Name: Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Leer een snelle methode voor hoogresolutie fluorescentiebeeldvorming in semi-dikke hersensneden. Deze techniek maakt visualisatie van neuronale netwerken mogelijk met standaard microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door ondersteuning via het McNair Foundation, NARSAD en NINDS verlenen R00NS064171-03.

1. In situ hersenen fixatie * Bereid een 10 ml spuit (28 gauge naald) gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). * Bereid een 10 ml spuit (28 gauge naald) gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Reserveer een extra 5-10 ml van de PFA / PBS voor post fixatie. <ol><li> Injecteer experimentele muis intraperitoneaal met een dodelijke dosis van Avertin of Nembutal. </li><li> Zodra de muis wordt verdoofd, nat van de buik met ethanol en veilig met de muis naar de onderkant van een blad gelaagd met kurk, was, of siliconen elastomeer met dissectie pinnen. Met de buik naar boven, zet de vier poten naar het oppervlak - het verspreiden van deze zo breed mogelijk. </li><li> Pak de huid met een tang op het niveau van het borstbeen, en snijd dwars op de lever bloot te leggen. Up gesneden zijwaarts en vervolgens door de ribben en het middenrif. Verwijder de rib weefsel klep en verder te snijden tot het hart toegankelijk is. </li><li> Doorboren of knip het recht atrium om verspreid bloed af te voeren. </li><li> Spoelen resterende bloed uit de bloedsomloop door perfusie van PBS door linker hartkamer. </li><li> Toegang tot de dezelfde naald gat, fix hele muis door latere perfusie van PBS / PFA door middel van de linker hartkamer. </li></ol> 2. Dissection en hersenen extractie <ol><li> Verwijder het vel van hoofd, nek en schedel door te snijden om de gehoorgang en ogen banen, gevolgd door te trekken de huid naar voren om de schedel bloot te leggen. * Zie figuur 2 voor een illustratie van de stappen 2.2) tot 2.5) </li><li> Met behulp van een bot schaar, snijden dwars door het oog van de aansluiting via de nasale turbinate botten. Doe dit voor elke kant. De kopse moet juist voor de ogen en de olfactorische bollen. </li><li> Snijd de lengte van elke gehoorgang oogkas. </li><li> Met behulp van een klein dissectie schaar, knip het schedelbeen plaat bovenliggende het cerebellum van het ene oor naar het andere. </li><li> Met dezelfde dissectie schaar, knippen voorzijde over de middellijn tot het niveau van de olfactorische bollen. </li><li> Met behulp van een tang, verwijdert u elk bot plaatje van de hersenen, waarbij zorg aan een bindweefsel te verwijderen, zodat de hersenen intact blijft bij het optillen van het bot. </li><li> Snip optiek en hersenzenuwen, snijd de bovenste nekwervels, en verwijder de hersenen in fixeermiddel. </li><li> Post-fix voor 1-2 uur bij 4 ° C. Was de 3 keer 15 minuten elk in PBS. </li></ol> 3. Agarose inbedding <ol><li> Smelt 2% hoge sterkte, laag-gelpunt agarose type IB (Sigma catalogusnummer: A0576) in PBS zoutoplossing met magnetron. </li><li> Overdracht gesmolten agarose in een reageerbuis. Plaats reageerbuisje in een warme couveuse of water bad (40 ° -41 ° C) totdat de temperatuur evenwicht. </li><li> Lijm vast hersenweefsel op de zuiger van het specimen spuit met cyanoacrylaat lijm (figuur 3A). Borstel een dunne laag van verzadigde sucrose-PBS-oplossing op het oppervlak van het hersenweefsel aan de latere release van de agarose ring van de hersenen plakjes te vergemakkelijken. </li><li> Trek de zuiger naar beneden met hersenweefsel in de zuiger behuizing (Figuur 3B). </li><li> Pipet of giet warm agarose in de zuiger behuizing, die het hersenweefsel. Voorkomen dat luchtbellen in de agarose. Luchtbellen in de agarose zal afbreuk doen aan de slice kwaliteit. </li><li> Klem het preparaat spuit met een koud (0 ° tot -25 ° C) koelen blokkeren voor een minuut aan de agarose (Figuur 3C) in te stellen. </li></ol> 4. Snijden hersenen slice met de Compresstome <ol><li> Monteer het monster spuit met het hersenweefsel in de Compresstome (Figuur 3D). </li><li> Lijn de rand van het scheermesje nauw samen met de uitlaat van het monster spuit (figuur 3E). </li><li> Vul de buffertank met PBS-oplossing. </li><li> Naar voren Draai de micrometer een slice dikte van de agarose-hersenweefsel blok extruderen uit van het monster spuit. </li><li> Druk op de "start" knop op de controle-eenheid van de Compresstome aan het snijden proces te starten. </li><li> Herhaal de stappen 4.4) tot 4.5) totdat het gewenste schijfjes worden verkregen bij te bepalen dikte. </li><li> Oogst hersenen plakjes met kwast of pipet om flesjes of vlekken putten gevuld met PBS (figuur 3F). </li></ol> 5. Optische Clearing <ol><li> Bereid een 75% vol: vol oplossing van glycerol: PBS. </li><li> Giet (of pipet) van de helft van het volume van de PBS wassen van de verzamelde hersenen plakjes. </li><li> Voeg achterkant van het volume verwijderd met glycerol / PBS. </li><li> Laat met zachte mengen evenwicht bij 4 ° C tot de plakjes gootsteen. </li><li> Herhaal de stappen 6.2) tot 6.4) totdat een definitieve glycerol concentratie bereikt 75%. </li><li> Vervang de oplossing met 90% glycerol in PBS om de temperatuur ervan. * Opmerking: Zorg ervoor dat u luchtbellen te introduceren tijdens het toevoegen van glycerol-oplossingen. Langzaam giet oplossingen en meng voorzichtig, want luchtbellen zal bemoeien met uniform equilibraTIE en zal worden overgedragen naar slide montage. </li></ol> 6. Slice montage voor beeldvorming <ol><li> Cut dubbelzijdige afdichting lijm (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) in een open rechthoek om het zichtbare gebied van een micro-dia (Superfrost Plus, 25 passen x 75 x 1 mm, cat. # 48311-703, VWR ) met zijden 2-3 mm breed. </li><li> Leg de hersenen plakjes in het midden van het plakband rechthoek met behulp van een pipet of penseel. Verwijder overtollig glycerol met zachte aspiratie. </li><li> Schik de hersenen plakjes op dia in gewenste volgorde met een penseel. </li><li> Voorzichtig lagere dekking van glas (24 x 60 mm, cat. # 48383-139, VWR) op de tape, zorg ervoor dat u luchtbellen te introduceren. Voorzichtig druk uitoefenen op dekglas om contact met plakband te verzekeren. </li><li> Aspireren overtollige glycerol vanaf de randen tussen de glijbaan en dekglaasje. </li><li> Seal glijbaan en dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak. </li><li> Laten drogen voordat beeldvorming, of langdurig op te slaan in dozen schuiven bij 4 ° C. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Processing, imaging, en analyseren van fluorescent gelabelde hersenweefsel zijn onmisbaar geworden voor de studie van de neurobiologie. Veel van deze onderzoeken vereisen geavanceerde genetische manipulaties aan reporter uiting in gerichte neuronale subsets, gevolgd door zowel de lage-en hoge-resolutie afbeelding analyses te verkrijgen. Vaak experimentele en technische beperkingen maken het onmogelijk om dit soort gegevens te verkrijgen van hetzelfde dier, of op een snelle manier. Voorbereiding van de optisch-gewist, semi-dikke hersenen secties voor fluorescerende beeldvorming steun in deze uitdaging. Een voorbeeld van een intacte hersenen dikke plak voorzien van een genetisch gemodificeerd virus hondsdolheid ontworpen om te uiten EGFP en beeld gebracht met behulp van epifluorescerende en confocale microscopie is weergegeven in figuur 4 en respectievelijk Figuur 5. Voor epifluorescerende imaging hebben we gebruik gemaakt van een Leica M205 FA, en voor confocale beeldacquisitie gebruikten we een Zeiss LSM 510. Door de relatieve eenvoud van de bijgevoegde protocol, is deze methode kunnen opleveren nuttige beeldgegevens van weefsel te drukken tl-verslaggevers met een doorlooptijd van minder dan een dag, en is compatibel met zowel lage-en hoge-resolutie lichtmicroscopie. Als de onderzoeker ervoor kiest om extra postmortale etikettering methoden, immunohistochemische kleuringen, op te nemen of dunnere secties te maken, het protocol verlengt dienovereenkomstig. Echter, de hierboven beschreven methode is een eenvoudige en relatief high-throughput-methode voor de screening patronen van vitale reporter uitdrukking in intacte hersenen. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram diagraming de fixatie, dissectie, snijden, clearing, en monteren de procedure van semi-dikke hersenen plakken. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Diagram van sequentiële snijden stappen om de intacte hersenen van muizen te halen. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Stappen voor het monteren en snijd het hersenweefsel met behulp van de Compresstome. A) Plaatsing van hersenweefsel op snij-zuiger met behulp van superlijm. B) de opstelling beneden de gemonteerde hersenweefsel in de zuiger voor agarose inbedding. C) laten stollen van een agarose brein plug met behulp van een gekoeld compressie blok. D) Invoeging van agarose de hersenen plug-and-zuiger in Compresstome maaikamer. E) Aanpassing van scheermes aan de zuiger apparaat. F) snijden en het verzamelen van de hersenen in plakjes Compresstome buffer kamer. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Lichtmicroscopie beelden van een dikke plak van glycerol-geklaard hersenweefsel door de frontale cortex uiten versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP). A) Coronale slice door middel van een muis hersenen (200 um dik) voorzien van een virale vector die EGFP en belicht met een lage resolutie met behulp van een stereoscoop epifluorescerende. Schaal bar, 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Hoge vergroting afbeelding van fluorescent gelabelde laag 5 / 6 corticale neuronen in de hersenen een gewist dikke plak. A) Hoge resolutie confocale afbeelding van een maximale projectie Z-stack (150 um dik) door de regio gemarkeerd (figuur 4). Schaalbalk, 25 um.

