Name: Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer hoe je nanodeeltje-opname in tumoren kwantificeert met intravitale beeldvorming in een kippenembryo-model. Deze methode biedt hoogwaardige, real-time analyse van tumorvasculatuur en nanodeeltje-accumulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door CCSRI Grant # 700537 en CIHR Grant # 84535 te JDL en NIH / NCI verlenen # CA120711-01A1-01A1 en CA120711 naar AZ. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regelgeving en richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Universiteit van Californië in San Diego, Dierverzorging en gebruiken aan de University of Western Ontario.

1. Enten van tumor in de aviaire embryo CAM <ol><li> Bereid shell-minder bevruchte kippenembryo's, zoals beschreven 8. </li><li> Op dag 9 van de embryonale ontwikkeling, monteren een micro-injector met behulp van een 18-gauge naald is aangesloten op 1 ml spuit. Snijd een 5-6 centimeter stuk Tygon slang (1 / 32 "inwendige diameter, 3 / 32" buitendiameter, 1 / 32 "wanddikte) en voorzichtig bevel van de naald in de slang. Ongeveer 4-5 cm van de slang moet uitstrekken van het uiteinde van de naald (figuur 1a). </li><li> Vul de spuit en slang met een celsuspensie. Plaats vervolgens een micro-injectie glazen naald aan het uiteinde van de slang en verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen. </li><li> Injecteer Dag 9 embryo's (Figuur 1b) onder een dissectie bereik met een lamp met 10.000-100.000 kankercellen als een bolus in de CAM (figuur 1c). Injecteer langzaam cellen en zorgvuldig ervoor te zorgen dat de naald op de juiste plaats voor de cellen om een ​​zichtbare bolus vormen binnen de CAM. Cellen die druppelen op de CAM oppervlak kan worden schoongemaakt met Kimwipe of andere applicator. </li><li> Keer terug naar embryo's bevochtigde incubator bij 38 ° C bij 60% luchtvochtigheid en laat tumor te groeien en vascularize (tot 7 dagen). </li></ol> 2. De voorbereiding van nanodeeltjes <ol><li> Om fluorescent gelabelde CPMV nanodeeltjes voor te bereiden voor injectie in het kippenembryo, verdunnen de virale nanodeeltjes (zoals gesynthetiseerd in 8 in PBS, pH 7,4, tot een concentratie van 100 ug / ml Vortex mengsel goed voor het gebruik en centrifugeer gedurende een minuut een te verwijderen. aggregaten. Ultrasoonbehandeling kan ook nuttig zijn, afhankelijk van conjugaten en de mate van aggregatie. Voorraden van de fluorescent gelabelde CPMVs stabiel zijn gedurende tenminste een jaar indien bewaard bij 4 ° C in het donker. Controleer regelmatig of voorraden door er een paar druppels op een glasplaatje en controleren op fluorescentie. Transmissie Elektronen Microscopie (TEM) kan ook gebruikt worden om te bepalen of de deeltjes bleef intact na conjugatie. </li><li> Kortom, kan een microgram van virale nanodeeltjes (in een eindvolume van 2 pl) worden toegevoegd aan de koper beklede roosters. Voeg vervolgens een gelijk volume van 2% uranylacetaat gedurende 1 minuut bij elektronenmicroscoop (Philips EM 410). </li></ol> 3. Intraveneuze injectie van fluorescent gelabelde virale nanodeeltjes <ol><li> Op dag 16, assembleren micro-injector zoals hierboven beschreven. Het opstellen van gewenste volume van virale nanodeeltjes door middel van de slang in de spuit (&gt; 200 pi). Verwijder voorzichtig eventuele luchtbellen. Steek micro-injectie glazen naald aan het uiteinde van de slang. Zorg ervoor dat de naald is zo lang en taps toelopende mogelijk (Figuur 2a). Als de naald is te bot, zal het niet kunnen doorboren via het ectoderm en zal niet aan het schip binnen te dringen. Als de naald is te scherp, zal de tip instorten bij het betreden van weefsel. </li><li> Spuit 100 ul van 1 mg / ml fluoresceïne dextran (MW 70.000 Da, Invitrogen) in tumor dragende embryo distaal van de gewenste site te visualiseren (Figuur 3d). Succesvolle canulatie van CAM ader is duidelijk door het opruimen van bloed in het pad van de injectie debiet (Figuur 2b). Beoordeel vasculaire lek een uur na de injectie. </li><li> Spuit 50 ul van 1 mg / ml oplossing van CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) of gepegyleerd CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) in de embryo's met tumoren met vasculaire lekkage distaal van de gewenste site aan gevisualiseerd worden. </li><li> Afbeelding tumoren onmiddellijk en elk uur na het injecteren met behulp van een Zeiss examinator Z1 rechtop microscoop uitgerust met een Yokogawa draaiende schijf, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-camera. </li></ol> 4. Real-time beeldvorming intravitale <ol><li> Te monteren het embryo imaging unit, een dun laagje van vacuüm vet rond de omtrek van de imaging-poort aan de onderkant van het deksel van de embryo imaging