Name: Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Leer kwantitatieve analyse van kankermetastase met behulp van het CAM-xenograftmodel in het kippenembryo. Deze methode maakt het mogelijk om de metastatische potentie van humane tumorcellen nauwkeurig te meten met PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Tyson Foods Inc erkennen voor ruim het verstrekken van de bevruchte eieren. Shanna Arnold speelde een belangrijke rol tijdens de opnames van dit protocol. Trenis Palmer werd gesteund door de National Institutes of Health onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door CCSRI Grant # 700537 om JDL en NIH / NCI verlenen # CA120711-01A1-01A1 en CA120711 naar AZ.

1. De voorbereiding van de eieren voor xenografting (spontane metastase) <ol><li> Vers gelegde bevruchte kippen eieren worden uitgebroed in een roterende incubator voor 10 dagen bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid. De eieren worden gedraaid vier keer per uur. </li><li> Op de ontwikkeling dag 10 worden de eieren gelegd op hun kant in een ei rack. Een zwanenhals lamp of een andere geschikte lichtbron wordt gebruikt om kaarsen van de eieren door schijnt het licht in de eierschaal aan het stompe eind van het ei waar de airsac zich bevindt. </li><li> Het chorion ader zich bevindt en gemarkeerd. Deze ader bevindt zich aan de bovenkant van de eierschaal waar het de kruising van enkele grote bloedvaten. Op deze tak moment het bloedvat druppels naar beneden, weg van de CAM en hecht aan het embryo. Een 1 cm vierkante doos is getekend met potlood op de eischaal ongeveer 1 cm afstand van de tak punt in de ader. Het gebied met inbegrip van en rond het plein wordt vervolgens gereinigd met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in jodium. </li><li> Met behulp van een roterend snijgereedschap (Dremel) voorzien van een siliconen carbide slijpsteen (Dremel deel # 84922) wordt een gat geboord door het stompe eind van het ei in de luchtzak. Met behulp van deze zelfde gereedschap een gat geboord in de eerder getrokken vierkant op de top van het ei, het stoppen van korte van de eischaal membraan. Een 25-gauge-naald met een fijne boor aan het uiteinde wordt gebruikt om een ​​klein gaatje te maken in de eischaal membraan en let niet op de onderliggende CAM scheuren. De CAM wordt vervolgens losgekoppeld van de eierschaal membraan op het gebied van het plein met behulp van zachte zuigkracht gemaakt met een automatische pipet hulp uitgerust met een stuk van ¼ "Tygon slang geplaatst tegen het gat in de airsac. Bij de af te zuigen, moet een luchtbel onder het gat in het plein betekent dat de CAM met succes is gedaald afstand van de eierschaal. Nadat de cam is gedaald, is het gat in de lucht zak en het gat in het plein bij het chorion ader afgesloten met een stuk tape laboratorium tape. De eieren worden vervolgens geplaatst in een stationaire incubator bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid in afwachting van enten de tumorcellen. Zie figuur 1 voor een sequentiële weergave. </li></ol> 2. De voorbereiding van de eieren voor intraveneuze injectie (experimenteel metastase) <ol><li> Vers gelegde bevruchte kippen eieren worden uitgebroed in een roterende incubator gedurende 12 dagen bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid. De eieren worden gedraaid vier keer per uur. </li><li> Op de ontwikkeling dag 12 worden de eieren gelegd op hun kant in een ei rack. Een zwanenhals lamp of een andere geschikte lichtbron wordt gebruikt om kaarsen van de eieren door schijnt het licht in de eierschaal aan het stompe eind van het ei waar de airsac zich bevindt. </li><li> Het chorion ader zich bevindt en gemarkeerd. Een 1 cm met 0,5 cm rechthoek is getekend met potlood op de eierschaal direct boven de ader. Het gebied met inbegrip van en rond het plein wordt vervolgens gereinigd met behulp van een wattenstaafje gedrenkt in jodium. </li><li> Een klein venster wordt aangemaakt in de eierschaal in het getekende locatie met de Dremmel boor (# 118). Het venster is verwijderd om het onderliggende eischaal membraan, die vervolgens wordt weergegeven transparant met daling van minerale olie bloot te leggen. Zie figuur 5A voor een grafische weergave. </li><li> Op dit punt het gat in de lucht zak en het gat in het plein bij het chorion-ader is afgesloten met een stuk tape laboratorium tape. De eieren worden vervolgens geplaatst in een stationaire incubator bij 100 ° C en 60% luchtvochtigheid in afwachting van het inspuiten van de tumorcellen. </li></ol> 3. Voorbereiden tumorcellen zijn voor transplantatie of injectie. <ol><li> Voor xenografting, worden de tumorcellen los van uit hun eigen cultuur gerechten met trypsine / EDTA en gewassen met 10 volumes van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om eventuele resterende media, trypsine, of EDTA te verwijderen. </li><li> Voor IV injectie, zijn gekweekte cellen losgemaakt met behulp van niet-enzymatische cel-dissociatie-oplossing, en gewassen met serum-vrij DMEM. en) </li><li> Cellen worden geteld met een hemacytometer en geresuspendeerd in PBS bij 10 tot 40 miljoen cellen / ml voor transplantatie, of als alternatief opnieuw gesuspendeerd in serum-vrij DMEM op 1 miljoen cellen / ml voor intraveneuze injectie. </li></ol> 4. Enten de tumor cellen op de nieuw blootgesteld CAM (Spontaan metastase) <ol><li> De eieren worden verwijderd uit de incubator en een klein venster is gesneden in de plaats van de eerder getrokken plein waar de nieuwe luchtbel heeft gevormd. Dit