Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om rode bloedcelvoorlopers direct te identificeren in vers geoogst weefsel van muizen. Dit stelt ons in staat om hun moleculaire eigenschappen te bestuderen tijdens perioden waarin het erythropoëtische systeem in deze muizen onderhevig is aan veranderingen. Zo wordt bijvoorbeeld tijdens de embryonale ontwikkeling of tijdens de respons op hypoxische stress eerst hematopoëtisch weefsel geïsoleerd uit de foetale lever, milt of het beenmerg van volwassen muizen en gedissocieerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen.

Vervolgens worden de cellen gelabeld met antilichamen tegen de celoppervlaktemarkers CD 71 en TER one 19, en eventueel met andere relevante markers, bijvoorbeeld om de celoverleving of de status van de celcyclus te meten. De gelabelde celsuspensie wordt vervolgens geanalyseerd met een flowcytometer, waarbij specifieke erytroblast-subsets in verschillende rijpingsstadia worden geïdentificeerd. Deze specifieke subsets kunnen via cel-sortering worden gezuiverd. Daarna kunnen cellulaire en moleculaire analyses worden uitgevoerd voor elke subset van de erytroblast-rijping.

Het vermogen om erytroblasten in specifieke rijpingsstadia direct in vers geïsoleerde hematopoëtische weefsels te identificeren, biedt ons de mogelijkheid om de cellen in de fysiologische cortex te bestuderen. Deze methode stelt ons daarom in staat om te bestuderen hoe erytroblasten in verschillende rijpingsstadia in vivo reageren. Wanneer muizen worden blootgesteld aan stimuli, versnellen zij de erytropoëtische snelheid.

Bijvoorbeeld hypoxische condities die een grote hoogte simuleren of injectie van het hormoon erytropoëtine. We maken gebruik van multi-parameter flowcytometrie om erythroblasten binnen een complexe weefselomgeving te identificeren en gelijktijdig hun signalering, overleving en celcyclusstatus te bestuderen. We kunnen erythroblasten in hun specifieke rijpingsstadia ook direct uit vers weefsel sorteren en hun genexpressieniveaus, chromatinestatus of andere moleculaire functies onderzoeken.

Definitieve erythropoëse bij de muis vindt plaats in de milt en het beenmerg van de volwassen muis. Daarom worden deze weefsels geoogst van een geëuthanaseerde muis. Neem na euthanasie van de muis bloed af via een hartpunctie in EDTA- of heparine-bloedafnamebuisjes; dit bloed zal later worden gebruikt voor de bepaling van het hematocrietgehalte, het aantal reticulocyten of een CBC-analyse.

Plaats de geoogste milt en het dijbeen in afzonderlijke buisjes met koud kleuringsbuffer. Houd de geoogste weefsels indien gewenst op ijs. Weeg de milt.

Muizen die een erytropoëtische stressrespons ondergaan, vertonen waarschijnlijk een significante toename van het miltgewicht. Vervolgens worden miltcellen en beenmergcellen geprepareerd uit de geoogste weefsels volgens procedures die eerder zijn aangetoond in het muisembryo. Definitieve erytropoëse vindt plaats in de foetale lever tussen embryonale dag 12,5 en 15,5.

Getimede drachtige vrouwelijke muizen worden voorbereid voor het verkrijgen van foetale levercellen op dag 12,5 tot 14,5 van de zwangerschap. De getimede drachtige vrouwelijke muizen worden geëuthanaseerd en de uterine hoorns worden verwijderd in een Petrischaal met ijs. Koud cultuurmedium of kleuringsbuffer.

Een dissectiemicroscoop is vereist voor het dissekeren van de foetale lever van embryonale dag 12,5 of jonger om embryo's uit de baarmoeder te verwijderen. Scheid eerst elke kraal van de hoorn. Exciteer vervolgens voorzichtig de wand van de baarmoeder om het embryo dat zich in de vruchtzak bevindt vrij te maken.