unit, en passen een 18 mm glazen dekglaasje op de haven. </li><li> Plaats de embryo zodanig dat de dekglaasje zal het gewenste gebied voor de beeldvorming te dekken. Langzaam de deksel totdat het dekglaasje net contact maakt met het embryo, en schroef het deksel op het apparaat om het te zijn plaats te houden (figuur 2c). </li><li> Voeg het water verwarmd tot 37 ° C in het embryo beeldeenheid buiten het schaaltje met het embryo, en vervolgens de gehele eenheid plaats op het podium van een rechtopstaande confocale microscoop met de binnenkant klimaatkamer evenwicht tot 37 ° C. </li><li> Plaats de beeldeenheid met de embryo onder de draaiende schijf confocale fluorescentie microscoop (figuur 2e). De beeldeenheid houdt het embryo in en houden het gezichtsveld vast tijdens het vastleggen van beelden, zodat voor zowel de drie-dimensionale Z stacks en time-lapse beelden worden vastgelegd. We verwerven en analyseren van drie-dimensionale time-lapse beelden met behulp van Perkin Elmer's (voorheen Improvisation) Volocity software pakket (figuur 3a). Acquire een hoge-resolutie driedimensionale stapel van de tumor en de omringende bloedvaten te visualiseren detailed structurele analyses op specifieke tijdstippen. Acquire driedimensionale schoorstenen op regelmatige tijdstippen om gedetailleerde structurele veranderingen in de tumorvasculatuur kaart. Afbeelding tumoren elk uur na de injectie. </li><li> Kwantificeren de opname van virale nanodeeltjes door het berekenen van de gemiddelde Alexa Fluor (AF) 647 signaal binnen de geselecteerde gebieden in de tumor of in het stroma (niet-tumor gebied) met behulp van beeld kwantificatie software zoals Volocity (Perkin Elmer). De tumor stroma ratio berekend door de gemiddelde AF 647-signaal in de tumor meer dan de gemiddelde AF 647-signaal in het stroma. Een tumor / stroma-ratio hoger dan 1 geeft aan dat de nanodeeltjes wordt ingenomen door de tumor. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: In het voorbeeld hier beschreven, we geïnjecteerd HT-29 dikke darm kankercellen naar een bolus van ongeveer 1 mm in grootte vorm binnen de CAM van de dag 9 kippenembryo's (Figuur 1b). Na inoculatie werden de embryo's gekweekt voor 7 dagen in een vochtige incubator om voldoende groei van de tumor en de vascularisatie (figuur 1c) toe te staan. Embryo's werden intraveneus geïnjecteerd met een laag moleculair gewicht dextran aan tumor vascularisatie te bevestigen, en de tumoren werden gevisualiseerd onder de Zeiss AxioExaminer Z1 rechtop microscoop (figuur 2d). Na intraveneuze toediening van CPMV-AF 647 of CPMV-PEG-AF 647 nanodeeltjes (Figuur 3a en b), hoge-resolutie real-time confocale imaging (figuur 2e) bleek dat zowel de CPMV en CPMV-PEG nanodeeltjes snel bestempeld als de gehele vaatstelsel, maar de opname van CPMV-PEG door de tumor was ongeveer drie keer hoger dan CPMV na 12 uur (figuur 3a). De relatieve tumor opname van nanodeeltjes werd bepaald met behulp van beeldanalyse-software (Volocity van Perkin Elmer). Regio's van belang zijn geselecteerd binnen en buiten de tumor (in de stromale compartiment) en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elk werd bepaald. Worden uitgedrukt als tumor / stroma ratio. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Micro-injectie van tumoren in de CAM van een aviaire embryo. (A) Het micro-injectie apparaat is samengesteld uit de onderdelen zoals aangegeven. (B) Aviaire embryo's op dag 9 zijn klaar om te worden ingeënt met tumor als de CAM heeft verspreid naar het gehele oppervlak te dekken. (C) Op dag 16, zal de tumor gegroeid tot maximaal 1 cm in diameter (stippellijn) en is klaar voor de injectie met nanodeeltjes. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Nanodeeltje injectie en intravitale beeldvorming. Injectie onder een microscoop met dissectie (a) de tip van de naald microinjector klaar om te worden geïnjecteerd in de ader CAM en (b) de microinjector naald ingebracht in de ader (aangegeven met pijl) en nanodeeltjes geïnjecteerd in de bloedstroom (gezien door clearing van het bloed). (C) Imaging unit met aviaire embryo met het dekglaasje interface direct met de CAM. (D) Alvorens met nanodeeltjes injectie, is tumor vascularisatie beoordeeld aan de hand intravitale beeldvorming na injectie van fluoresceïne dextran. (E) Imaging eenheid waarin de embryo geplaatst op het toneel van een rechtopstaande confocale microscoop in een temperatuur-gereguleerde behuizing ingesteld op 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Intravitale visualisatie van nanodeeltjes opname in de menselijke tumoren. Tumoren worden gevisualiseerd 7 uur na injectie van (een) CPMV-AF647 en (b) CPMV-PEG-AF647. d) Excisie van de tumor zijn van aviaire embryo voor verdere analyse.