is het meest eenvoudig te doen met een roterend gereedschap is uitgerust met een snij-wiel (Dremel tool met de # 409 ronde snijden wiel). Een paar van de naald-neus tang wordt gebruikt om het kleine gedeelte van de eierschaal te verwijderen en de onderliggende CAM bloot te leggen. </li><li> Met behulp van een wattenstaafje (Fisher Brand # 23-400-001) de cam is afgesleten 5 keer. Een beetje bloed moet blijken op het katoen. Onmiddellijk na beschadiging van het CAM, is 25μl van de celsuspensie geplaatst op het beschadigde gebied. Het optimale aantal cellen wordt bepaald empirically maar kan variëren van 5 tot 0.5X10 1x10 6. Het venster in het ei is goed afgesloten met tape en de kuikens zijn blijven staan ​​gedurende 10-15 minuten, zodat de cellen om zich te vestigen. Na 15 minuten de eieren worden teruggegeven aan de stationaire incubator. </li><li> De tumoren kunnen groeien voor 5-8 dagen, afhankelijk van de specifieke toepassing en de aard van de tumor gebruikte cellijn. Zie figuur 1 voor een sequentiële weergave. </li></ol> 5. Intraveneuze injectie van tumorcellen (Experimental metastase) <ol><li> Met behulp van een 30 Gauge insuline spuit 100μl celsuspensie wordt geïnjecteerd in de allantoïs ader van elk embryo, werden de eieren terug naar een stationaire incubator en bleef daar voor een extra 1-7 dagen. </li><li> Op verschillende tijdstippen, zijn de longen of lagere CAM geoogst uit ieder embryo en bewerkt voor het opsporen van tumorcellen, zoals hieronder beschreven. </li></ol> 6. Oogsten tumoren en chick weefsels <ol><li> Een dissectie gebied wordt voorbereid. De test detecteert metastatische cellen door het kwantificeren van het menselijk DNA met behulp van een zeer gevoelige PCR-benadering. Het is daarom erg belangrijk om te voorkomen dat besmetting met exogeen DNA. Dissecties worden uitgevoerd in een speciale ruimte en gedurende de dissecties de gereedschappen zijn schoongemaakt tussen elke dier. Een set voor het snijden van het ei, een set voor het verwijderen van de primaire tumor en een set voor het verwijderen van de interne organen: om kruisbesmetting van uw monsternemingen gedurende het hele proces dissectie drie aparte sets van instrumenten worden gebruikt te voorkomen. Daarnaast worden vier wassen containers gebruikt voor sequentiële spoelen van gereedschappen tussen elk dier. In volgorde van deze wasbeurten zijn: 1) dubbel gedestilleerd water, 2) dubbel gedestilleerd water, 3) chloor, en 4) 70% ethanol. </li><li> De eieren worden verwijderd uit de stationaire incubator en op ijs geplaatst gedurende 15 minuten te verdoven en laten inslapen van de dieren. De ramen worden geopend, zodat de tumoren zichtbaar worden. Het openen van de vensters groter door het verwijderen van een deel van de eierschaal kan nodig zijn. De primaire tumoren zijn weggesneden uit het CAM, gewogen en verwerkt voor histologie. </li><li> Het kuiken wordt verwijderd uit de eierschaal door het snijden van de shell radiaal in twee gelijke helften. Het embryo is gedecanteerd van de snede shell en overgebracht naar een schone wegen boot borst naar boven. Het dier wordt ontleed met behulp van een frisse, schone set van tools. Het dier wordt geopend door dwars door het borstbeen. Zodra het embryo is geopend, een stukje van de lever van zowel de rechter of linker kwab is verzameld. De interne organen worden vervolgens verwijderd door te trekken voorzichtig aan de slokdarm aan de spiermaag en snijden van de visera dat de organen aan te sluiten. Voor het verzamelen van longen, snijd de ribbenkast wordt geopend de borst plaat is gescheiden en het hart is verwijderd. Op dit punt is het mogelijk te snijden rond de vier zijden van de long (de top het dichtst bij het hoofd van de linker kant langs de ribbenkast, de onderste in de buurt van het diafragma en de rechterkant langs de luchtpijp). Omwille van de consistentie wordt dezelfde long verzameld in ieder dier. Geoogst weefselmonsters worden bewaard bij -20 ° C voor later gebruik of kunnen direct worden verwerkt voor DNA-isolatie. </li></ol> 7. Genomisch DNA isolatie en kwantitatieve PCR-analyse <ol><li> Genomisch DNA wordt geëxtraheerd uit weefsels met behulp van de SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit (Sigma-Aldrich Catalog # XNATRG). Het geëxtraheerde DNA kan worden overgedragen aan een schoon eppendorfbuisje en opgeslagen bij -20 ° C of onmiddellijk wordt gebruikt. Het is belangrijk om het DNA 1:50 verdunnen in nuclease gratis water alvorens het te gebruiken in de volgende PCR-reactie. Als alternatief kan DNA worden gehaald met behulp van een aantal standaard DNA-extractie protocols (Zijlstra et al.., 2002). </li><li> Menselijk DNA is aangetroffen in het kuiken weefsels met behulp van kwantitatieve PCR specifiek voor menselijk Alu sequenties. Kwantitatieve PCR met behulp van Alu-specifieke primers wordt uitgevoerd met behulp van de SYBR groen versterking van de Exract-N-Amp kit. De PCR kit wordt geleverd met een 2x reactie mix met SYBR groen, buffer, zouten dNTP, Taq-polymerase en de Jumpstart Taq antilichaam. De reactie mix is ​​opgebouwd in een uiteindelijk volume van 15μl, met 0.4μM van elke primer. Voor de meeste gevallen het gebruik van de geëxtraheerde DNA verdund 01:50 zullen kwantitatieve gegevens te verstrekken, maar kan de optimale hoeveelheid van het template-DNA moeten empirisch worden geoptimaliseerd. Kip GAPDH primers worden gebruikt als een interne controle De PCR is onder de volgende voorwaarden lopen Alu sequenties: polymerase activering