<ol><li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPfister%2C+H+%22The+Connectome+Project%22">The Connectome Project</a>. , (2009).</li>
<li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+genome+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification%2C+and+properties+of+aequorin%2C+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan%2C+Aequorea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

Jian-Qiang Kong is een medewerker van Precisionary Instruments, Inc, dat een product dat gebruikt wordt in dit artikel produceert.

Gezien de wijdverbreide toepassing van het gebruik van fluorescerende eiwitten aan neuronale subsets doelstelling voor onderzoek via lichtmicroscopie, de noodzaak om snel het scherm, beeld, en analyseren van neurale netwerken binnen intact hersenweefsel is geworden van onschatbare waarde. Technische vooruitgang in de ontwikkeling van gebruiksvriendelijke virale vectoren, in vivo elektroporatie technieken, en genetisch gemodificeerde muizenstammen biedt nu een schijnbaar onuitputteli...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; Naam van het item</th&gt;<th&gt; Bedrijf</th&gt;<th&gt; Catalogus nummer</th&gt;<th&gt; Commentaar (optioneel)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Bot schaar</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt;-Of gelijkwaardig</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissectie schaar</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt;-Of gelijkwaardig</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Type IB agarose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Precisionary Instruments</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt;-Andere vibratomes zijn compatibel</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dubbelzijdig klevende</td&gt;<td&gt; Grace Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrost Plus dia&#39;s</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cover glas</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glycerol</td&gt;<td&gt; Merck Chemicals Inc</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt;-Of gelijkwaardig</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

een snelle aanpak van high-resolution imaging fluorescentie in semi-dik brain slices

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Een fundamentele doel om zowel fundamenteel en klinisch neurowetenschap is een beter begrip van de identiteit, moleculaire make-up, en patronen van connectiviteit die kenmerkend zijn voor neuronen in zowel de normale en zieke hersenen. Naar deze, heeft een grote inspanning is geplaatst op het bouwen van hoge-resolutie neuroanatomische maps 1-3. Met de uitbreiding van de moleculaire genetica en de vooruitgang in het licht microscopie is gekomen de mogelijkheid om niet alleen de neuronale morfologie query, maar ook de moleculaire en cellulaire samenstelling van individuele neuronen en hun bijbehorende netwerken 4. Belangrijke vooruitgang in het vermogen om te markeren en neuronen te manipuleren door middel van transgene en gentargeting technologieën in de knaagdieren nu toe dat de onderzoekers tot neuronale &#39;programma&#39; subsets naar believen 5-6. Ongetwijfeld, is een van de meest invloedrijke bijdragen aan de hedendaagse neurowetenschappen is de ontdekking en het klonen van genen die coderen voor fluorescerende eiwitten (KP&#39;s) in ongewervelde zeedieren 7-8, naast hun latere engineering een steeds groeiende toolbox van vitaal verslaggevers 9 opleveren. Het benutten van celtype-specifieke promotor activiteit gerichte FP uitdrukking rijden in discrete neuronale populaties biedt nu neuroanatomische onderzoek met genetische precisie. Techniek FP expressie in neuronen is enorm verbeterd ons begrip van de hersenen structuur en functie. Echter, imaging individuele neuronen en de bijbehorende netwerken in diepe hersenstimulatie weefsels, of in drie dimensies, bleef een uitdaging. Vanwege de hoge vetgehalte, zenuwweefsel is nogal ondoorzichtig en vertoont auto fluorescentie. Deze inherente biofysische eigenschappen maken het moeilijk om te visualiseren en het imago fluorescent gelabelde neuronen met een hoge resolutie met behulp van standaard epifluorescerende of confocale microscopie verder dan een diepte van tientallen micron. Te ontwijken deze uitdaging aan onderzoekers vaak gebruik serial thin-sectie imaging methoden en wederopbouw 10, of twee-foton laser scanning microscopie 11. De huidige nadelen aan deze benaderingen zijn de bijbehorende arbeidsintensieve weefsel preparaat, of kosten prohibitief instrumentatie respectievelijk. Hier presenteren wij een relatief snelle en eenvoudige methode om fluorescent gelabelde cellen te visualiseren in vaste semi-dikke sneden de hersenen van muizen met optische clearing-en beeldvorming. In de bijgevoegde protocol beschrijven we de methoden van: 1) de vaststelling van hersenweefsel in situ via intracardiale perfusie, 2) dissectie en verwijdering van hele hersenen, 3) stationaire hersenen inbedding in agarose, 4) precisie semi-dikke plak voorbereiding met behulp van nieuwe instrumenten vibratome , 5) clearing hersenweefsel door middel van een glycerol gradiënt, en 6) montage op glazen dia&#39;s voor lichtmicroscopie en de z-stack reconstructie (figuur 1). Ter voorbereiding van de hersenen plakjes we een relatief nieuw stuk van de instrumentatie de &#39;Compresstome&#39; VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Dit instrument is een semi-automatische microtoom uitgerust met een gemotoriseerde vooraf en blade-vibratie systeem met soortgelijke kenmerken in functie van andere vibratomes. In tegenstelling tot andere vibratomes, is het weefsel te worden gesneden gemonteerd in een agarose plug in een roestvrij stalen cilinder. Het weefsel wordt geëxtrudeerd bij de gewenste dikte van de cilinder, en snijd de forward oprukkende vibrerende mes. De agarose plug / cilinder-systeem zorgt voor reproduceerbare weefsel montage, uitlijning en precisie snijden. In onze handen, de &#39;Compresstome&#39; levert een hoge kwaliteit tissue slices voor de elektrofysiologie, immunohistochemie, en directe vaste weefsel montage en beeldvorming. In combinatie met optische clearing, hier tonen we de voorbereiding van de semi-dikke vaste hersencoupes voor hoge-resolutie fluorescerende beeldvorming.

