Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Het algemene doel van deze procedure is om de opname van nanodeeltjes in tumoren te kwantificeren met behulp van intravitale beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst aviaire embryo's uit de schaal te halen en te kweken. De tweede stap is het vestigen van xenografttumoren in het chorio-allantoïsmebraan (CAM) en deze ongeveer een week te laten groeien.

De derde stap van de procedure is het intraveneus injecteren van nanodeeltjes in de staart en het uitvoeren van real-time intravitale confocale beeldvorming van de xenotransplantatie-tumor. De laatste stap van de procedure is het excideren en doorsnijden van de tumor. Uiteindelijk wordt de opname van nanodeeltjes door de tumor gekwantificeerd aan de hand van de beelden, waarna een secundaire tumoranalyse kan worden uitgevoerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de generatie van beelden met een hoge resolutie mogelijk maakt om de dynamiek van nanoparticle-accumulaties in tumoren op microscopisch niveau te beoordelen. Bovendien is het met dit modelsysteem voor een enkele onderzoeker mogelijk om een zeer groot aantal experimentele groepen binnen twee weken te analyseren. Daarnaast is het Cory Alloid-membraan van de Shells-embryo's gemakkelijk toegankelijk voor fysieke manipulatie en niet-invasieve beeldvorming.

Mijn laboratorium richt zich op de ontwikkeling van nanodeeltjes voor gerichte moleculaire beeldvorming en geneesmiddelentoediening bij kanker. Onze zoektocht naar een snel en goedkoop xenograftmodel voor het uitvoeren van gedetailleerde opnameanalyses leidde ons naar het kippenembryo in het ei. Hier maken we gebruik van intravitale beeldvorming met een hoge resolutie om de opname van nanodeeltjes in menselijke tumorxenografts te evalueren in een aangepast model van het kippenembryo in het ei.

Bereid voor dit protocol bevruchte kiemeneieren voor op dag vier. Controleer met de standaardmethode of de embryo's bevrucht en levensvatbaar zijn door naar de hartslag te kijken en incubeer ze bij 38 °C met een relatieve luchtvochtigheid van ten minste 60% tot embryo-ontwikkeling. Op dag negen zijn de embryo's klaar voor inoculatie met tumorcellen.

Stel een micro-injector samen door een naald van 18 gauge te verbinden met een spuit van één milliliter met een stukje Tygon-slang van vijf tot zes inch. Steek de schuine punt van de naald voorzichtig in de slang. Ongeveer vier tot vijf inch van de slang moet vanaf de naaldpunt uitsteken.

Trek nu de tumorcel-suspensie via de slang in de spuit en keer deze om. Tik voorzichtig tegen de zijkant van de spuit en druk de zuiger in om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens een glazen micro-injectienaald aan het uiteinde van de slang en druk op de zuiger tot de celsuspensie de punt van de naald bereikt.

Inject nu, onder een dissectiemicroscoop, langzaam en voorzichtig 10.000 tot 100.000 kankercellen in de interstitiële ruimte binnen de cam. De cellen moeten een zichtbare bolus vormen binnen de cam; cellen die op het oppervlak van de cam zijn terechtgekomen, kunnen worden verwijderd door er lichtjes mee te deppen met een Kimwipe of een wattenstaafje. Plaats de embryo's nu terug in een incubator op 38 °C met een luchtvochtigheid van ten minste 60%.

Laat de tumor tot zeven dagen groeien en vasculariseren, totdat een diameter van ten minste vijf millimeter is bereikt. Voordat de nanodeeltjes worden afgebeeld, moeten ze worden gelabeld met een fluorescente kleurstof die compatibel is met de intravitale microscoop; bewaar deze bij vier graden Celsius in PBS, waar ze ten minste één jaar stabiel blijven. Centrifugeer vervolgens de nanodeeltjes gedurende één minuut om eventuele aggregaten te pelletteren voordat ze in de micro-injector worden opgezogen. Gebruik nu PBS om de nanodeeltjes te verdunnen en bereid een werkconcentratie van één milligram per milliliter voor om uiteindelijk 50 microgram nanodeeltjes in een volume van 50 microliters te injecteren.

Ga nu verder met de injecties op dag 16 van de embryonale ontwikkeling. Controleer of de tumoren voldoende gevasculariseerd zijn om de beste tumorhoudende embryo's intraveneus te selecteren. Injecteer een fluorescent dextrine met een laag molecuulgewicht dat spectraal onderscheidbaar is van de tumorcellen en nanodeeltjes.