<ol><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).</li>
<li>Judenhofer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+PET-MRI%3A+a+new+approach+for+functional+and+morphological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging.</a> Nat Med. 14, 459-465 (2008).</li>
<li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li>
<li>Chambers, A. F., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+experimental+metastatic+ability+of+heterologous+tumor+cells+in+the+chick+embryo+after+DNA-mediated+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer.</a> Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).</li>
<li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Leong, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3B+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+viral+nanoparticles+for+biomedicine%3A+the+impact+of+PEG+chain+length+on+VNP+cell+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo.</a> Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Het chorion-membraan (CAM) van het aviaire embryo is een bruikbaar model om de vasculaire dynamiek en farmacokinetiek van menselijke tumoren te beoordelen. De structuur en de positie van de CAM staat een hoge kwaliteit beeld acquisitie en is geschikt voor vele soorten kanker xenografts zonder invasieve chirurgische procedures. Bovendien, kanker tumor xenotransplantaten geïmplanteerd in het chorion membraan worden gevasculariseerd binnen 7 dagen en biedt een snelle, goedkope en semi-high-throughput middel om de ophoping van nanodeeltjes in tumorweefsel te beoordelen. Aangezien kanker xenotransplantaten geïmplanteerd in de CAM van shell-loze kippenembryo&#39;s zijn toegankelijk voor de hoge-resolutie optiek van een rechtopstaande epifluorescentie of confocale microscoop, contextuele en temporele informatie met betrekking tot nanodeeltjes opname in de tumorvasculatuur gemakkelijk kan worden verkregen. Kanker xenotransplantaties in dit model hebben de neiging om te groeien lateraal over de CAM, wat resulteert in tumoren die zijn groot, terwijl de resterende minder dan 200 m diepte. Dit maakt hen bijzonder goed geschikt voor intravitale beeldvorming, want standaard epifluorescentie microscopen effectief kan doordringen in de hele tumor massa. In tegenstelling, tumoren geïmplanteerd in ofwel oppervlakkig of orthotope sites binnen de muis vermenigvuldigen in drie dimensies, waardoor het moeilijk is om nauwkeurig te lokaliseren nanodeeltjes diep binnen deze tumoren door niet-invasieve technieken. Wij hebben dit model gebruikt om het gebruik van quantum dots, liposomen, en ijzeroxide nanodeeltjes in een aantal menselijke tumoren xenotransplantaten beoordelen, aandacht voor de mogelijkheden voor dit model geschikt te zijn voor de in vivo analyse van een breed scala aan nanodeeltjes formuleringen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens Naam / Equipment </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Bevruchte eieren Leghorn </td><td> Frey `s Broederij, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel roterend gereedschap </td><td> Dremel </td><td></td><td> Kunt elk gewenst model </td></tr><tr><td> Dremel cutoff wielen niet. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman incubator </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Polystyreen wegen boten </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Vierkante petrischalen </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid rubber container met deksel </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> gaten geboord in de zijkant </td></tr><tr><td> Verticale pipet puller </td><td> David Kopf Instrumenten </td><td> model 720 </td><td> Instellingen: 16.3 (verwarming) en 2.3 (solenoid) </td></tr><tr><td> Natrium borosilicaatglas capillaire buizen </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1,0 mm; ID 0,58 mm; 10-cm lengte) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS) (1x), vloeibaar </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypsine, 0,05% (1X) met EDTA 4NA, vloeibare </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Warmte te inactiveren </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td> Eppendorf model 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Fine-point pincet </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 buis </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 ft (1/32-inch binnendiameter, 3/32-inch buitendiameter, 1/32-inch wanddikte </td></tr><tr><td> Injectienaalden voor injecties 18-gauge naalden </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Doos van 100 </td></tr><tr><td> 1 ml spuiten voor injecties </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Doos van 100 </td></tr><tr><td> Fiber-optische microscoop illuminator </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata zaden (California black-eye niet. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Indoor groei lichten </td><td> Sunlite, Gardener&#39;s Supply </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methyl-PEO4-NHS ester </td><td> Doorboren </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, PEG succinimidylester, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 carbonzuur (succinimidylester) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 succinimidylester * 6-isomeer * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibasisch monohydrogen fosfaat </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (voor phopshate buffer) </td></tr><tr><td> Monobasisch diwaterstoffosfaat </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (voor phopshate buffer) </td></tr><tr><td> Superose 6 grootte-uitsluiting column </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA Explorer 100 Chromatograph </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA high flow kit </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Swing emmer </td></tr><tr><td> 50,2 Ti rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Vaste hoek </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Centrifugaal Filter Units </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa afgesneden </td></tr><tr><td> Gradient voormalige </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextran, fluoresceïne, 70.000 MW, anionische </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Draaiende schijf confocale fluorescentie microscoop </td><td> Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescentie wide-field microscoop </td><td> Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-camera </td><td> Quorum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuur behuizing eenheid voor microscoop </td><td> Precisie Plastics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Vacuum vet </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Circulaire dekglaasjes nee. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity software </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kippenembryo behuizing </td><td></td><td> op maat gefabriceerd </td><td></td></tr><tr><td> Delicate schaar </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formaline </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Gebruik in fumehood </td></tr><tr><td> Optimale Snijden </td><td> Visser; Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatuur (LGO) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kunststof matrijzen </td><td> Visser </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Verleng goud met DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Wegwerp bladen voor cryostaat </td><td> Visser </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluatie van de nanodeeltje opname in tumoren in real time via intravitale imaging

