Name: Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer hoe je cis-regulatorelementen kwantificeert in muizenretina's via explantelectroporatie met fluorescente reporters. Deze methode maakt genexpressie-analyse in fotoreceptoren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Karen Lawrence bedanken voor haar hulp bij de sectie beschrijven constructie van de elektroporatie kamer.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
<li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Genomic+regulatory+systems+%3A+development+and+evolution%22">Genomic regulatory systems : development and evolution</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22Genes+%26+signals%22">Genes & signals</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).</li>
<li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li>
<li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li>
<li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li>
<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
<li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li>
</ol>

Explantatie elektroporatie is een eenvoudige manier te kwantificeren cis-regulerende activiteit in de zich ontwikkelende muis netvlies. In vergelijking met cis-regulatorische analyse via de muis transgenese, elektroporatie is veel goedkoper, is er slechts pasgeboren muis pups, DNA, ontleden instrumenten, en elektroporatie / weefselkweek apparatuur. Het is ook veel minder tijd in beslag: een experiment vereist slechts een paar uur van de voorbereidingstijd, een cultuur periode van ongeveer acht dagen, en een paar uur aan het eind van het experiment voor de beeldvorming en data-analyse. Explantatie elektroporatie is ook superieur aan celcultuur gebaseerde cis-regulatorische analyse omdat de werkelijke retinaal weefsel wordt gebruikt. Het netvlies ontwikkelt zich heel normaal in explantatie cultuur-it maakt drie verschillende cellulaire lagen (buitenste nucleaire laag, binnenste nucleaire laag en ganglion cellaag), hoewel fotoreceptoren niet buitenste segmenten uit te werken. Een ander voordeel is dat Explantatie elektroporatie is zeer reproduceerbaar. Dezelfde constructen geëlektroporeerd in verschillende netvlies, zelfs op verschillende dagen, meestal resulteert in dezelfde relatieve expressie niveaus. Aangezien de geëlektroporeerd plasmiden wordt gedacht dat episomally worden gehandhaafd in de kern en zijn niet opgenomen in de chromosomen, zij niet lijken te zijn onderworpen aan dezelfde integratie plaats effecten die cis-regulatorische analyse uitgevoerd in transgene muizen mee kampen. Explantatie elektroporatie heeft wel een aantal beperkingen. Ten eerste kan alleen cellen die nog in de cel cyclus efficiënt worden getransduceerd door elektroporatie 15. Bij P0, staven en andere later geboren netvlies celtypen (bipolaire cellen, amacrine cellen, M ller glia) zijn de belangrijkste celpopulaties het doelwit van deze methode. Elektroporatie van de kegel fotoreceptoren door P0 elektroporatie is gemeld, maar het rendement 16 lijkt laag te zijn. Een tweede beperking is dat explantatie cultuur buiten de twee weken resulteert in een progressieve afwijking van het netvlies en wordt daarom niet aanbevolen. Als promotor kwantificering is nodig op late tijdstippen, maar een in-vivo electroporatie 9 kan worden uitgevoerd, gevolgd door het netvlies dissectie op de gewenste tijdpunt, flat-montage van de ontleed netvlies, en kwantificering zoals beschreven in hoofdstuk 9. Een derde beperking is dat deze test is slechts matig high-throughput. In tegenstelling tot de celcultuur-gebaseerde testen die kunnen testen honderden constructen in een enkel experiment, de techniek beschreven in dit protocol vereist een minimum van een hele muis netvlies per bouwen. Zo kan slechts een paar dozijn construeert redelijkerwijs kan worden geëlektroporeerd in een dag. Een extra waarschuwing met betrekking tot de kwantificering van de promotor activiteit met behulp van de huidige aanpak is dat er een potentieel voor &#39;bloeden-through&#39; van DsRed fluorescentie in het GFP-kanaal, met name bij het testen van een zeer sterke promotors. De reden hiervoor is dat het emissiespectrum van overlapt gedeeltelijk die van GFP DsRed. Te omzeilen dit probleem, moet geoptimaliseerd emissie-filters worden gebruikt, dat het minimaliseren van de spectrale overlap tussen DsRed en GFP. Wanneer dergelijke geoptimaliseerde filter sets niet beschikbaar zijn, zou een andere mogelijke oplossing is om een blauw-verschoven fluorescerend eiwit (bijvoorbeeld, BFP of GVB) te gebruiken in plaats van GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Elektroporatie schotel, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatuur </td><td> 45-0105 </td><td> Zie protocol rubriek 1 voor modificaties </td></tr><tr><td> 100% siliconen rubber aquarium cement </td><td> Perfecto Manufacturing </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plastic microbuisjes rack </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Alleen de hendel rack zal worden gebruikt </td></tr><tr><td> Dremel gereedschap </td><td></td><td></td><td> Voor het snijden van de handgreep uit de plastic buis rek </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100X concentratie </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Voor 1000X voorraad, opnieuw in suspensie op 5mg/ml in 5mm HCl en filter-gesteriliseerd </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Square-wave electroporator </td><td> BTX Harvard Apparatuur </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore filters </td><td> Whatman papier </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> Weefselkweek incubator </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Dekglaasjes # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0.16mm dik </td></tr><tr><td> Fluorescerende verbinding microscoop uitgerust met een camera </td><td></td><td></td><td> Camera moet worden monochromatisch (bijvoorbeeld ORCA-ER camera van Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed filter set voor samengestelde microscoop </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> 86007 </td><td> Dit filter set minimaliseert bleedthrough tussen de rode en groene chanenels </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

