet de enthalpie bij verzadiging benadering nul. </li><li> Omdat de kleine molecule onzuiverheden kan aanleiding geven tot artefactuele signalen in de ITC-metingen, is het het beste, indien mogelijk, dat het macromolecuul en ligand uitputtend worden gedialyseerd tegen buffer. Als alternatief kan kolomchromatografie, ontzouten spinnen kolommen of buffer ruil centrifugale filters (bijvoorbeeld Centricons) worden gebruikt om de buffer van het macromolecuul te veranderen. Als het ligand is een klein molecuul, kan het worden bereid met behulp van de dialyse buffer na het macromolecuul is gedialyseerd of door het dialyseren tegen dialysemembranen met cutoffs geschikt voor kleine moleculen (dat wil zeggen 100-500 Da voor een Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Verschillen in de samenstelling buffer tussen de ligand en macromolecuul oplossingen kan leiden tot artefacten signaal van de hitte van de verdunning van onzuiverheden in de monsters. Na bereiding, moet u controleren of de pH van de buffer, macromolecuul en ligand wedstrijd (± 0,05 pH-eenheden) als artefacten in de enthalpie kan ontstaan ​​als gevolg van protonatie effecten buffer. 5 Zorg ervoor dat u voldoende voor te bereiden van elke soort. Voor drievoud experimenten en een verdunning controle, zal de hoeveelheid die nodig is materiaal dat afhankelijk van de gebruikte ITC. Maar voor de meeste ITC instrumenten die ongeveer 2 ml monster cellen hebben, zal minimaal 6-7 ml van macromolecuul oplossing nodig is, en kan gemakkelijk worden bereid in 15 ml Falcon buizen. Voor 300 uL injectiespuiten, moet 1-2 ml oplossing voldoende, en kunnen worden bereid in een van beide valk buizen of microcentrifugebuizen. </li><li> Stof en andere deeltjes, kan leiden tot artefacten in de baseline van de ITC thermogram. Het is noodzakelijk dat ze worden verwijderd voordat het runnen van het experiment. Na bereiding van het monster voorraad oplossingen, moeten de monsters worden gecentrifugeerd in microcentrifugebuizen gedurende vijf minuten op 8000 tot 14.000 RPM te pellet deeltjes in de oplossing. Verwijder de bovenstaande vloeistof, zorg dat u de pellet te verstoren, en plaats deze in een nieuwe valk / microcentrifugebuis. Als reductanten zijn nodig om minder cysteines te behouden, gebruik lage concentraties en verse voorraden van β-Mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxyl) fosfine), of dithiothreitol elke artefacten te wijten aan reductant oxidatie te minimaliseren. Ook kan de aanwezigheid van organische oplosmiddelen in de buffer (gemeenschappelijk voor enkele kleine molecule liganden die methanol of DMSO kan nodig zijn om te kunnen worden oplosbare) veroorzaken signaal artefacten. Als organische oplosmiddelen nodig zijn voor het ligand, dan is het macromolecuul oplossing moet bevatten dezelfde concentratie op een signaal als gevolg van de hitte van verwatering van het organische oplosmiddel te vermijden. Kleine verschillen in samenstelling tussen de buffer ligand en macromolecuul te wijten aan cosolvents, zouten of pH zijn mogelijk tijdens de bereiding van de monsters. Het beste is om de verdunning van het ligand inchecken in het monster buffer of het monster buffer in het macromolecuul om ervoor te zorgen dat de warmte-signalen als gevolg van verschillen in de buffer inhoud geen gegevens louter voortkomt uit artefacten veroorzaken. </li><li> Controleer de concentratie van het macromolecuul en ligand zorgvuldig met behulp van technieken geschikt om uw systeem (zoals absorptie metingen, HPLC, colorimetrische assays, BCA assays voor eiwitten, etc) om hun exacte concentratie vast te leggen. Verschillen tussen de werkelijke concentratie en de concentratie wordt gebruikt om de isotherm fit zal leiden tot fouten in de stoichiometrie, enthalpie en bindingsaffiniteit bepaald op basis van het experiment. Het is gebruikelijk om ontgas de monsters om te voorkomen dat het signaal artefacten als gevolg van luchtbellen of het vrijkomen van opgeloste gassen tijdens de titratie, in het bijzonder bij hogere temperaturen. </li></ol> 2. Het opzetten van het Experiment <ol><li> Zorg ervoor dat het monster cel en injectiespuit worden gereinigd volgens de protocol van de fabrikant voor het laden van de macromolecuul en ligand. Spoel het monster cel twee of drie keer met 1,8 ml gedestilleerd water met behulp van de Hamilton spuit (gebruik voorzichtig met de Hamilton spuit als het vat gemakkelijk is gebroken of de naald gebogen). Volgende spoel het monster cel meerdere malen met 1,8 ml buffer. Load het monster cel met 1,8 ml van het macromolecuul oplossing, let daarbij goed op belvorming te voorkomen. </li><li> Vul de referentie-cel met gedestilleerd water. Voor de meeste buffers, gedestilleerd water is prima te gebruiken als de referentie-oplossing. Echter, voor buffers met een bijzonder hoge