Pel voorzichtig het vlieesaamnioticum af. De foetale lever is het grootste rode abdominale weefsel dat zich onder een veel kleiner hart bevindt. Om de foetale lever te dissekeren, gebruikt u een pincet om het embryo aan weerszijden van de lever te immobiliseren en duwt u de lever voorzichtig vanuit de buikholte in het medium.

Breng de lever voorzichtig over naar een buis met verse kleuringsbuffer. Nadat alle foetale levers zijn gedissekeerd en zijn overgebracht naar een buis met verse kleuringsbuffer, worden de levers mechanisch gedissocieerd door middel van pipetteren. Filter vervolgens de gedissocieerde cellen door een nylon gaas van 40 micron en was de cellen tweemaal door middel van centrifugatie, waarbij het supernatant wordt weggegooid en de cellen opnieuw worden gesuspendeerd in kleuringsbuffer.

Kleur de cellen na de tweede wasbeurt met tryaanblauw en tel deze met een hemocytometer. Een foetale lever bij E 13.5 bevat ongeveer 10⁷ cellen. Resuspendeer de cellen op een concentratie van 1 tot 2 × 10⁶ cellen per 200 µL monster voor flowcytometrische analyse.

Voor de doeleinden van dit videoprotocol zal antilichamenkleuring voor flowcytometrie uitsluitend worden gedemonstreerd op foetale levercellen. Bereid om deze procedure te starten een premix voor primaire antilichamenkleuring voor die het volgende bevat: gezuiverd konijnen-IgG voor het blokkeren van Fc-receptoren in muiscellen, CD 71 FETR one 19 PE en een antilichaam gericht tegen het celoppervlakte-eiwit fast. Meng de antilichaamoplossing voorzichtig door de buis twee tot drie keer om te keren, voeg 200 µL van de premix voor primaire antilichamenkleuring toe aan het eerder bereide monster van foetale levercellen en pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen opnieuw te suspenderen.

Bereid vervolgens deze zes controlecelmonsters voor. Een ongekleurd monster waarin de cellen in kleuringsbuffer blijven om de achtergrondautofluorescentie van de cellen te bepalen, een enkele kleur voor elk antilichaam of elke kleur die in het protocol wordt gebruikt om spectrale overlap tussen kanalen te corrigeren, wat in dit experiment TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotine en streptavidine A PC zijn, en een fluorescence minus one-controle voor fast biotine, die de werkelijke achtergrond voor dat kanaal biedt waarbij de cellen zijn gekleurd met alle kleuren of antilichamen uit het protocol, behalve fast biotine. Incubeer het monster en de relevante controles in de primaire antilichaamkleuring op ijs gedurende 45 minuten tot één uur in het donker.

Was na afloop van de incubatie de cellen door drie milliliter kleuringsbuffer aan elke monsterbuis toe te voegen en deze drie tot vijf minuten te centrifugeren bij ongeveer 400 ×g bij vier graden celsius. Voeg vervolgens de strep avid in een PC toe en incubeer de buizen op ijs gedurende 30 tot 45 minuten. Was na afloop van de incubatie de cellen op dezelfde wijze als bij de eerste antilichaamkleuring.

Resuspendeer tot slot de cellen in een kleuringsoplossing die de celimpermeabele DNA-kleurstof seven a a d bevat om dode cellen uit te sluiten. De monsters zijn nu gereed voor flowcytometrische analyse. Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de correcte gating-analyse van de flowcytometrische gebeurtenissen, wat een betrouwbare identificatie van erythroblast-subsets mogelijk maakt.

Het vereist een zorgvuldige instelling van het apparaat, alle juiste controlemonsters, nauwkeurige compensatie voor spectrale overlap en daaropvolgende gating om dode cellen, aggregaten en zeer kleine events uit te sluiten. Aan het begin van de data-analyse worden het ongekleurde monster en de enkelkleur-controlemonsters gebruikt om de compensatie voor spectrale overlap voor elke kleurcombinatie in te stellen.