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

De huidige technieken voor beeldvorming van tumoren, zoals echografie, MRI, PET en CT, niet in staat zijn om hoge resolutie beelden leveren voor de beoordeling van nanodeeltjes opname in tumoren op microscopisch niveau 1,2,3, met de nadruk het nut van een geschikte xenograft model waarin om gedetailleerde opname analyses uit te voeren. Hier gebruiken we een hoge resolutie imaging intravitale aan nanodeeltjes opname te evalueren in menselijke tumoren xenotransplantaten in een gewijzigde, shell-less kippenembryo model. De kip embryo model is bijzonder geschikt voor deze in vivo analyses, want het ondersteunt de groei van menselijke tumoren, is relatief goedkoop en vereist geen verdoving of een operatie 4,5. Tumorcellen formulier volledig gevasculariseerd xenotransplantaten binnen 7 dagen wanneer geïmplanteerd in het chorion-membraan (CAM) 6. De resulterende tumoren worden gevisualiseerd door niet-invasieve real-time, hoge-resolutie beeldvorming die kan worden gehandhaafd tot 72 uur met weinig impact op zowel de host-of tumor-systemen. Nanodeeltjes met een breed scala van maten en formuleringen toegediend distaal van de tumor kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd als ze door de bloedbaan, extravasaat van lekkende tumorvasculatuur, en zich ophopen op de tumor site. We beschrijven hier de analyse van nanodeeltjes afgeleid van Cowpea mosaic virus (CPMV) versierd met nabij-infrarood fluorescerende kleurstoffen en / of polyethyleen glycol polymeren (PEG) 7, 8, 9,10,11. Bij intraveneuze toediening, zijn deze virale nanodeeltjes snel geïnternaliseerd door endotheelcellen, wat resulteert in de wereldwijde etikettering van het vaatstelsel zowel buiten als binnen de tumor 7,12. PEGylering van de virale nanodeeltjes verhoogt hun plasma half-life, verlengt hun tijd in de circulatie, en uiteindelijk verbetert hun accumulatie in de tumoren via de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect 7, 10,11. De snelheid en mate van accumulatie van nanodeeltjes in een tumor wordt gemeten over de tijd met behulp van beeldanalyse-software. Deze techniek biedt een methode om zowel te visualiseren en te kwantificeren nanodeeltjes dynamiek in menselijke tumoren.

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Huidige technologieën voor tumorbeeldvorming, zoals echografie, MRI, PET en CT, zijn niet in staat om beelden met een hoge resolutie te leveren voor de beoordeling van nanodeeltjes ...