ionische sterkte of osmolaliteit, is het beter om de buffer te gebruiken als een referentie. </li><li> Verwijder de luchtbellen uit de blanco en de meetoplossing met behulp van de Hamilton spuit. Beweeg de naald van de spuit op-en langs de zijkanten van de cel kloppen eventuele luchtbellen die kunnen worden aan de onderkant van de cel en aan de goed naar de top van de cel. Verwijder overtollig volume van het monster en referentie-cellen. </li><li> Bevestig een plastic injectiespuit om de vulling poort van de injectiespuit met behulp van slangen. Spoel de injectiespuit met gedestilleerd water. Volgen door een buffer te spoelen. Zorg ervoor dat de injectiespuit wordt volledig ontruimd door het opstellen lucht door het systeem. Plaats de naald van de injectiespuit in de ligand-oplossing en trek de ligand oplossing in de injectiespuit totdat de hele spuit vol is. Ga door het tekenen van een klein overschot (ongeveer 50 ul of meer) in de haven en de bijgevoegde buizen. Sluit onmiddellijk de vulling poort van de spuit en verwijder de slang en plastic spuit. Zuiveren en vul de injectiespuit nog twee keer om eventuele luchtbellen te verwijderen van de injectiespuit. Haal de spuit uit de ligand-oplossing en veeg de kant met een kimwipe elke druppels te verwijderen, zorg dat u de spuit touch van de kimwipe omdat dit kan het volume te verwijderen van de injectiespuit. Wees ook voorzichtig niet te kloppen of pot de spuit vast zoals dit ook kan het verlies van volume van de spuit te veroorzaken. Plaats de injectiespuit in het monster cel. </li><li> Stel de parameters voor het uitvoeren van de ITC. Voor de binding systemen met sterke warmte-signalen, zal een groot aantal van de lage volume injecties geven meer datapunten voor de montage van (bijvoorbeeld 75 injecties van 3 pi). Voor systemen die warmte zwakke signalen, een klein aantal grote hoeveelheid injecties de voorkeur (bv. 33 injecties van 8 pi). Meestal worden er minder injecties met hogere volumes injectie gebruikt. Het kan enkele titraties aan de voorwaarden die het beste voor uw systeem te optimaliseren. Het is belangrijk op te merken dat de bindende enthalpie ofwel kan worden exotherme of endotherme, afhankelijk van het systeem dat wordt bestudeerd. Helaas, sommige systemen hebben een lage warmte-signalen, waardoor de warmte van de reactie moeilijk vast te stellen. Problemen met dergelijke systemen kan mogelijk worden ondervangen door het verhogen van de concentratie van het macromolecuul, het veranderen van de temperatuur van het experiment (afhankelijk van de warmtecapaciteit van het bindend systeem), en / of wijzigen van de pH of ionische sterkte van de buffer. </li><li> Ook rekening houden met de tijd die afstand tussen elke injectie. Het is noodzakelijk dat na elke injectie van ligand, het systeem is het tijd om evenwicht gegeven en de warmte signaal terug naar de uitgangswaarde voor de volgende injectie komt. Voor de meeste systemen, drie tot vijf minutes moet voldoende zijn. De tijd tussen de injecties moeten worden verhoogd voor systemen waarbij het evenwicht niet binnen vijf minuten. </li><li> Omdat er een aantal mixen zijn tussen de macromolecuul en ligand-oplossingen in de injectiespuit zodra deze is opgenomen in de steekproef cel, zal de eerste injectie te geven valse resultaten. Het beste is om kleine volumes (bijv. 2 pi) voor het eerst gebruikt een of twee injecties (zodat ze kunnen later worden weggegooid) en de daaropvolgende injecties te houden op de gewenste waarden. </li><li> Kies de temperatuur van het experiment (met 25 ° C is de meest voorkomende, maar temperatuur tussen 2 en 80 ° C kan worden gebruikt). Het is het beste te kiezen voor een temperatuur die andere experimenten (binding, kinetiek, etc.) uitgevoerd op de ligand-macromolecuul systeem wedstrijden. Het ITC kan worden ingesteld in evenwicht bij een temperatuur die afwijkt van de temperatuur van het experiment. Als het experiment zal worden uitgevoerd bij een temperatuur van meer dan 10 ° C verwijderd van kamertemperatuur, dan is het best om het evenwicht temperatuur in te stellen voor het instrument binnen de 5 ° C van de experimentele temperatuur. Dit vermindert de tijd die het instrument zal nemen om de temperatuur van het experiment te bereiken. De roeren snelheid van de spuit moet ook worden overwogen. Roeren is noodzakelijk voor adequate menging van het ligand en macromolecuul tijdens de titratie, maar sommige eiwitten gedestabiliseerd door snel roeren. Voor deze gevallen moet de roersnelheid worden vastgesteld op een relatief laag tarief. Zodra alle experimentele parameters zijn ingesteld, dan is het experiment kan worden gestart. </li><li> Als het experiment eenmaal is voltooid, kan het ITC worden gereinigd volgens protocol van de fabrikant. De oplossing in de steekproef cel aan het einde van het experiment kan worden gehouden als er extra experimenten op het macromolecuul-ligand complex mengsel gewenst zijn. </li><li> Herhaal de titraties ten minste een of twee keer om reproduceerbare gegevens op te halen. Voer een controle waar ligand is in de buffer getitreerd in de steekproef cel om de warmte van de verdunning te bepalen voor de ligand. Voor sommige systemen waar sprake is van coöperatieve binding, extra informatie over de bindende proces kan worden verkregen door het injecteren van het macromolecuul in de ligand. De verschillende oriëntaties injectie kan geven aanvullende informatie, die nuttig zijn voor de wereldwijde montage. 