Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay
August 5th, 2011
Een flow-cytometrische methode voor de identificatie en moleculaire analyse van differentiatie-fase-specifieke muriene erytroïde voorlopers en precursoren, direct in vers geoogste muis beenmerg, milt of foetale lever. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en de celgrootte.
Het algemene doel van het volgende experiment is om rode celvoorlopers direct in vers geoogst weefsel bij muizen te identificeren. Dit stelt ons in staat om hun moleculaire eigenschappen te bestuderen in tijden waarin het erytropoëtische systeem bij deze muizen veranderingen ondergaat. Bijvoorbeeld tijdens de embryonale ontwikkeling of tijdens de reactie op hypoxische stress, wordt eerst hematopoietisch weefsel geïsoleerd uit de foetale lever van de muis of uit de volwassen milt of beenmerg en gedissocieerd in een enkele cel suspensie.
Vervolgens worden cellen gelabeld met antilichamen tegen de celoppervlaktemarkers CD 71 en TER een 19, en met eventuele andere markers van belang, bijvoorbeeld om de overleving van cellen of de celcyclusstatus te meten, de gelabelde celsuspensie wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een flowcytometrie-analyzer en specifieke erytroblastensubsets in verschillende stadia van maturatie worden geïdentificeerd. Deze specifieke subsets kunnen worden gezuiverd door celsortering. Vervolgens kunnen cellulaire en moleculaire analyses worden uitgevoerd voor elke erytroblast-maturatiesubset.
De mogelijkheid om erytroblasten in specifieke stadia van maturatie direct in vers geïsoleerd hematopoietisch weefsel te identificeren, geeft ons de gelegenheid om de cellen in de fysiologische cortex te bestuderen. Deze methode stelt ons daarom in staat om hoge erytroblasten van verschillende maturatiestadia in vivo te bestuderen. Wanneer muizen worden blootgesteld aan stimuli, versnellen ze de erytropoëtische kracht.
Bijvoorbeeld hypoxische omstandigheden die hoge hoogte nabootsen of injectie van het hormoon erytropoëtine. We gebruiken multi-parameter flowcytometrie om erytroblasten te identificeren binnen een complex weefselmilieu en tegelijkertijd hun signaaloverdracht, overleving en celcyclusstatus te bestuderen. We kunnen ook erytroblasten in hun specifieke maturatiestadia direct uit vers weefsel sorteren en hun genexpressieniveaus, chromatinestatus of andere moleculaire functies onderzoeken.
Definitieve erytropoëse bij muizen vindt plaats in de milt en het beenmerg van de volwassen muis. Daarom zullen deze weefsels worden geoogst van een geëuthanaseerde muis. Na het euthanaseren van de muis wordt bloed afgenomen door cardiale punctie in EDTA- of heparinebloedopvangbuisjes, dit bloed zal later worden gebruikt voor hematocriettelling, reticulocytetelling of CBC-analyse.
Plaats de geoogste milt en femur in afzonderlijke buisjes met koud kleuringsbuffer. Bewaar het geoogste weefsel indien gewenst op ijs. Weeg de milt.
Muizen die een erytropoëtische stressrespons ondergaan, zullen waarschijnlijk een significante toename van miltgewicht vertonen. Vervolgens worden miltcellen en beenmergcellen bereid uit de geoogste weefsels volgens procedures die eerder bij de muizenembryo zijn gedemonstreerd. Definitieve erytropoëse vindt plaats in de foetale lever tussen embryonale dagen 12,5 en 15,5.
Geschatte zwangere vrouwelijke muizen worden voorbereid om foetale levercellen te verkrijgen op dagen 12,5 tot 14,5 van de zwangerschap. De geschatte zwangere vrouwelijke muizen worden geëuthaniseerd en de baarmoederhoorns worden verwijderd in een petrischaal met ijs. Koud kweekmedium of kleuringsbuffer.
Een dissectiesmicroscoop is vereist voor het disseceren van foetale lever vanaf embryonale dag 12,5 of jonger om embryo's uit de baarmoeder te verwijderen. Schei eerst elke parel los van de hoorn. Snijd vervolgens voorzichtig de wand van de baarmoeder af om het embryo los te maken dat zich in zijn vruchtzak bevindt.
Schil voorzichtig het vruchtmembraan af. De foetale lever is het grootste rode buikweefsel dat zich onder een veel kleinere hart bevindt. Om de foetale lever te disseceren, gebruikt u een pincet om het embryo aan beide kanten van de lever te immobiliseren en duwt u de lever voorzichtig uit de buik in het medium.
Breng de lever voorzichtig over in een buisje met vers kleuringsbuffer. Nadat alle foetale leveren zijn gedisseceerd en overgebracht naar een buisje met vers kleuringsbuffer, dissocieert u de levers mechanisch door te pipetteren, filter vervolgens de gedissocieerde cellen door een 40 micron nylon gaasscherm, was de cellen twee keer door centrifugatie, gooi het supernatant weg en suspendeer opnieuw in kleuringsbuffer.
Na de tweede wassing, kleurt u de cellen met trian blauw en telt u ze met behulp van een hemo cytometer. Een foetale lever op E 13,5 heeft ongeveer 10 tot de zevende. Cellen hersuspendeer de cellen bij een tot twee keer 10 tot de zesde cellen per 200 microliter monster voor flowcytometrische analyse.