Het algemene doel van deze procedure is om de opname van nanodeeltjes in tumoren te kwantificeren met behulp van intravitale beeldvorming. Dit wordt bereikt door eerst aviaire embryo's uit de schaal te halen en te kweken. De tweede stap is het vestigen van xenografttumoren in het chorio-allantoïsmebraan (CAM) en deze ongeveer een week te laten groeien.De derde stap van de procedure is het intraveneus injecteren van nanodeeltjes in de staart en het uitvoeren van real-time intravitale confocale beeldvorming van de xenotransplantatie-tumor. De laatste stap van de procedure is het excideren en doorsnijden van de tumor. Uiteindelijk wordt de opname van nanodeeltjes door de tumor gekwantificeerd aan de hand van de beelden, waarna een secundaire tumoranalyse kan worden uitgevoerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de generatie van beelden met een hoge resolutie mogelijk maakt om de dynamiek van nanoparticle-accumulaties in tumoren op microscopisch niveau te beoordelen. Bovendien is het met dit modelsysteem voor een enkele onderzoeker mogelijk om een zeer groot aantal experimentele groepen binnen twee weken te analyseren. Daarnaast is het Cory Alloid-membraan van de Shells-embryo's gemakkelijk toegankelijk voor fysieke manipulatie en niet-invasieve beeldvorming.Mijn laboratorium richt zich op de ontwikkeling van nanodeeltjes voor gerichte moleculaire beeldvorming en geneesmiddelentoediening bij kanker. Onze zoektocht naar een snel en goedkoop xenograftmodel voor het uitvoeren van gedetailleerde opnameanalyses leidde ons naar het kippenembryo in het ei. Hier maken we gebruik van intravitale beeldvorming met een hoge resolutie om de opname van nanodeeltjes in menselijke tumorxenografts te evalueren in een aangepast model van het kippenembryo in het ei.Bereid voor dit protocol bevruchte kiemeneieren voor op dag vier. Controleer met de standaardmethode of de embryo's bevrucht en levensvatbaar zijn door naar de hartslag te kijken en incubeer ze bij 38 °C met een relatieve luchtvochtigheid van ten minste 60% tot embryo-ontwikkeling. Op dag negen zijn de embryo's klaar voor inoculatie met tumorcellen.Stel een micro-injector samen door een naald van 18 gauge te verbinden met een spuit van één milliliter met een stukje Tygon-slang van vijf tot zes inch. Steek de schuine punt van de naald voorzichtig in de slang. Ongeveer vier tot vijf inch van de slang moet vanaf de naaldpunt uitsteken.Trek nu de tumorcel-suspensie via de slang in de spuit en keer deze om. Tik voorzichtig tegen de zijkant van de spuit en druk de zuiger in om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens een glazen micro-injectienaald aan het uiteinde van de slang en druk op de zuiger tot de celsuspensie de punt van de naald bereikt.Inject nu, onder een dissectiemicroscoop, langzaam en voorzichtig 10.000 tot 100.000 kankercellen in de interstitiële ruimte binnen de cam. De cellen moeten een zichtbare bolus vormen binnen de cam; cellen die op het oppervlak van de cam zijn terechtgekomen, kunnen worden verwijderd door er lichtjes mee te deppen met een Kimwipe of een wattenstaafje. Plaats de embryo's nu terug in een incubator op 38 °C met een luchtvochtigheid van ten minste 60%.Laat de tumor tot zeven dagen groeien en vasculariseren, totdat een diameter van ten minste vijf millimeter is bereikt. Voordat de nanodeeltjes worden afgebeeld, moeten ze worden gelabeld met een fluorescente kleurstof die compatibel is met de intravitale microscoop; bewaar deze bij vier graden Celsius in PBS, waar ze ten minste één jaar stabiel blijven. Centrifugeer vervolgens de nanodeeltjes gedurende één minuut om eventuele aggregaten te pelletteren voordat ze in de micro-injector worden opgezogen. Gebruik nu PBS om de nanodeeltjes te verdunnen en bereid een werkconcentratie van één milligram per milliliter voor om uiteindelijk 50 microgram nanodeeltjes in een volume van 50 microliters te injecteren.Ga nu verder met de injecties op dag 16 van de embryonale ontwikkeling. Controleer of de tumoren voldoende gevasculariseerd zijn om de beste tumorhoudende embryo's intraveneus te selecteren. Injecteer een fluorescent