6 </li></ol> 3. Het analyseren van de gegevens <ol><li> Montage van de gegevens kunnen eenvoudig worden uitgevoerd met behulp van macro's in alle gegevens die passend programma (meestal geleverd door de fabrikant, samen met het instrument). Laad de eerste gegevens bestand. Controleer de ruwe thermogram op tekenen van luchtbellen of andere artefacten in het signaal. Als er artefacten (zoals pieken in de basislijn of pieken wanneer er geen injectie op dat tijdstip), noteer deze data punten zoals ze zouden moeten worden verwijderd. Vervolgens laadt u de ligand verdunning controle van gegevens, en aftrekken van de ligand verwatering gegevens van de binding isotherm. Op dit moment, verwijdert u alle valse gegevens punten, waaronder de eerste een of twee datapunten van de titratie waar verdunning artefacten optreden (zie stap 7). </li><li> Selecteer de gegevens die passend model (een bindingsplaats, twee / meerdere bindingsplaatsen, coöperatieve binding, etc) worden gebruikt om de data te passen. De gegevens kunnen worden passen bij de initiële schattingen van de fitting parameters, stoichiometrie (n), enthalpie (vermogen DH) en de bindingsaffiniteit (K a). Als voorkennis van de bindingsaffiniteit, of andere parameters, is bekend van orthogonale experimenten, dan zijn deze waarden kunnen worden ingevoerd. Dit helpt voorkomen dat de fit worden gevangen in de lokale minima tijdens de montage. Zodra de gegevens zijn geschikt voor de eerste titratie, herhaalt u de stappen 15 en 16 voor de rest van de isothermen. Als alternatief kunnen de gegevens geschikt zijn wereldwijd met behulp van programma's zoals SEDPHAT. Zes SEDPHAT kan bijzonder nuttig zijn in de wereldwijde montage van binaire complexe datasets (dwz moleculen A + B) in combinatie met ternaire complexe datasets (moleculen A + B + C). Bijvoorbeeld, in binding van molecuul C tot een AB-complex, is het niet altijd duidelijk of er misschien een signaal zijn voor de binding van C naar A of van B naar A (als A niet volledig verzadigd is). </li><li> Om te verzekeren dat de ITC de gegevens niet kunstmatig zijn, moet de bindingsaffiniteit en stoichiometrie verkregen van ITC worden vergeleken met een orthogonale methode. 7,8 Daarnaast is de ITC enthalpie waarde kan worden vergeleken met de enthalpie van een van't Hoff plot. 9 Het kan ook nuttig blijken om verschillende concentraties van het ligand of macromolecuul gebruiken als de absolute waarde van de warmte-signaal moeten toenemen met toenemende macromolecuul concentratie. Artefacten zijn het meest waarschijnlijk ontstaan ​​als de buffers in de cel en de spuit zijn niet voor elkaar. Een andere mogelijkheid voor artefacten komt voort uit onzuivere monsters. </li><li> Wij raden de gebruiker beginnen met eenvoudige binaire complex titraties waarvoor er vorige informatie beschikbaar is over K d en stoichiometry. Dan, als extra liganden te binden, kan de gebruiker proberen meer ingewikkelde ternair complex titraties, variëren van de ligand concentraties, en misschien schakelen van de spuit en celonderdelen. Een vergelijking van de enthalpie voor beide paden naar ternair complex ontstaan, moet worden additief als enthalpie is een state-functie. 10 Nogmaals, SEDPHAT 6 is waarschijnlijk hier heel nuttig zijn. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een representatief voorbeeld van een goed opgevoede titratie voor de binding van de cofactor NADPH te E. coli chromosomale dihydrofolaatreductase (ecDHFR). Panel (A) toont de ruwe thermogram; (B), de binding isotherm van de geïntegreerde thermogram passen met behulp van de een-site model in de Oorsprong software, en (C) de pasvorm van de isotherm het gebruik van de een bindingsplaats model van SEDPHAT langs de met fit residuen. Van de Origin-software, het gebruik van de een site bindend model, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, vermogen DH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, en ΔG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Past van de gegevens met behulp van Sedphat veroorloven een n van 0,94 ± 0,01, een K D van 0,195 ± 0,013 ΔM, een vermogen DH van -22.5 ± 0.2 kcal / mol, TΔS van -13,39 kcal / mol en ΔG van -9,15 kcal / mol.

