Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Het algemene doel van deze procedure is om fluorescerende neuronen binnen dikke hersendoorsneden gemakkelijker te visualiseren. Dit wordt bereikt door de hersenen eerst in een aeros plug holder in te bedden. De tweede stap van de procedure is het snijden van de hersenen in dikke plakjes op de compressed tome.

De derde stap van de procedure is het optisch transparant maken van de hersenseneden in een glycerolgradiënt. De laatste stap van de procedure is het monteren van de transparante hersenseneden op objectglazen voor fluorescentiebeeldvorming. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die een hoge resolutie van de expressie van fluorescente eiwitreporters in neuronen binnen dikke hersenseneden laten zien, via epifluorescentie- of confocale microscopie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals dunne coupes, seriële fluorescentiemicroscopie of multi-foton imaging, is dat deze veel sneller is, minder arbeidsintensief is en geen dure of geavanceerde microscopietechnieken vereist. Begin met het terughalen van het muizenhersenweefsel dat NC twee fixatie via cardiale perfusie heeft ondergaan en één tot twee uur is nagefixeerd bij 4 °C. Maak vervolgens een 2% hoge sterkte agarose-oplossing met een laag gelpunt in PBS en verhit deze in de magnetron tot deze is opgelost.

Breng de gesmolten agros over naar een reageerbuis en plaats deze in een warmteblok van 40 °C om de temperatuur te egaliseren. Terwijl de agros stabiliseert, wordt het gefixeerde hersenweefsel op de zuiger van de specimen-spuit gelijmd. Met Sano Aate-lijm wordt het gemonteerde weefsel ondergedompeld in een verzadigde sucrose-PBS-oplossing om het hersenoppervlak te coaten, waarna de zuiger in de zuigerbehuizing wordt getrokken. Pipetteer de warme agros in de zuiger, zodat het hersenweefsel volledig bedekt is, waarbij erop wordt gelet dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd.

Klem tenslotte de monsterspuit ongeveer één minuut lang vast met een koelblok. Om de aros in te stellen, plaatst u de monsterspuit met het ingebedde hersenweefsel in de gecomprimeerde houder. Lijn de rand van het mes nauwkeurig uit met de uitlaat van de monsterspuit en vul vervolgens het buffertank met PBS.

Draai aan de micrometer. Draai één schijfdikte vooruit om het ingebedde hersenweefsel uit de specimenspuit te duwen. Druk op de startknop van de bedieningseenheid om de eerste plak te genereren.

Herhaal het proces van het voortschuiven van het ingebedde weefsel en het indrukken van de startknop om het gewenste aantal coupes te genereren. Verzamel de coupes met een transferpipet en breng ze over naar een glazen inhalatiebuisje gevuld met PBS. Pipetteer het grootste deel van de PBS bij de verzamelde coupes weg en vervang deze door een 10% glycerol in PBS-oplossing. Schud het buisje voorzichtig bij vier graden Celsius op een tabletop rotatieschudder totdat de coupes naar beneden zakken.

Zet de geleidelijke zuivering voort door het proces van decanteren en opnieuw vullen te herhalen met 25%, 50% en vervolgens 75% glyceroloplossingen. Pipetteer de 75% glyceroloplossing af en vervang deze door 90% glycerol. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren en laatHet geheel equilibreren bij vier graden Celsius onder voorzichtig schudden.

Nu de coupes maximaal zijn geklaard, zullen ze niet langer zinken, maar vertonen ze een neutrale drijfkracht. Snijd met een pincet dubbelzijdige plakband in een open rechthoek met een rand van twee tot drie millimeter, passend bij het zichtbare gebied van een objectglas van 25 bij 75 millimeter. Plaats de breincoupes binnen de rand op het objectglas.

Plaats het dekglas voorzichtig op de plakband. Let erop dat er geen luchtbellen ontstaan en oefen druk uit om een afdichting te creëren; aspireer eventueel overtollig glycerol en verzegel vervolgens de randen van het dekglas door transparante nagellak aan te brengen. Zodra de verzegeling is opgedroogd, kan het preparaat worden bewaard in een objectglazendoos bij 4 °C of worden geïmageerd.

Gebruik onmiddellijk epi-fluorescentiemicroscopie. Het expressiepatroon van een viraal vector die enhanced GFP tot expressie brengt, is zichtbaar in een 200 µm dikke coronale sectie van muizenbreinweefsel. Hier wordt het gemarkeerde gebied van de epi-fluorescentieafbeelding met een hoge resolutie getoond middels confocale microscopie om individuele corticale neuronen van laag vijf te onthullen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gefixeerde dikke hersensecties prepareert voor snelle fluorescente beeldvorming met een hoge resolutie.