bij 95 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door 30 cycli bij 95 ° C gedurende 30 seconden, 63 ° C gedurende 30 s. , 72 ° C gedurende 30 s. De reactieomstandigheden voor kip GAPDH zijn identiek aan die beschreven voor Alu maar het kan nodig zijn om de PCR uit te breiden tot 40 cycli. </li><li> Kwantitatieve analyse van metastase wordt uitgevoerd met behulp van de methode ΔΔCt vergelijken experimentele groepen aan een controlegroep (Schmittgen en Livak, 2008;. Zijlstra et al., 2002). U kunt ook een standaard curve kan worden gegenereerd met behulp van een verdunningsreeks van humane tumorcellen geëxtraheerd met behulp van de Extract-N-Amp kit (Zijlstra et al.., 2002). Statistische significantie is geëvalueerd aan de hand Student T-test of ANOVA-analyse van de controle en experimentele groep. </li></ol> 8. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De kip embryo metastase model. A) Een vier-paneel diagram illustreert het uiterlijk van het model in dwarsdoorsnede op belangrijke stappen: 1. Na 10 dagen incubatie. De CAM heeft bereikt bijna maximale grootte. De slagaders en aders zijn duidelijk zichtbaar met het allantoïs ader geplaatst tegen de bovenkant van het ei. 2. Het ei onmiddellijk na het boren van twee gaten in de eierschaal: een in de airsac en een grenzend aan het bevestigingspunt voor het allantoïs ader. 3. Het uiterlijk na een mild vacuüm is gebruikt om de airsac evacueren en de CAM te laten vallen. Tumorcellen (blauw) worden toegepast op de gevallen CAM. 4. Na aftrek van de geënte tumorcel om te groeien, zijn de tumor samen met de weefsels van de kip embryo geoogst voor analyse B) Een seriële voorstelling van het model: 1.. Incubatie van de eieren., 2. Markeren de locatie van de allantoïs ader., 3. Het boren van gaten in de eierschaal., 4. Het schrappen van de CAM., 5. Snij een opening voor tumorcel enten., 6. Toepassing van de tumorcellen., 7. Koelen van de eieren op ijs voorafgaand aan het verzamelen van weefsel., 8. Het oogsten van de tumor na 7 dagen van de groei. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Histologie van CAM tumoren. Weefselmonsters van tumor dragende chorion membraan werd gefixeerd in formaline, coupes en verwerkt met een trichroomkleuring vlek. A) HEp3 tumor na zeven dagen van groei op de CAM. B en C tonen vergroot regio's van A toont zowel de tumor en stroma. D) normalen CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Kwantitatieve longitudinale analyse van metastase. Varianten voor het hoofd en de nek carcinoom HEp3 met een hoge of lage metastatische vermogen (HEp3 M (Hoog) en HEp3 M (Low) respectievelijk) werden geanalyseerd op hun vermogen om te verspreiden met behulp van PCR Alu. Tien dieren werden geanalyseerd op elk tijdstip voor de duur van 7 dagen. Deze monsters werden gekwantificeerd tegen een standaard curve en vervolgens uitgedrukt als # cells/50mg weefsel. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. De remming van de spontane metastase cellen bij dieren die behandeld werden met de uitzaaiingen remmen antilichaam 1A5. Tumoren werden gevormd met behulp van 5x10 5 HEp3 cellen toegepast op de CAM van de dag-10 embryo's. Drie dagen na het aanbrengen van de tumorcellen de helft van de dieren werden behandeld met de anti-CD151 antistof 1A5. De longen van de tumor-dragende dieren werden twee dagen later geoogst en onderworpen aan kwantitatieve real-time PCR alu. Omgekeerd kwantitatieve real-time PCR van chGAPDH werd gebruikt om de aanwezigheid van equivalente hoeveelheden van gastheer genomisch DNA (De ΔΔCt methode werd gebruikt om kwantitatief vergelijken van de twee groepen (B) te bevestigen. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Het evalueren van arrestatie, de groei, en intravasation in de metastatische cascade. Fundamenteel, is metastase naar een secundaire orgel bepaald door de bijdragen van drie aspecten: arrestatie, de snelheid van de groei, en de snelheid van intravasation. Deze kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een combinatie van experimentele metastase (A) en spontane metastase (B). Met behulp van experimentele metastase (A) gearresteerd wordt gedefinieerd als het aantal cellen ontdekt 2 uur na de injectie. Overleving en de groei van cellen gearresteerd wordt bepaald als de verandering in het aantal cellen 24 uur na de injectie. Groei is gedefinieerd als de mate van proliferatie tijdens dag 3-7. Intravasation wordt bepaald met behulp van spontane metastase (B) waar het aantal intravasated cellen wordt gedefinieerd als de metastatische last aanwezig op dag 7, dat hoger is dan de voorspelde waarde door de groei van de metastatische last aanwezig op dag 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Visualiseren van de uitbreiding van de metastatische in de CAM. HEp3 cellen die GFP werden intraveneus geïnjecteerd op de ontwikkeling dag 12. Op dag 1, 3, 5 en een ei werd opgeofferd en een deel van de CAM was afgebeeld met een tl-stereo-microscoop. De donkere groene achtergrond wordt gemaakt door de eierschaal, het vaatstelsel wordt zichtbaar als zwarte lijnen, en de tumor cellen zijn zichtbaar als heldere groene vlekken.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
<li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li>
<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin%2FMMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li>
<li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+%28PETA-3%2FCD151%29+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