<ol><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li>
<li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li>
<li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT%3A+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li>
<li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase%2C+a+D2+symmetric+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li>
<li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides%3A+calorimetric+and+NMR+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li>
<li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li>
<li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+%283%29-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li>
<li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2008%3A+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li>
<li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li>
<li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles%3A+a+thermodynamic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li>
<li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li>
<li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li>
<li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li>
<li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin%3ANADP%2B+reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li>
<li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li>
<li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

ITC wordt veelvuldig gebruikt bij het ​​bestuderen van ligand macromolecuul interacties, 11 met studies kijken naar eiwit-ligand, 12 DNA-ligand 13 en RNA-macromolecuul 14 studies. ITC kan zelfs worden uitgevoerd met vaste stoffen, zoals nanodeeltjes, dat een uniforme suspensies te vormen. 15 Verder ternaire systemen, waarbij een ligand nu al gebonden is aan het macromolecuul en een tweede ligand is getitreerd, kan worden gebruikt om de thermodynamica van te bepalen, voor Zo kan bijvoorbeeld binding van substraat van een enzym-cofactor-systeem. 7 studies ook worden uitgevoerd voor moleculen met een zeer hoge bindingsaffiniteit dat de detectiegrens van de ITC normaal gesproken hoger zijn dan door het uitvoeren van concurrentie bindingstesten met een zwakkere liganden. 16 Informatie over de zwakke binding liganden kunnen ook verkregen worden door de concurrentie assays. 17 De rol van water in binding kan worden onderzocht door ITC, 18 samen met de afhankelijkheid van de enthalpie op solvent reorganisatie. 19 Onlangs werden de thermodynamica van conformationele verandering van DnaK varianten gemeten na binding van ADP en ATP. 20 Eiwit-eiwit vereniging kan worden bestudeerd door ITC, waardoor informatie over hetero-complexen 21 en op homo-vereniging. 22 Temperatuur effecten op de binding enthalpie geeft de warmte capaciteit van de binding evenement. 2 Het aantal protonen geabsorbeerd of vrijgegeven na binding kan ook worden bepaald op basis van experimenten uitgevoerd in buffers met verschillende enthalpie van ionisatie. 5 Als er extra ICT-studies zijn uitgevoerd bij verschillende pH-waarden, dan is de pKa van de betrokken groep kan mogelijk worden bepaald. 23 Samen te vatten, nauwkeurige metingen van de concentratie van het macromolecuul en ligand zijn noodzakelijk voor een goede ITC experiment. Concentraties in het monster moeten ook binnen een juiste bereik om betrouwbare gegevens te krijgen. Voorzichtigheid is geboden met de buffer als kleine molecule onzuiverheden en de pH-mismatches zal artefacten veroorzaken in de thermogram.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> 1,7 ml microcentrifuge buizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon buizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 tot 959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 mL Hamilton spuit </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isotherme titratie calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand affiniteit