In dit voorbeeld laten we zien hoe FITC-fluorescentie overvloeit in het PE-kanaal en hoe deze spectrale overlap na compensatie wordt gecorrigeerd. Eerst definiëren we, met behulp van de ongekleurde controle, een FITC-positieve en PE-negatieve regio. Vervolgens kunnen we, met behulp van de FITC-enkelkleurscontrole, de spectrale overvloeiing naar het PE-kanaal visualiseren.

Na digitale compensatie met de FlowJo-software wordt het spillover fit E-signaal in het PE-kanaal geminimaliseerd. Zodra de compensatie is voltooid, kunnen dode cellen, aggregaten en kleine events worden verwijderd. Aggregaten en celdoubletten worden verwijderd door de forward scatter height uit te zetten tegen de forward scatter area en te selecteren op events binnen een smalle diagonale gate.

Dode cellen worden verwijderd door cellen te selecteren die negatief zijn voor dapi, een cel-impermeabele DNA-kleurstof. De gate voor DAPI-negatieve levensvatbare cellen sluit ook zeer kleine gebeurtenissen uit, zoals kernen of debris, die een zeer lage forward scatter hebben. Vervolgens tonen we de gating-strategie voor foetale levercellen.

Vers geoogste cellen werden gelabeld voor CD 71 TUR one 19 en een cocktail van ZI-gelabelde antilichamen gericht tegen markers voor niet-erythroïde lijnen. In dit voorbeeld zijn de monsters al gecompenseerd voor spectrale overlap en vervolgens gegated om aggregaten, dode cellen en zeer kleine events uit te sluiten. We gebruiken het FMO-monster dat alle kleuren bevat, behalve de lineage-positieve fitzy-kleuring, om een fitzy-histogram te plotten en de gate voor lineage-negatieve cellen te definiëren; vervolgens passen we deze gate toe op het foetale levercelmonster dat is gekleurd met ZI-geconjugeerde lineage-markers.

Lineage-negatieve cellen worden geselecteerd en uitgezet met CD 71 op de Y-as en TER 19 op de X-as. De cellen kunnen nu worden onderverdeeld in subsets S0 tot S5. De Lin-gedepleteerde S0-subset bevat grotendeels cellen met CFUE-potentieel voorafgaand aan het begin van de EPO-afhankelijkheid.

De S-één subset bevat EPO-afhankelijke CFUE-cellen die grotendeels in de S-fase van de celcyclus verkeren. Cellen in de S-twee subset zijn hun kolonievormende potentieel verloren en beginnen hemoglobine te tot expressie te brengen. De S-drie subset bestaat grotendeels uit basofiele erythroblasten. De S-vier en S-vijf subsets bevatten late erythroblasten. Hier wordt de analysestrategie getoond na de data-acquisitie van miltcellen die zijn verwerkt en gelabeld met antilichamen gericht tegen CD 71 en TER 119, evenals het histogram van de doodsreceptor.

Hier worden alle vastgestelde events getoond, waarbij de diagonale gate events vertegenwoordigt die waarschijnlijk enkelvoudige cellen zijn, met uitsluiting van dubletten of grotere aggregaten. Cellen in deze gate worden verder geanalyseerd in histogram twee. Zeer kleine events, waarschijnlijk kernen of debris, worden uitgesloten.

De gesegmenteerde cellen worden getoond in histogram drie, waarbij DAPI-positieve cellen, die waarschijnlijk membraanpermeabele apoptotische cellen zijn, worden uitgesloten van verdere analyse. Histogram vier toont de resulterende populatie levensvatbare miltcellen. De pro eGate bevat CD 71 high TER one 19 Intermediate cellen; tur R one 19 high cellen worden verder geanalyseerd in histogram vijf.