dextrine met een laag molecuulgewicht dat spectraal onderscheidbaar is van de tumorcellen en nanodeeltjes.Visualise vervolgens de dextrine onder een fluorescentiemicroscoop en selecteer de embryo's met de meest gevasculariseerde tumoren. Zodra de embryo's zijn geselecteerd, gebruik je een voorbereide micro-injector om ten minste 200 µL van de voorbereide nanodeeltjes toe te dienen. Keer de spuit om.Tik voorzichtig tegen de zijkant en druk de zuiger in om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats nu een lange, taps toelopende glazen microinjectienaald in het uiteinde van de slang en druk de zuiger in totdat de nanodeeltjesoplossing de punt van de naald bereikt. Een stompe naald zal niet door het ectoderm dringen en een overmatig scherpe en dunne naald zal breken bij invoering in het weefsel.Inject vervolgens intraveneus tussen de 30 en 200 µL nanodeeltjes in embryo's, distaal van de gewenste zijde die onmiddellijk na het injecteren van de nanodeeltjes gevisualiseerd moet worden. De tumoren zoals beschreven in de volgende sectie beginnen met het voorbereiden van de embryo-beeldvormingsunit. Breng eerst een dunne laag vacuümvet aan rond de omtrek van de beeldvormingspoort aan de onderzijde van het deksel.Plaats vervolgens een glazen dekglas van 18 millimeter op de poort. Plaats nu het embryo in de eenheid, zodat het dekglas zich boven het gewenste beeldvormingsgebied bevindt. Laat het deksel van de eenheid langzaam zakken tot het dekglas net contact maakt met het embryo en draai het deksel vast.Vul nu de schaal met het embryo in de beeldeenheid met water van 37 °C. Deze eenheid houdt het embryo op zijn plaats onder de spinning disc confocale microscoop bij de spinning disc confocale fluorescentiemicroscoop. Controleer of de temperatuur in de milieukamer 37 °C is.Positioneer nu de beeldeenheid op de tafel zodat het dekglasvenster zich direct onder het microscoopobjectief bevindt en begin met het maken van beelden. Neem direct na de injectie en vervolgens met uursintervallen beeldstacks met een hoge resolutie van de tumor en de omringende vaten op.Daarna zullen de beelden gedetailleerde structurele veranderingen weerspiegelen die optreden in de tumorvasculatuur. Het embryo kan tot 36 uur lang continu worden afgebeeld zonder dat het waterbad hoeft te worden vervangen. Om de opname van virale nanodeeltjes uit de beelden te kwantificeren, kan een softwarepakket zoals velocity worden gebruikt.Selecteer eerst de tumor en bak deze af van het omliggende stroma. De selectie wordt vergemakkelijkt door de tumor te labelen met fluorescent dextrine. Bereken nu het gemiddelde fluorescentiesignaal van de nanodeeltjes in de tumor en in representatieve gebieden van het aangrenzende stroma.Bereken vervolgens de ratio van het gemiddelde signaal. Versterk de tumorselectie ten opzichte van het gemiddelde signaal. Versterk de stromale selectie.Een ratio groter dan één geeft aan dat de nanodeeltjes bij voorkeur in de tumor gelokaliseerd zijn. HT 29 colonkankercellen werden geïnjecteerd om een bolus van ongeveer één millimeter in diameter te vormen in de cam op dag negen. Na zeven dagen incubatie werden kippenembryo's intraveneus geïnjecteerd met een laagmoleculaire dextrine om de vascularisatie van de tumor te bevestigen.Intraveneuze toediening van CPMV LOR 6 47 of gepegyleerde CPMV LOR 6 47-nanodeeltjes, gevolgd door real-time confocale beeldvorming met hoge resolutie, onthulde dat zowel CPMV- als gepegyleerde CPMV-nanodeeltjes de gehele vasculatuur snel labelden. Kwantificering van het fluorescentiesignaal in tumor- versus stromagebieden binnen 12 uur na injectie toonde aan dat de opname van gepegyleerde CPMV in de tumor ongeveer drie keer hoger was dan die van CPMV. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van intravitale beeldvorming met hoge resolutie om de opname van nanodeeltjes in tumorxenografts in een aviair embryo-model te evalueren, van de preparatie van de aviaire embryo's tot de xenografting van tumorcellen, de intraveneuze injectie van nanodeeltjes en de beoordeling van de nanodeeltjesopname in tumoren via real-time intravitale confocale beeldvorming.