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isotherme titratie calorimetrie (ITC) is een handig hulpmiddel voor het begrijpen van de thermodynamische volledig beeld van een bindende reactie. In de biologische wetenschappen, macromoleculaire interacties zijn essentieel in het begrijpen van de machinerie van de cel. Experimentele condities, zoals de buffer en temperatuur, kan worden aangepast aan de specifieke binding systeem dat wordt bestudeerd. Echter, is zorgvuldige planning noodzakelijk omdat bepaalde ligand en macromolecuul concentratiebereiken nodig zijn om bruikbare gegevens te verkrijgen. Concentraties van het macromolecuul en ligand moeten nauwkeurig worden bepaald voor betrouwbare resultaten. Zorg moet ook worden genomen bij de voorbereiding van de monsters als onzuiverheden kan een aanzienlijke invloed hebben op het experiment. Bij het ITC experimenten, samen met de controles, goed worden uitgevoerd, nuttige bindende informatie, zoals de stoichiometrie, affiniteit en enthalpie, worden verkregen. Door het uitvoeren van bijkomende experimenten onder verschillende buffer of temperatuur, kan meer gedetailleerde informatie worden verkregen over het systeem. Een protocol voor de basis-setup van een ITC-experiment is gegeven.

Een algemeen protocol voor het gebruik van isotherme titratie calorimetrie de bindende thermodynamica voor biologische systemen te volgen met matige bindingsaffiniteiten wordt gepresenteerd.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) is een nuttig instrument om het volledige thermodynamische beeld van een bindingsreactie te begrijpen. In biologische ...

