Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Het algemene doel van deze procedure is om muisretinale implantaten te electroporeren met fluorescente transcriptionele reporters en hun expressieniveaus te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst neonataal retinaal weefsel van muizen te isoleren via dissectie. De tweede stap van de procedure is het electroporeren van de retina met fluorescente DNA-reporterconstructen.

De derde stap van de procedure is het kweken van de geëlektroporeerde retina's als implantaten gedurende acht dagen. De laatste stap van de procedure is het oogsten van het retinaal explantaat en het kwantificeren van de expressieniveaus van de fluorescerende reporters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve expressieniveaus van verschillende promoter-reporterconstructen in de ontwikkelende muisretina laten zien via ex explantaat-elektroporatie, gevolgd door kwantitatieve data-analyse.

Mijn naam is Joe Corbo en ik ben docent bij de afdeling Pathologie en Immunologie van de Washington University School of Medicine in St. Louis. Vandaag presenteren we een videoprotocol waarin de techniek van ex vivo electroporatie in de retina's van pasgeboren muizen wordt gedemonstreerd, met als doel de activiteit van fotoreceptor-specifieke cis-regulerende elementen te kwantificeren. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Cindy Montana, een promovendus uit mijn laboratorium. Steriliseer eerst de electroporatiekamer en alle instrumenten met 70% ethanol ter voorbereiding op de oogcollectie.

Desinfecteer zowel de handschoenen als het werkvlak met ethanol en handhaaf gedurende de gehele procedure steriele omstandigheden. Pipetteer vervolgens, in een weefselkweekkast, zes milliliters dissectiemedium in één steriele Petri-schaal van 60 millimeter, en drie milliliters medium in twee steriele schalen van 35 millimeter. Desinfecteer terug bij het werkvlak de kop en nek van een pasgeboren muizenpup met 70% ethanol.

Nadat de kop snel met een schaar is onthoofd, wordt deze overgebracht naar een steriele petri-schaal van 100 millimeter. Verwijder de hoofdhuid met een klein schaartje om de ogen onder een dissectiemicroscoop bloot te leggen. Schep het oog met gebogen pincetten voorzichtig uit de oogkas en plaats het oog vervolgens in een schaal van 35 millimeter met dissectiemedium. Verzamel op deze manier ogen totdat er drie tot vier ogen per aliquot DNA zijn die geëlektroporeerd moeten worden, waarbij de ogen en het dissectiemedium op kamertemperatuur worden bewaard tot het proces is voltooid.

Desinfecteer zowel een scheermesje als de verpakking van een steriele plastic transferpipet met 70% ethanol, en gebruik vervolgens het scheermesje om de punt van de pipet hoog genoeg af te snijden zodat een heel oog kan worden gepipetteerd. Gebruik de verbreedde pipet om onder een dissectiemicroscoop bij hoge vergroting één oog over te brengen van de 35 millimeter schaal naar de 60 millimeter schaal. Gebruik een fijne pincet om eventueel weefsel, zoals extraoculaire spieren en vet, van het oogoppervlak te verwijderen.

Verwijder vervolgens de oogzenuw door deze aan de basis af te knijpen. Om het netvlies te isoleren, wordt een klein gaatje in de sclera geprikt bij de limbus; de sclera en het retinaal pigmentepitheel zien er glanzend uit in vergelijking met het netvliesweefsel, dat matgrijs is. Steek één punt van beide pincetten in het gaatje en scheur de sclera en het RPE voorzichtig open.

Zorg ervoor dat de lens op zijn plaats blijft. Gebruik de verbrede pipet om het gedissekeerde netvlies over te brengen naar de tweede 35 millimeter schaal met medium. Verzamel alle netvliezen en bewaar deze in een weefselkweekincubator op 37 degree Celsius.

Vul, voordat u begint met de elektroporatie in een weefselkweekkast, voor elk DNA-aliquot dat geëlektroporeerd moet worden één steriel schaaltje van 35 millimeter met dissectiemedium en een tweede schaaltje met kweekmedium. Spoel de kamers in het elektroporatieschaaltje drie keer uit met steriele 1X PBS met behulp van een P 200 pipet. Vul de kamers met de DNA-aliquots van 60 µL en vul alle ongebruikte kamers met 60 µL 1X PBS.

Sluit de elektroden aan op de electroporatieschaal en voer de juiste instellingen in op het electroporatieapparaat. Gebruik een fijne pincet om de retina's bij de lens vast te pakken en breng ze over naar de electroporatiekamers. Plaats maximaal vier retina's in elke kamer.

Plaats de retina's zodanig dat de lens tegen de metalen staaf leunt die aan de positieve elektrode is bevestigd. Veeg de pincet tussen elke kamer af om overdracht van DNA van de ene naar de volgende kamer te voorkomen. Zodra alle retina's zijn uitgelijnd, druk dan op start op de elektroporator.

Er zouden kleine belletjes moeten ontstaan op de metalen staaf die aan de negatieve elektrode is bevestigd. Ontkoppel de elektroden en schakel de elektrolyse uit met behulp van een pincet. Verplaats de retina's voorzichtig weg van de wanden van de kamer.

Breng de retina's vanuit de kamers over naar de 35 millimeter schalen met dissectiemedium. Gebruik een steriele transferpipet om de retina's vanuit het dissectiemedium over te brengen naar de 35 millimeter schalen met kweekmedium. Label de putjes van een steriele zes-puts kweekplaat en vul elk putje met drie milliliters kweekmedium.

Gebruik steriele pincetten om ronde watman nucleo-filters op het medium in elke put te laten drijven, waarbij de glanzende zijde van de filters naar boven is gericht. Breng met behulp van een dissectiescoop een enkel netvlies met een steriele transferpipet op het filter over, met de lenszijde naar beneden. Als het netvlies met de lenszijde naar boven landt, zuig het dan terug in de pipet en probeer het opnieuw.

Plaats maximaal vier retina's in elke put en houd deze in afzonderlijke druppels. Zodra de retina's in de putten zijn geplaatst, wordt de kweekplaat overgebracht naar een weefselkweekincubator van 37 °C en gedurende de gewenste tijd gekweekt. Meestal resulteert electroporatie, zoals hier getoond, na acht dagen in expressie van het DNA-construct over een kwart tot een derde van het retinaloppervlak.

Fluorescentieniveaus worden gekwantificeerd door uniform geëlektroporeerde regio's die het CRE-construct tot expressie brengen te vergelijken met regio's buiten het netvlies en deze vervolgens te normaliseren ten opzichte van de controle-expressie van GFP. In het bijzonder staafvormige fotoreceptoren worden efficiënt getransduceerd, zoals getoond. Hier zijn de resultaten van een elektroporatie waarbij twee staafspecifieke promotoren de expressie van GFP en DS red in de buitenste kernlaag aansturen.

Door de twee expressiepatronen te overvloeien met de DPI-kleuring, hier in blauw weergegeven, wordt de specifieke expressie in de fotoreceptoren duidelijk. Er wordt geen expressie waargenomen in de plexiforme laag of de ganglioncellaag. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u muisretinale explantaten dissecteert en cultiveert met als doel de activiteit van regulatoire elementen van het retinale cyste te kwantificeren.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.