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Een fundamenteel doel van zowel de basis- als de klinische neurowetenschappen is om de identiteiten, moleculaire samenstelling en connectiviteitspatronen beter te begrijpen die ...

Het algemene doel van deze procedure is om fluorescerende neuronen binnen dikke hersendoorsneden gemakkelijker te visualiseren. Dit wordt bereikt door de hersenen eerst in een aeros plug holder in te bedden. De tweede stap van de procedure is het snijden van de hersenen in dikke plakjes op de compressed tome.De derde stap van de procedure is het optisch transparant maken van de hersenseneden in een glycerolgradiënt. De laatste stap van de procedure is het monteren van de transparante hersenseneden op objectglazen voor fluorescentiebeeldvorming. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die een hoge resolutie van de expressie van fluorescente eiwitreporters in neuronen binnen dikke hersenseneden laten zien, via epifluorescentie- of confocale microscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals dunne coupes, seriële fluorescentiemicroscopie of multi-foton imaging, is dat deze veel sneller is, minder arbeidsintensief is en geen dure of geavanceerde microscopietechnieken vereist. Begin met het terughalen van het muizenhersenweefsel dat NC twee fixatie via cardiale perfusie heeft ondergaan en één tot twee uur is nagefixeerd bij 4 °C

a-rapid-approach-to-high-resolution-fluorescence-imaging-semi-thick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Etienne, F. et al. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward an injected compound in brain slices. It provides an overview of preparing mouse brain slices, injecting a chemoattractant test compound, and imaging fluorescently labeled microglia to visualize their responses.

Two-Photon Microscopy for Studying Microglial Process Attraction Toward a Compound in a Mouse Brain Slice

Source: Shimojo, H., et al. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (2019)In this video, cortical slice cultures from transgenic mouse embryos are used to monitor gene expression through Three-dimensional imaging. Bioluminescence, fluorescence, and bright-field images are used to visualize real-time gene expression during neuronal differentiation within the native tissue.

Real-Time Gene Expression Monitoring in Brain Slices via Three-Dimensional Imaging

Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.

Gemodificeerde Roller buis methode voor juist gelokaliseerd en repetitieve intermitterende Imaging tijdens langetermijnkweek van hersenen segmenten in een gesloten systeem

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.

Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Dit protocol beschrijft methoden voor het uitvoeren van magnetische resonantie beeldvorming, clearing en immunolabeling van intacte muizenhersenen met behulp van iDISCO +, gevolgd door een gedetailleerde beschrijving van beeldvorming met behulp van light-sheet microscopie en downstream analyses met behulp van NuMorph.

Whole-Brain Single-Cell Imaging en Analyse van Intacte Neonatale Muizenhersenen Met behulp van MRI, Tissue Clearing en Light-Sheet Microscopie

Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.

Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein

Leer een snelle methode voor hoogresolutie fluorescentiebeeldvorming in semi-dikke hersensneden. Deze techniek maakt visualisatie van neuronale netwerken mogelijk met standaard microscopie.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Meer video's verkennen