Het algemene doel van deze procedure is om een algemene techniek aan te tonen om de binding van liganden aan macromoleculen te bestuderen met behulp van isotherme titratiecalorimetrie, of ITC. Dit wordt bereikt door eerst oplossingen van het ligand en het macromolecuul voor te bereiden die vrij zijn van onzuiverheden en overeenkomen in zowel buffersamenstelling als pH. Vervolgens worden de uiteindelijke concentraties van de ligand- en macromolecuuloplossingen bepaald.Vervolgens worden de experimentele ITC-parameters ingesteld, gevolgd door de gegevensverzameling. De laatste stap van de procedure is het analyseren en fitten van de gegevens. Uiteindelijk worden resultaten die de interacties tussen ligand en macromolecuul tonen verkregen via een grafische analyse van de titratiegegevens om de bindings- en thermodynamische parameters te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze bindingstechniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals absorptie- en fluorescentietitraties, is dat de enthalpie en daarmee de entropie van de binding uit hetzelfde experiment kunnen worden bepaald. De monstervoorbereiding begint met het bepalen van de juiste concentraties voor zowel het macromolecuul als het ligand. Een cruciale stap om nauwkeurige ITC-fits te verkrijgen, en informatie over zaken die bij het berekenen van deze concentraties in overweging moeten worden genomen, kan worden gevonden in de geschreven procedure.In deze demonstratie wordt de binding van de cofactor N-A-D-P-H aan het chromosomale dihydrofolaatreductase-enzym van e coli onderzocht. Reconstitueer eerst het gelyofiliseerde macromolecuul in buffer tot de gewenste concentratie en los vervolgens de ligand op in het benodigde volume buffer. Controleer daarna of de pH-waarden van de macromolecuul- en ligandmonsters binnen plus of min 0,05 pH-eenheden van de buffer en van elkaar liggen. Centrifugeer zowel de oplossingen van het chromosomale dihydrofolaatreductase als van N-A-D-P-H gedurende vijf minuten in microcentrifugebuisjes.Bij 8.000 tot 14.000 RPM zullen alle deeltjes in de oplossing bezinken, wat artefacten in de basislijn van het ITC-thermogram kan veroorzaken. Controleer na centrifugatie zorgvuldig de concentraties van de macromolecuul- en ligandoplossingen via uv-vis-spectroscopie en noteer hun exacte concentraties.Maak vervolgens het juiste volume van elke ITC-oplossing door de voorbereide voorraadoplossingen van het macromolecuul en het ligand te verdunnen tot de benodigde experimentele concentraties. Ontgas tenslotte de monsters vóór het laden van het macromolecuul en het ligand in de ITC om signaalartefacten door luchtbellen of het vrijkomen van opgeloste gassen tijdens de titratie te voorkomen. Reinig de monstercel en de injectiespuit volgens het protocol van de fabrikant.Spoel de monstercel vervolgens twee of drie keer met 1,8 milliliters gedestilleerd water met behulp van een Hamilton-spuit. Wees voorzichtig bij het hanteren van de spuit, aangezien de lange naald gemakkelijk buigt. Spoel de monstercel daarna meerdere keren met hetzelfde volume buffer.Zodra de monstercel schoon is, vult u de cel met 1,8 milliliters van de macromolecuuloplossing. Stop met het toevoegen van het monster op het moment dat de oplossing uit de celsteel verschijnt, waarbij u zorgvuldig voorkomt dat er bellen ontstaan. Verwijder eventuele luchtbellen met de Hamilton-spuit door de naald voorzichtig langs de wanden van de cel op en neer te bewegen om aanwezige bellen los te tikken.Trek de spuit terug en verwijder elk overtollig volume uit de put aan de bovenzijde van de cel. Vul vervolgens de referentiecel met gedestilleerd water. Bevestig daarna met behulp van slang een plastic spuit aan de vulpoort van de injectiespuit.Open de vulpoort op de VP viewer 2000-console. Spoel de injectiespuit eerst met gedestilleerd water en daarna met een bufferoplossing. Zorg ervoor dat de injectiespuit volledig is geleegd door lucht door het systeem te trekken.Plaats de naald van de injectiespuit in de ligandoplossing en trek de oplossing in de spuit totdat deze volledig gevuld is. Trek een klein beetje extra volume in de poort en koppel de slang los direct na het sluiten van de vulpoort. Koppel de slang en de plastic spuitreiniging los en vul de injectiespuit tweemaal opnieuw om eventuele luchtbellen uit de spuit te verwijderen.Verwijder de injectiespuit uit de ligandoplossing en veeg eventuele druppels aan de zijkant af met een chemisch doekje. Zorg ervoor dat de tip van de spuit het doekje niet raakt en stoot niet tegen de spuit, omdat dit kan leiden tot volumeverlies uit de spuit. Plaats vervolgens de injectiespuit voorzichtig in de