Voor de doeleinden van dit videoprotocol zal antilichaamkleuring voor flowcytometrie alleen worden gedemonstreerd op foetale levercellen. Om dit proces te beginnen, bereidt u een primaire antilichaamkleuringspremix voor die het volgende bevat: gezuiverd konijn IgG voor het blokkeren van FC-receptoren in muizencellen CD 71 FETR een 19 PE en een antilichaam gericht tegen het celoppervlakte-eiwit fast. Meng de antilichaamoplossing voorzichtig door de buis twee tot drie keer om te keren, voeg 200 microliter van de primaire antilichaamkleuringspremix toe aan het eerder bereide foetale levercelmonster en pipet omlaag om de cellen op te schorsen.
Bereid vervolgens deze zes controlecelmonsters voor. Een ongekleurd monster waarin cellen in kleuringsbuffer worden achtergelaten om de achtergrondautofluorescentie van de cellen te bieden, een enkele kleur voor elke antilichaam of kleur die in het protocol wordt gebruikt om correctie te maken voor spectraal overlap tussen kanalen, die in dit experiment zijn TUR een 19 PE CD 71 fz fast, biotin en streptavidin A PC en zeven A A DA fluoresceine min één controle voor fast biotin, die de ware achtergrond biedt voor die kanaal waar de cellen worden gekleurd met alle kleuren of antilichamen in het protocol behalve fast biotin. Bewaar het monster en relevante controles in de primaire antilichaamkleuring op ijs gedurende 45 minuten tot een uur in het donker.
Aan het einde van de incubatie, was de cellen door drie milliliter kleuringsbuffer toe te voegen aan elk monsterbuisje en draai gedurende drie tot vi
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een flow-cytometrische methode voor het identificeren van murine erytroïde progenitors en precursoren rechtstreeks uit vers geoogste weefsels. De methode maakt gebruik van specifieke celoppervlaktemarkers om differentiatiefasen in erytropoëse te analyseren.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Hematologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Begrip van erytropoëse is cruciaal voor het bestuderen van bloedaandoeningen.
- Murine modellen geven inzicht in menselijke hematopoëtische processen.
- Flowcytometrie maakt nauwkeurige identificatie van celpopulaties mogelijk.
- Celoppervlaktemarkers zijn essentieel voor het onderscheid tussen verschillende celtypen.
Doel van het onderzoek
- Om rode celprecursoren in vers geoogst muizenweefsel te identificeren.
- Om de moleculaire eigenschappen van erytroïde progenitors tijdens ontwikkelingsveranderingen te analyseren.
- Om de studie van erytropoëse onder verschillende fysiologische condities te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van hematopoëtisch weefsel uit muizen foetale lever, milt of beenmerg.
- Dissociatie van weefsels in enkele celsuspensies.
- Labeling van cellen met antilichamen tegen CD71 en Ter119 markers.
- Analyse van gelabelde cellen met behulp van flowcytometrie om erythroblast subsets te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van verschillende erythroblast rijpingsstadia.
- Mogelijkheid om specifieke celsubsets te zuiveren door middel van sorteertechnieken.
- Inzichten in de moleculaire kenmerken van erytroïde progenitors.
- Potentiële toepassingen in het bestuderen van erytropoëse onder stresscondities.
Conclusies
- De flow-cytometrische methode is effectief voor het analyseren van erytroïde progenitors.
- Deze aanpak vergroot het begrip van erytropoëse in verschillende contexten.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken voor diepere moleculaire inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This flow-cytometric assay enables direct identification of erythroid progenitor subsets in mouse tissues, supporting mechanistic de-risking in hematopoietic target validation. By providing quantitative, stage-resolved data on erythropoietic dynamics, it enhances predictive confidence in preclinical models of anemia, hypoxia response, and EPO-mediated pathways. The method facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by linking cellular maturation to functional outputs under stress conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of erythropoietic signaling pathways through stage-specific progenitor isolation.
- Operational Value: Supports functional validation of EPO and hypoxia-responsive targets using primary murine cells.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by correlating marker expression (CD71/Ter119) with maturation and proliferative status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts of erythroblast subsets for assay reproducibility.
- Operational Value: Enables high-resolution sorting of maturation stages for downstream molecular profiling (e.g., RNA, chromatin).
- Scientific Value: Allows simultaneous measurement of co-stained markers (e.g., cell cycle, death receptors) to assess compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models erythropoietic stress response (e.g., anemia, hypoxia) to evaluate target engagement in vivo.
- Operational Value: Provides lineage-negative gating strategy to exclude non-erythroid contaminants in tissue samples.
- Scientific Value: Connects fetal liver and adult spleen/bone marrow erythropoiesis for cross-stage target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly in hematopoiesis-focused programs. It supports early target confirmation by enabling direct ex vivo analysis of progenitor responses to pharmacological or genetic perturbations.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven isolation of erythroblast subsets to clarify EPO-dependent vs. independent maturation stages.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative subset frequencies and absolute counts for compound screening readiness.
- Analytics: Supports multiparametric analysis of proliferation, apoptosis, and marker co-expression within defined gates.
- Translational Research: Links murine erythropoietic dynamics to human-relevant stress models (e.g., chemotherapy-induced anemia).
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized flow-cytometric platform applicable across multiple hematopoietic discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, stage-resolved progenitor analysis in physiological contexts.
- Operational Value: Delivers standardized, compensatable flow cytometry workflows with built-in controls for spectral overlap and viability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in erythropoietic mechanism of action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on effects on specific erythroblast maturation checkpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multicolor flow cytometry compensation and gating strategy design.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate laser/configuration for PE and DNA dye detection.
- Necessitates standardized staining buffers and antibody titration protocols across laboratories.
- Requires validation of lineage-negative gating when adapting to new genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the need for fresh tissue processing to preserve epitope integrity and cell viability.