De chick CAM is gebruikt voor decennia als een modelsysteem om de verschillende aspecten van kanker biologie en metastatische progressie te bestuderen. Principe evaluatie van gemetastaseerd vaardigheden zijn uitgevoerd in dit model door een verscheidenheid van groepen, waaronder de analyse van de rusttoestand (Aguirre Ghiso et al., 1999;. Ossowski en Reich, 1983), remodellering van het weefsel (Deryugina et al., 2005;. Hahn-Dantona . et al., 1999), en metastase (Zijlstra et al., 2008;...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS) (1x), vloeibaar </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trypsine, 0,05% (1X) met EDTA 4NA, vloeibare </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Deze incubators zijn enkele van de meest direct beschikbaar. Toch zal de video tonen verschillende apparatuur. </td></tr><tr><td> Sportsman incubator </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel roterend gereedschap </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dremel cutoff wielen niet. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Draagbare Pipetteer Aid </td><td> Visser </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Katoen Tipped Applicators </td><td> Visser </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Bevruchte eieren </td><td> Verschillende </td><td></td><td> Veel verschillende leveranciers kunnen worden gebruikt. De eieren moet ongeveer 35 tot 55 gram. De hennen die legt ze moet tussen 36 en 55 weken oud. </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber-optische microscoop illuminator </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 gauge naald </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een avian embryo model