kwantificeren van de activiteit van cis-regulatorische elementen in de muis retina door explantatie elektroporatie

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcriptiefactoren binnen mobiele netwerken gen de controle van de spatio-temporele patroon en het niveau van expressie van hun doelwitgenen door binding aan cis-regulatorische elementen (Cres), korte (~ 300 tot 600 bp) strekt zich uit van genomisch DNA die stroomopwaarts kan liegen, stroomafwaarts, of binnen de introns van de genen die ze controleren. CRES (dat wil zeggen, enhancers / promotors) meestal bestaan ​​uit meerdere geclusterde bindingsplaatsen voor zowel transcriptionele activators en repressoren 1-3. Ze dienen als logische integrators van transcriptionele inbreng geven van een unitaire output in de vorm van spatiotemporally precies en kwantitatief exact promotor activiteit. De meeste studies van zoogdieren cis-regulering tot op heden hebben vertrouwd op de muis transgenese als een middel van het testen van de enhancer-functie van Cres 4-5. Deze techniek is tijdrovend, duur en, op grond van plaats van inbrengen effecten, die grotendeels niet-kwantitatief. Aan de andere kant hebben kwantitatieve assays voor zoogdieren CRE-functie is ontwikkeld in weefselkweek systemen (bijvoorbeeld, dubbele luciferase assays), maar de in vivo relevantie van deze resultaten is vaak onzeker. Elektroporatie biedt een uitstekend alternatief voor de traditionele muis transgenese in dat het mogelijk maakt zowel de spatiotemporele en kwantitatieve beoordeling van cis-regulerende activiteit in levende zoogdieren weefsel. Deze techniek is vooral nuttig bij de analyse van de cis-regulering in het centrale zenuwstelsel, met name in de cerebrale cortex en het netvlies 6-8. Terwijl de muis het netvlies elektroporatie, zowel in vivo en ex vivo, is ontwikkeld en uitvoerig beschreven door Matsuda en Cepko 6-7,9, hebben we recent ontwikkelde een eenvoudige benadering om de activiteit van fotoreceptor-specifieke CRES kwantificeren in geëlektroporeerd muis netvlies 10. Gezien het feit dat de hoeveelheid DNA die in het netvlies geïntroduceerd door elektroporatie kan variëren van experiment om te experimenteren, is het noodzakelijk om onder andere een co-geëlektroporeerd &#39;laden control&#39; in alle experimenten. In dit opzicht is de techniek is zeer vergelijkbaar met de dubbele luciferase assay gebruikt om de promoter activiteit in gekweekte cellen te kwantificeren. Bij het ​​testen van fotoreceptor cis-regulerende activiteit, wordt elektroporatie meestal uitgevoerd bij pasgeboren muizen (postnatale dag 0, P0), dat is de tijd van de piek staaf productie 11-12. Zodra het netvlies celtypes worden post-mitotische, elektroporatie is veel minder efficiënt. Gezien de hoge mate van staaf geboorte in pasgeboren muizen en het feit dat staven meer dan 70% van de cellen in het volwassen muis netvlies vormen de meerderheid van de cellen die zijn geëlektroporeerd op P0 zijn staven. Om deze reden, staaf fotoreceptoren zijn het makkelijkst netvlies celtype om te studeren via elektroporatie. De techniek die we hier beschrijven is vooral nuttig voor het kwantificeren van de activiteit van fotoreceptor Cres.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Transcriptiefactoren binnen cellulaire gennetwerken controleren het spatiotemporele patroon en de expressieniveaus van hun doelgenen door te binden aan ...