monstercel.Stel de parameters voor het uitvoeren van de ITC in met het V VP viewer 2000-programma van Micro Cal voor bindingssystemen. Bij sterke heatsignalen, zoals het chromosomale DIHYDROFOLATE reductase N-A-D-P-H-systeem, levert een groot aantal injecties met een laag volume meer datapunten voor de fitting. Omgekeerd is het voor systemen met zwakke heatsignalen bij voorkeur gebruik te maken van een klein aantal injecties met een groot volume.Stel voor de eerste een of twee injecties het injectievolume in op 2 µL. Deze injecties zullen uiteindelijk worden verworpen, omdat ze misleidende resultaten kunnen geven door menging tussen de liganden en de macromolecuuloplossingen. Houd bij het invoeren van de tijd tussen de injecties rekening met enkele minuten om het systeem te laten equilibreren en om het warmtesignaal terug te laten keren naar de basislijn.Kies vervolgens de temperatuur van het experiment en voer de roersnelheid van de spuit in die nodig is voor een adequate menging van het ligand en het macromolecuul tijdens de titratie. Start het experiment na het instellen van de experimentele parameters. Zodra het experiment is voltooid, moet het uiteindelijke warmtesignaal dicht bij verzadiging liggen. Reinig de ITC volgens het protocol van de fabrikant en herhaal de titraties nog ten minste één of twee keer om reproduceerbare gegevens te verkrijgen.Voer tot slot een controle uit waarbij de ligand in de buffer in de monstercel wordt getitreerd om de verdunningswarmte te bepalen; de aanpassing van de gegevens voor de ligand kan eenvoudig worden uitgevoerd met macro's in elk programma voor gegevensaanpassing. Origin seven, geleverd door micro Cal, wordt hier gebruikt om de gegevensaanpassing te demonstreren. Laad eerst het eerste gegevensbestand.Controleer het ruwe thermogram op tekenen van luchtbellen of andere artefacten in het signaal, zoals spikes in de basislijn of pieken in afwezigheid van een injectiepunt. Noteer deze datapunten, aangezien deze verwijderd moeten worden. Laad vervolgens de controledata van de ligandverdunning en trek deze op dit moment af van de bindingsisotherm.Verwijder alle foutieve datapunten, inclusief de eerste paar datapunten van de titratie waar gewoonlijk verdunningsartefacten optreden. Selecteer vervolgens het model voor de datafitting. Zodra het model is geselecteerd, kunnen de gegevens worden gefit door handmatig initiële schattingen van de fittingparameters in te voeren, waaronder de stoichiometrie, enthalpie en bindingsaffiniteit.Indien er echter voorafgaande kennis over parameters beschikbaar is uit orthogonale experimenten, moeten deze waarden worden ingevoerd, omdat ze helpen voorkomen dat de data tijdens het fitten vastlopen in lokale minima. Zodra de data voor de eerste titratie zijn gefit, moeten de stappen voor data-analyse worden herhaald voor de rest van de isothermen. Alternatief kunnen de data globaal worden gefit met behulp van een programma zoals said fat; start een globale fit door de data in origin op te slaan als een dot dat-bestand.Importeer vervolgens de gegevens in de genoemde software. Kies een model voor de aanpassing en pas de gegevens globaal aan; schakel heen en weer tussen de simplex- en Marquardt-Levenberg-fittingopties totdat de globale chi-kwadraatwaarde een minimum heeft bereikt. De representatieve ITC-procedure die in deze video wordt gedemonstreerd, monitort de binding van N-A-D-P-H aan chromosomale dihydrofolaatreductase van e coli.De exotherme binding van N-A-D-P-H aan dihydrofolaatreductase is zichtbaar in het ruwe thermogram doordat er warmte vrijkomt. De afnemende warmtesignalen bij elke opeenvolgende injectie wijzen op verzadiging van de binding, wat plaatsvindt tijdens de eerste helft van de titratie. De zuiverheid van de componenten en de goede overeenstemming van de buffers zijn af te leiden uit het verzadigde deel van de plot, waar slechts minimale warmtesignalen optreden als gevolg van de verdunningswarmte van het ligand.De gegevens werden gefit aan een single-site model met behulp van de Origin-software om de bindingsisotherm te bepalen. Twee datasets werden vervolgens gefit aan een single-site model met behulp van genoemde fit. De kleine waarden en het willekeurige patroon van de residuen geven aan dat de thermodynamische parameters redelijk zijn. Deze parameters zijn daarnaast gevalideerd door vergelijking met literatuurwaarden verkregen via orthogonale methoden.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de binding van liganden op macro-niveau bestudeert met behulp van een VP ITC van micro, door oplossingen correct te bereiden, experimentele parameters in te stellen en de gegevens te analyseren.