evaluation-nanoparticle-uptake-tumors-real-time-using-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

Dit artikel beschrijft de procedures voor optische beeldvorming analyse van de tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox. In het bijzonder wordt gebruik van de gedetailleerde multimode beeldvormingsinrichting voor het detecteren en beoordelen van tumor targeting tumorpenetratie beschreven.

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrie en Microscopie

Dit protocol beschrijft het gebruik van multiphoton microscopie tot uitgebreide time-lapse beeldvorming van meercellige interacties uit te voeren in real time, in vivo bij enkele resolutie cel.

Extended Time-lapse intravitale Imaging van Real-time Meercellige Dynamiek in de tumor micro

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Live-cel imaging is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van dynamische processen. Het onderzoek van vaste cellen biedt alleen statische afbeeldingen, die tot verkeerde interpretaties en verwarring over het proces leiden kunnen. Dit werk presenteert een methode om te studeren opname, drug release en intracellulaire lokalisatie van liposomaal nanodeeltjes in levende cellen.

Met behulp van In Vitro Live-cel Imaging om te verkennen chemotherapeutica geleverd door lipide gebaseerde nanodeeltjes

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Hier beschrijven we het protocol voor in vivo toediening van magnetische ijzeroxide nanodeeltjes die RNA-oligomeren vervoeren naar uitgezaaide borstkanker in diermodellen, waardoor een klinisch haalbare benadering wordt geboden voor de therapeutische uitschakeling van oncogene nucleïnezuren.

Monitoring van de accumulatie van nanodrugs bij borstkankermetastasen bij muizen

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

Leer hoe je nanodeeltje-opname in tumoren kwantificeert met intravitale beeldvorming in een kippenembryo-model. Deze methode biedt hoogwaardige, real-time analyse van tumorvasculatuur en nanodeeltje-accumulatie.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Meer video's verkennen