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Tijdens de metastase verspreiden kankercellen uit de primaire tumor, binnen te dringen in de omliggende weefsels, en de verspreiding naar verre organen. Metastase is een complex proces dat kan gaan om vele soorten weefsel, overspanning variabele periodes en zich vaak diep in organen, waardoor het moeilijk te onderzoeken en te kwantificeren. Bovendien is de effectiviteit van de metastatische proces beïnvloed door de verschillende stappen in de metastatische cascade waardoor het moeilijk is om de bijdrage van een enkel aspect van de tumor cel gedrag te evalueren. Als gevolg hiervan zijn metastase testen vaak uitgevoerd in proefdieren om een ​​realistische context noodzakelijk om in te studeren metastase te bieden. Helaas zijn deze modellen nog verder gecompliceerd door hun complexe fysiologie. Het kuiken embryo is een uniek in vivo model dat veel beperkingen overwint aan het bestuderen van metastase, te wijten aan de bereikbaarheid van de chorion-membraan (CAM), een goed gevasculariseerd extra-embryonaal weefsel bevindt zich onder de eierschaal die ontvankelijk is voor de xenografting van tumorcellen (figuur 1). Aangezien het kuiken embryo is natuurlijk immunodeficiënte, de CAM ondersteunt gemakkelijk de innesteling van zowel de normale en tumor weefsel. Het belangrijkste is dat het aviaire CAM ondersteunt met succes de meeste kankercellen kenmerken, zoals groei, invasie, angiogenese, en herinrichting van de micro-omgeving. Dit maakt het model bijzonder nuttig voor het onderzoek van de routes die leiden tot kanker metastase en de reactie van uitgezaaide kanker aan nieuwe potentiële geneesmiddelen te voorspellen. De detectie van verspreide cellen door soortspecifieke Alu PCR maakt het mogelijk om kwantitatief te beoordelen uitzaaiingen in organen die zijn gekoloniseerd door zo weinig als 25 cellen. Met behulp van de Human epidermoïde carcinoom cellijn (HEp3) gebruiken we dit model tot spontane uitzaaiing van kankercellen te analyseren naar verre organen, waaronder het kuiken lever en longen. Bovendien, met behulp van de Alu-PCR-protocol tonen we aan de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de test als een instrument voor het analyseren en intravasation, arrestatie, extravasatie, en kolonisatie te kwantificeren als individuele elementen van metastase.

Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.

Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model

Tijdens metastasering verspreiden kankercellen zich vanuit de primaire tumor, invaderen ze het omringende weefsel en verspreiden ze zich naar verafgelegen organen. Metastasering is een complex ...

Het hoofddoel van deze procedure is om het metastatisch vermogen van kankercellen kwantitatief te evalueren met behulp van het chorioallantoïs-membraan (CAM) als xenograftmodel. Dit wordt bereikt door eerst bevruchte eieren te incuberen totdat er een volgroeid CAM aanwezig is. De tweede stap van de procedure is het intraveneus injecteren of topisch xenograften van tumorcellen in het CAM.Na een experimenteel vastgesteld tijdsinterval wordt weefsel verzameld voor analyse, waarna de metastase wordt gekwantificeerd met behulp van mens-specifieke PCR voor de menselijke allelsequentie en de resultaten worden geanalyseerd. Mijn naam is Trent Palmer. Ik ben een promovendus in het laboratorium van Dr. Andre Zilstra.Ik zal het xenograft- en het spontane metastasemodel demonstreren, terwijl mijn mentor, Dr. Zilstra, de intraveneuze injectie en het experimentele metastasemodel zal demonstreren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande modellen is de snelheid en het gemak waarmee een onderzoeker kwantitatief onderzoek kan doen. De metastase van menselijke tumorcellen kan worden bestudeerd en onderzoekers kunnen ongeveer 120 dieren opzetten en het protocol van begin tot eind voltooien binnen een periode van twee weken.Vanwege de toegankelijkheid van het kijkenembryo en het gemak van manipulatie, kan dit systeem eenvoudig worden uitgebreid naar aanvullende in ovo-toepassingen. Dit hebben we de afgelopen jaren gerealiseerd en is het onderwerp van aanvullende JoVE-verticals. Vers gelegde, bevruchte kippeneieren worden 10 dagen lang in een roterende broedmachine vier keer per uur uitgebroed.Draai de eieren op de tiende dag op hun zijkant in een eierrek en schijn met een felle, directe lichtbron door de eierschaal bij het stompe uiteinde van het ei, waar de luchtkamer zich bevindt. Lokaliseer nu het vertakkingspunt van de chorioallantoïsche ader. Dit kan het gemakkelijkst worden geïdentificeerd door het ei ongeveer 20 graden om zijn langdoorste as te draaien.Om het punt te visualiseren waarop het vat zich van de schaal losmaakt, tekent u een vierkant van één centimeter op één centimeter afstand van het vertakkingspunt van de vena corotica. Maak vervolgens het gebied rondom het vierkant schoon met een wattenstaafje gedoopt in jodium. Gebruik een dremel uitgerust met een slijpsteen van siliciumcarbide om eerst een gat te boren door het stompe uiteinde van het ei in de luchtzak, en boor vervolgens een gat binnen het vierkant, waarbij u vlak voor het eierschilvlies stopt.Gebruik nu voorzichtig een naald van 25 gauge met een fijne braam aan het uiteinde om het eierschaalmembraan naar achteren te trekken; indien correct uitgevoerd, zal dit het onderliggende cam niet scheuren om de cam van het onderliggende membraan te scheiden. Gebruik een automatische pipeteerhulp voorzien van een stuk tigon-slang van een kwart inch.Pas een zachte zuigkracht toe op het gat van de luchtzak en controleer of er een luchtbel onder het gat in het vierkant verschijnt, wat duidt op succes. Als de nok beschadigd raakt tijdens het doorbreken van het eischalvlies, zal de nok niet duidelijk zakken. Wanneer er bij het draaien van het ei aan de luchtzak wordt gezogen, is de lucht die vlak onder de schaal zichtbaar wat wordt weggezogen en onder de beschadigde nok terechtkomt.Deze eieren kunnen niet meer worden gebruikt nadat de cam is geplaatst. Plak beide gaten af met een stukje laboratoriumtape en plaats de eieren terug in een stationaire incubator. De eieren zijn nu klaar voor de xenotransplantatie.Begin met het voorbereiden van de tumorcellen voor de xenograft. Detacheer eerst de cellen van hun kweekschaaltjes met behulp van trypsine EDTA. Voltooi de voorbereiding van de cellen door hun dichtheid te meten met een hemocytometer en resuspendeer ze in PBS op 10 tot 40 miljoen cellen per milliliter.Nadat de zuurkast en de dremmeltool met ethanol zijn gesteriliseerd, worden de eieren uit de incubator gehaald. Maak een venster in de bovenkant van de eierschaal en gebruik een wattenstaafje om vijf keer zachtjes te wrijven; er moet een kleine hoeveelheid bloed op het wattenstaafje zichtbaar zijn op het beschadigde gebied. Injecteer onmiddellijk 25 µL van de celsuspensie, bestaande uit tussen de 0,5 en 1 miljoen