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

ITC is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de binding van een ligand aan zijn gastheer. In complexe systemen kan echter verschillende modellen passen bij de gegevens even goed. De hier beschreven methode is een middel om de passende bindende model voor complexe systemen te helderen en pak de bijbehorende thermodynamische parameters.

Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

This video demonstrates differential scanning calorimetry — a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Isothermische titratiecalorimetrie maatregelen warmtestroom vrijgelaten of geabsorbeerd in chemische reacties. Deze methode kan worden gebruikt voor enzym-katalyse kwantificeren. In deze paper, het protocol voor instrumentale setup, experiment loopt, en data-analyse wordt in het algemeen beschreven en toegepast op de karakterisering van enzymatische hydrolyse van ureum door jack bean urease.

Hot Biologische Katalyse: Isothermisch titratiecalorimetrie om enzymatische reacties karakteriseren

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een titratie ELISA wordt beschreven. Bovendien wordt een nieuw algoritme te evalueren van de titratie ELISAs en te verkrijgen van een dissociatieconstante van binding van een oplosbare ligand aan een receptor microtiterplaat plaat-geïmmobiliseerd gepresenteerd.

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

Metingen van de drug target betrokkenheid staan centraal in effectieve Geneesmiddelenontwikkeling en chemische sonde validatie. Hier, detail we een protocol voor het meten van de drug-target engagement met behulp van hoge inhoud imaging in een microplate-compatibele adaptie van de cellulaire thermische shift test (CETSA).

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

De thermische stabiliteit van enzymactiviteit is gemakkelijk gemeten door isothermische titratie calorimetrie (ITC). Meeste proteïne stabiliteit testen momenteel gebruikt maatregel eiwit ontvouwen, maar geven geen informatie over enzymatische activiteit. ITC kan directe bepaling van het effect van wijzigingen van het enzym op de stabiliteit van de enzymactiviteit.

Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

Leer isotherme titratiecalorimetrie voor het bestuderen van ligand-macromolecuulbindingen. Deze methode bepaalt enthalpie en entropie in één experiment met E. coli dihydrofolaatreductase.

Isotherme Titratie Calorimetrie voor het meten van macromolecuul-ligand Affiniteit

Meer video's verkennen