Visualise vervolgens de dextrine onder een fluorescentiemicroscoop en selecteer de embryo's met de meest gevasculariseerde tumoren. Zodra de embryo's zijn geselecteerd, gebruik je een voorbereide micro-injector om ten minste 200 µL van de voorbereide nanodeeltjes toe te dienen. Keer de spuit om.

Tik voorzichtig tegen de zijkant en druk de zuiger in om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats nu een lange, taps toelopende glazen microinjectienaald in het uiteinde van de slang en druk de zuiger in totdat de nanodeeltjesoplossing de punt van de naald bereikt. Een stompe naald zal niet door het ectoderm dringen en een overmatig scherpe en dunne naald zal breken bij invoering in het weefsel.

Inject vervolgens intraveneus tussen de 30 en 200 µL nanodeeltjes in embryo's, distaal van de gewenste zijde die onmiddellijk na het injecteren van de nanodeeltjes gevisualiseerd moet worden. De tumoren zoals beschreven in de volgende sectie beginnen met het voorbereiden van de embryo-beeldvormingsunit. Breng eerst een dunne laag vacuümvet aan rond de omtrek van de beeldvormingspoort aan de onderzijde van het deksel.

Plaats vervolgens een glazen dekglas van 18 millimeter op de poort. Plaats nu het embryo in de eenheid, zodat het dekglas zich boven het gewenste beeldvormingsgebied bevindt. Laat het deksel van de eenheid langzaam zakken tot het dekglas net contact maakt met het embryo en draai het deksel vast.

Vul nu de schaal met het embryo in de beeldeenheid met water van 37 °C. Deze eenheid houdt het embryo op zijn plaats onder de spinning disc confocale microscoop bij de spinning disc confocale fluorescentiemicroscoop. Controleer of de temperatuur in de milieukamer 37 °C is.

Positioneer nu de beeldeenheid op de tafel zodat het dekglasvenster zich direct onder het microscoopobjectief bevindt en begin met het maken van beelden. Neem direct na de injectie en vervolgens met uursintervallen beeldstacks met een hoge resolutie van de tumor en de omringende vaten op.

Daarna zullen de beelden gedetailleerde structurele veranderingen weerspiegelen die optreden in de tumorvasculatuur. Het embryo kan tot 36 uur lang continu worden afgebeeld zonder dat het waterbad hoeft te worden vervangen. Om de opname van virale nanodeeltjes uit de beelden te kwantificeren, kan een softwarepakket zoals velocity worden gebruikt.

Selecteer eerst de tumor en bak deze af van het omliggende stroma. De selectie wordt vergemakkelijkt door de tumor te labelen met fluorescent dextrine. Bereken nu het gemiddelde fluorescentiesignaal van de nanodeeltjes in de tumor en in representatieve gebieden van het aangrenzende stroma.

Bereken vervolgens de ratio van het gemiddelde signaal. Versterk de tumorselectie ten opzichte van het gemiddelde signaal. Versterk de stromale selectie.

Een ratio groter dan één geeft aan dat de nanodeeltjes bij voorkeur in de tumor gelokaliseerd zijn. HT 29 colonkankercellen werden geïnjecteerd om een bolus van ongeveer één millimeter in diameter te vormen in de cam op dag negen. Na zeven dagen incubatie werden kippenembryo's intraveneus geïnjecteerd met een laagmoleculaire dextrine om de vascularisatie van de tumor te bevestigen.

Intraveneuze toediening van CPMV LOR 6 47 of gepegyleerde CPMV LOR 6 47-nanodeeltjes, gevolgd door real-time confocale beeldvorming met hoge resolutie, onthulde dat zowel CPMV- als gepegyleerde CPMV-nanodeeltjes de gehele vasculatuur snel labelden. Kwantificering van het fluorescentiesignaal in tumor- versus stromagebieden binnen 12 uur na injectie toonde aan dat de opname van gepegyleerde CPMV in de tumor ongeveer drie keer hoger was dan die van CPMV. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van intravitale beeldvorming met hoge resolutie om de opname van nanodeeltjes in tumorxenografts in een aviair embryo-model te evalueren, van de preparatie van de aviaire embryo's tot de xenografting van tumorcellen, de intraveneuze injectie van nanodeeltjes en de beoordeling van de nanodeeltjesopname in tumoren via real-time intravitale confocale beeldvorming.