cellen.Kleef nu het venster af met laboratoriumtape en laat de cellen 10 tot 15 minuten bezinken. Plaats de eieren na 15 minuten terug in de stationaire incubator, waar de tumoren vijf tot acht dagen kunnen groeien. Verzamel 12 dagen oude eieren met behulp van dezelfde incubatiemethode als gedemonstreerd in sectie twee.Plaats een ei voor de lichtbron om de corry- en toic-ader te lokaliseren en markeer de plek direct boven de ader. Maak een kader van één centimeter bij 0,5 centimeter en maak het gebied schoon met een wattenstaafje gedrenkt in jodium. Maak nu met een boormachine voorzien van een boorbit een klein venster in de eierschaal binnen het rechthoekige vlak.Verwijder voorzichtig het raampje in de eierschaal om het onderliggende membraan bloot te leggen. Voeg een druppel minerale olie toe aan het blootgelegde membraan om het transparant te maken. Haal de eieren uit de incubator en gebruik een insulinespuit met een naald van 30 gauge.Injecteer 100 µL cel-suspensie in de auic-ader van elk embryo. Plaats vervolgens een stukje laboratoriumtape over de blootliggende membranen en plaats de eieren gedurende de volgende één tot zeven dagen terug in een stationaire incubator. De long of de onderste kam wordt geoogst voor de detectie van tumorcellen, zoals gedemonstreerd in de volgende sectie.Het is essentieel om deze stap van de procedure uit te voeren in een gebied dat specifiek is ingericht voor dissecties en met een absoluut minimum aan kans op contact met DNA. Om kruisbesmetting van monsters te voorkomen, dienen drie aparte sets instrumenten te worden gebruikt voor het opensnijden van het ei, het verwijderen van de primaire tumor en het verwijderen van de inwendige organen, zowel vóór aanvang als tussen de dissecties door. Was elke set instrumenten één keer met bleekmiddel, één keer met 70% ethanol en twee keer met dubbel gedestilleerd water.De eieren worden uit de stationaire incubator gehaald en 15 minuten op ijs geplaatst. Om de dieren te anesthetiseren en te euthanaseren, worden de vensters geopend zodat de tumoren zichtbaar worden. Het kan nodig zijn om de vensters te vergroten om de tumoren volledig bloot te leggen.Snijd nu de primaire tumoren weg van de CAM. Weeg de tumoren met een schone set instrumenten en bereid ze voor op histologisch onderzoek. Ga vervolgens over tot het oogsten van de organen.Begin met het verwijderen van het kuiken uit de eierschaal. Doe dit door de schaal radiaal in gelijke helften te snijden. Giet vervolgens het kuikenembryo uit de opening.Verwijder daarnaast met een ponsinstrument twee stukjes kam van elke zijde van de eierschaal en plaats deze in een Eppendorfbuisje. Verplaats het kuiken met de borstzijde naar boven naar een weegschaaltje. Open het embryo met een schone set dissectie-instrumenten door door de buik en het borstbeen te snijden en de buikholte te openen.Verzamel eerst een stukje lever uit zowel de rechter- als de linkerlob. Vervolgens kunnen de organen voorzichtig worden verwijderd terwijl de viscera die de organen verbinden worden doorgesneden. Selecteer een long en snijd langs de vier zijden om deze uit de ribbenkast te bevrijden.Voor de consistentie. Verzamel dezelfde long van elk dier. Als sommige van de organen niet onmiddellijk worden verwerkt, bewaar deze dan bij min 20 °C.Na verwijdering van een xenograft hep three werd een histologische analyse van de tumor uitgevoerd. Dit is een tri RME-kleuring van de Hep three-tumor. De stromale component van de tumor is duidelijk zichtbaar tussen de verschillende lobben van de tumor.Hier worden intraveneus geïnjecteerde Hep3-cellen die GFP tot expressie brengen, gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Eén dag na de IV-injectie zijn slechts verspreide individuele tumorcellen zichtbaar; drie dagen na injectie is duidelijk dat het aantal cellen toeneemt en dat er kleine kolonies metastatische cellen worden gevormd. Het niveau van metastase gedurende zeven dagen na transplantatie is gekwantificeerd met behulp van real-time PCR voor de menselijke Alu-sequentie.De techniek die we hier vandaag hebben gedemonstreerd, is een zeer kwantitatief model met een hoge waarde. Zodra deze methode onder de knie is, kan een experimentator ongeveer 30 dieren per uur klaarmaken en kan daarnaast, binnen een periode van twee weken, metastase kwantitatief worden geanalyseerd met behulp van het vogelembryomodel na diens ontwikkeling. Deze techniek stelt onderzoekers in het veld van de kankerbiologie in staat om metastase kwantitatief te analyseren met behulp van een natuurlijk immuundeficiënt model.