Het algemene doel van deze procedure is om muisretinale implantaten te electroporeren met fluorescente transcriptionele reporters en hun expressieniveaus te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst neonataal retinaal weefsel van muizen te isoleren via dissectie. De tweede stap van de procedure is het electroporeren van de retina met fluorescente DNA-reporterconstructen.De derde stap van de procedure is het kweken van de geëlektroporeerde retina's als implantaten gedurende acht dagen. De laatste stap van de procedure is het oogsten van het retinaal explantaat en het kwantificeren van de expressieniveaus van de fluorescerende reporters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve expressieniveaus van verschillende promoter-reporterconstructen in de ontwikkelende muisretina laten zien via ex explantaat-elektroporatie, gevolgd door kwantitatieve data-analyse.Mijn naam is Joe Corbo en ik ben docent bij de afdeling Pathologie en Immunologie van de Washington University School of Medicine in St. Louis. Vandaag presenteren we een videoprotocol waarin de techniek van ex vivo electroporatie in de retina's van pasgeboren muizen wordt gedemonstreerd, met als doel de activiteit van fotoreceptor-specifieke cis-regulerende elementen te kwantificeren. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Cindy Montana, een promovendus uit mijn laboratorium. Steriliseer eerst de electroporatiekamer en alle instrumenten met 70% ethanol ter voorbereiding op de oogcollectie.Desinfecteer zowel de handschoenen als het werkvlak met ethanol en handhaaf gedurende de gehele procedure steriele omstandigheden. Pipetteer vervolgens, in een weefselkweekkast, zes milliliters dissectiemedium in één steriele Petri-schaal van 60 millimeter, en drie milliliters medium in twee steriele schalen van 35 millimeter. Desinfecteer terug bij het werkvlak de kop en nek van een pasgeboren muizenpup met 70% ethanol.Nadat de kop snel met een schaar is onthoofd, wordt deze overgebracht naar een steriele petri-schaal van 100 millimeter. Verwijder de hoofdhuid met een klein schaartje om de ogen onder een dissectiemicroscoop bloot te leggen. Schep het oog met gebogen pincetten voorzichtig uit de oogkas en plaats het oog vervolgens in een schaal van 35 millimeter met dissectiemedium. Verzamel op deze manier ogen totdat er drie tot vier ogen per aliquot DNA zijn die geëlektroporeerd moeten worden, waarbij de ogen en het dissectiemedium op kamertemperatuur worden bewaard tot het proces is voltooid.Desinfecteer zowel een scheermesje als de verpakking van een steriele plastic transferpipet met 70% ethanol, en gebruik vervolgens het scheermesje om de punt van de pipet hoog genoeg af te snijden zodat een heel oog kan worden gepipetteerd. Gebruik de verbreedde pipet om onder een dissectiemicroscoop bij hoge vergroting één oog over te brengen van de 35 millimeter schaal naar de 60 millimeter schaal. Gebruik een fijne pincet om eventueel weefsel, zoals extraoculaire spieren en vet, van het oogoppervlak te verwijderen.Verwijder vervolgens de oogzenuw door deze aan de basis af te knijpen. Om het netvlies te isoleren, wordt een klein gaatje in de sclera geprikt bij de limbus; de sclera en het retinaal pigmentepitheel zien er glanzend uit in vergelijking met het netvliesweefsel, dat matgrijs is. Steek één punt van beide pincetten in het gaatje en scheur de sclera en het RPE voorzichtig open.Zorg ervoor dat de lens op zijn plaats blijft. Gebruik de verbrede pipet om het gedissekeerde netvlies over te brengen naar de tweede 35 millimeter schaal met medium. Verzamel alle netvliezen en bewaar deze in een weefselkweekincubator op 37 degree Celsius.Vul, voordat u begint met de elektroporatie in een weefselkweekkast, voor elk DNA-aliquot dat geëlektroporeerd moet worden één steriel schaaltje van 35 millimeter met dissectiemedium en een tweede schaaltje met kweekmedium. Spoel de kamers in het elektroporatieschaaltje drie keer uit met steriele 1X PBS met behulp van een P 200 pipet. Vul de kamers