Hier worden CD 71-rijke cellen onderverdeeld in minder rijpe cellen met een groot oppervlak, erythroblasten A, en kleinere, rijpere erythroblasten B. De meest rijpe erythroblasten-subset is C. De expressie van celoppervlakte-eiwitten kan gelijktijdig voor elk van deze subsets worden gemeten door de relevante antilichamen op hetzelfde moment toe te voegen als TER 19 en CD 71. Kleuringshistogram 6 toont de celoppervlakte-expressie van de doodsreceptor Fas, specifiek in de subset A bij muizen in de basale toestand en muizen die een enkele dosis Epo hebben ontvangen.

De resultaten geven aan dat EPO de snelle expressie in het gebied onderdrukt. Een populatie in vivo expressie van intracellulaire eiwitten of de status van de celcyclus kan ook worden gemeten voor cellen in elke subset. In deze representatieve celcyclusanalyse werden muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met BRDU en werd het beenmerg 30 tot 60 minuten later geoogst.

Naast kleuring voor CD 71 en TER one 19 werden de cellen gekleurd voor BRDU-incorporatie in hun replicerende D-N-A-B-R-D-U positieve cellen bevinden zich in de S-fase van de cyclus. Interfasecellen zijn BRDU-negatief en kunnen worden onderverdeeld in de G one of G two M-fasen. Met behulp van DNAD seven A A D kunnen de cellen uit elk van de PRO E area A A B en A EC subgroepen worden gesorteerd.

Hier worden ze getoond in cytosinepreparaten die een sequentiële rijping laten zien met een afnemende celgrootte, nucleaire condensatie en een toenemende bruine kleur die wijst op hemoglobine-expressie. Ten slotte wordt hier een representatieve celcyclusanalyse van de S3-subset in de foetale lever van E 13.5 getoond. Drachtige muizen werden geïnjecteerd met BRDU.

Foetale levers werden geoogst en 30 tot 60 minuten later gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd met antilichamen tegen CD 71, TER one 19 en BRDU. De celcyclusstatus van S3-cellen wordt geanalyseerd, waarbij S-fase-cellen BRDU-positief zijn en de DNA-inhoud wordt gekwantificeerd door kleuring met de DNA-kleurstof seven A a d.

De cytometrische aanpak die wij beschrijven, maakt gelijktijdige analyse mogelijk van cellulaire functies, zoals de expressie van celoppervlaktemarkers en andere eiwitten, celoverleving, celsignalering met behulp van fosfospecifieke antilichamen en de status van de celcyclus. Hierdoor kunnen wij de moleculaire responsen van erytroblasten, een specifiek rijpingsstadium, onderzoeken op een breed scala aan stimuli of het effect van genetische mutaties. Er moet worden opgemerkt dat de flowcytometrische rijpingssubsets zijn gedefinieerd op basis van de expressie van celoppervlaktemarkers en forward scatter.

We stelden vast dat cellen in elk subset over het algemeen overeenkomen met een vergelijkbaar morfologisch erytroblaststadium in een breed scala aan muismodellen. We raden echter aan dit te verifiëren bij het onderzoeken van een nieuw muismodel. Door cellen uit elk subset te sorteren en hun morfologie te bestuderen, kunnen cellen uit elk subset ook worden gesorteerd voor RNA- of transcriptoomanalyse; sorteerexperimenten maken gebruik van lage sortdrukken en brede nozzles om de schuifspanning op de cellen te minimaliseren.

We raden ook aan om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de cellen na elk sorteerexperiment te controleren. Ten slotte is het, bij het detecteren van een verandering in de frequentie van een bepaalde subset, belangrijk om vast te stellen of dit te wijten is aan een werkelijke verandering in het aantal cellen in die subset of dat dit het gevolg is van veranderingen in andere subsets. Daarom is het, naast het meten van subsetfrequenties, altijd noodzakelijk om ook het absolute aantal cellen in elke subset te meten.