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video beschrijft een micro-injection methode voor de levering van borstkankercellen in de perivitelline ruimte van transgene zebravis embryo's. Na incubatie visualiseren we het embryo onder een fluorescerende microscoop om kankercelinvasie, verspreiding en metastase te observeren.

zPDX-analyse van invasiviteit: onderzoek naar invasief gedrag van gemetastaseerde kankercellen in zebravisembryo xenografts

In this video, we describe the implantation of cancer cells onto a chicken chorioallantoic membrane to generate an in ovo model. The model successfully engrafts the ovarian cancer cells to study the progression of gynecological cancer.

Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis

This video demonstrates the procedure of intravenously injecting cancer cells into the chicken chorioallantoic membrane vasculature to generate a CAM cancer metastasis model. The injected cells eventually form scattered single-cancer cell colonies, allowing for the study of cancer invasion and metastasis.

Intravenous Injection of Cancer Cells into Chicken Chorioallantoic Membrane Vasculature: A Procedure to Establish Chorioallantoic Membrane Cancer Model to Study Cancer Invasion and Metastasis

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven hier xenograft zebravismodellen behulp van twee verschillende injectieplaatsen, dat wil zeggen, perivitelline ruimte en het kanaal van Cuvier, aan de invasief gedrag te onderzoeken en de intravasation en extravasatie potentieel van menselijke borstkankercellen respectievelijk beoordelen.

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

Uitgezaaid helder celnieraal celcarcinomis is een ziekte zonder een uitgebreid diermodel voor grondig preklinisch onderzoek. Dit protocol illustreert twee nieuwe diermodellen voor de ziekte: het orthotopicalisch geïmplanteerde muismodel en het kipchorioallantoïsche membraanmodel, die beide longmetastasen aantonen die lijken op klinische gevallen.

Vergelijking van uitgezaaide Clear Cell Renal Cell Carcinoma Model opgericht in muisnier en op Kip Chorioallantoic Membraan

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Intraveneuze injectie van kankercellen wordt vaak gebruikt in metastaseonderzoek, maar de gemetastaseerde tumorbelasting kan moeilijk te analyseren zijn. Hierin demonstreren we een staartaderinjectiemodel van metastase en nemen we een nieuwe benadering op om de resulterende gemetastaseerde longtumorbelasting te analyseren.

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Dit is een effectieve methode om te screenen op suppressors of drivers van kankermetastase. Cellen, getransduceerd met een expressiebibliotheek, worden geïnjecteerd in het kippen chorioallantoïsche membraan vasculatuur om gemetastaseerde kolonies te vormen. Kolonies met verminderde of verhoogde invasiviteit worden verwijderd, uitgebreid, opnieuw geïnjecteerd om hun fenotype te bevestigen en ten slotte geanalyseerd met behulp van sequencing met hoge doorvoer.

Ontdekking van gemetastaseerde regulatoren met behulp van een snel en kwantitatief intravital chick chorioallantoic membraanmodel

De CAM-Delam-test om de gemetastaseerde capaciteit van kankercellen te evalueren is relatief snel, eenvoudig en goedkoop. De methode kan worden gebruikt voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die de vorming van metastase reguleren en voor het screenen van geneesmiddelen. Een geoptimaliseerde test voor het analyseren van menselijke tumormonsters zou een klinische methode kunnen zijn voor gepersonaliseerde kankerbehandeling.

CAM-Delam-test om gemetastaseerde eigenschappen te scoren door delaminatie en invasiecapaciteit van kankercellen te kwantificeren

Leer kwantitatieve analyse van kankermetastase met behulp van het CAM-xenograftmodel in het kippenembryo. Deze methode maakt het mogelijk om de metastatische potentie van humane tumorcellen nauwkeurig te meten met PCR.

Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model

Meer video's verkennen