met de DNA-aliquots van 60 µL en vul alle ongebruikte kamers met 60 µL 1X PBS.Sluit de elektroden aan op de electroporatieschaal en voer de juiste instellingen in op het electroporatieapparaat. Gebruik een fijne pincet om de retina's bij de lens vast te pakken en breng ze over naar de electroporatiekamers. Plaats maximaal vier retina's in elke kamer.Plaats de retina's zodanig dat de lens tegen de metalen staaf leunt die aan de positieve elektrode is bevestigd. Veeg de pincet tussen elke kamer af om overdracht van DNA van de ene naar de volgende kamer te voorkomen. Zodra alle retina's zijn uitgelijnd, druk dan op start op de elektroporator.Er zouden kleine belletjes moeten ontstaan op de metalen staaf die aan de negatieve elektrode is bevestigd. Ontkoppel de elektroden en schakel de elektrolyse uit met behulp van een pincet. Verplaats de retina's voorzichtig weg van de wanden van de kamer.Breng de retina's vanuit de kamers over naar de 35 millimeter schalen met dissectiemedium. Gebruik een steriele transferpipet om de retina's vanuit het dissectiemedium over te brengen naar de 35 millimeter schalen met kweekmedium. Label de putjes van een steriele zes-puts kweekplaat en vul elk putje met drie milliliters kweekmedium.Gebruik steriele pincetten om ronde watman nucleo-filters op het medium in elke put te laten drijven, waarbij de glanzende zijde van de filters naar boven is gericht. Breng met behulp van een dissectiescoop een enkel netvlies met een steriele transferpipet op het filter over, met de lenszijde naar beneden. Als het netvlies met de lenszijde naar boven landt, zuig het dan terug in de pipet en probeer het opnieuw.Plaats maximaal vier retina's in elke put en houd deze in afzonderlijke druppels. Zodra de retina's in de putten zijn geplaatst, wordt de kweekplaat overgebracht naar een weefselkweekincubator van 37 °C en gedurende de gewenste tijd gekweekt. Meestal resulteert electroporatie, zoals hier getoond, na acht dagen in expressie van het DNA-construct over een kwart tot een derde van het retinaloppervlak.Fluorescentieniveaus worden gekwantificeerd door uniform geëlektroporeerde regio's die het CRE-construct tot expressie brengen te vergelijken met regio's buiten het netvlies en deze vervolgens te normaliseren ten opzichte van de controle-expressie van GFP. In het bijzonder staafvormige fotoreceptoren worden efficiënt getransduceerd, zoals getoond. Hier zijn de resultaten van een elektroporatie waarbij twee staafspecifieke promotoren de expressie van GFP en DS red in de buitenste kernlaag aansturen.Door de twee expressiepatronen te overvloeien met de DPI-kleuring, hier in blauw weergegeven, wordt de specifieke expressie in de fotoreceptoren duidelijk. Er wordt geen expressie waargenomen in de plexiforme laag of de ganglioncellaag. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u muisretinale explantaten dissecteert en cultiveert met als doel de activiteit van regulatoire elementen van het retinale cyste te kwantificeren.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC)...

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van...

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo&#39;s

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.

Hele netvlies Explantaten van kippenembryo&#39;s voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

We demonstreren een methode voor het enten van gekweekte cellen in specifieke delen van vroege muis-embryo's om hun in vivo potentieel te bepalen. We introduceren ook een geoptimaliseerde elektroporatiemethode die glazen capillairen van bekende diameter gebruikt, waardoor de nauwkeurige levering van exogeen DNA in een paar cellen in de embryo's mogelijk wordt.

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Leer hoe je cis-regulatorelementen kwantificeert in muizenretina's via explantelectroporatie met fluorescente reporters. Deze methode maakt genexpressie-analyse in fotoreceptoren mogelijk.

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Meer video's verkennen