Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie
June 28th, 2011
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om muisretinaire implantaten met fluorescente transcriptionele reporters te elektroporeren en hun expressieniveaus te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst neonataal muisretinaweefsel te isoleren via dissectie. De tweede stap van de procedure is om de retina te elektroporeren met fluorescente DNA reporterconstructen.
De derde stap van de procedure is om de geëlektropereerde retinas gedurende acht dagen als implantaten te kweken. De laatste stap van de procedure is om de retinale explan te oogsten en expressieniveaus van de fluorescente reporters te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve expressieniveaus van verschillende promotorreporterconstructen in de zich ontwikkelende muisretina laten zien door middel van X explan elektroporatie, gevolgd door kwantitatieve gegevensanalyse.
Mijn naam is Joe Corbo en ik ben een faculteitslid in het Department of Pathology and Immunology aan de Washington University School of Medicine in St. Louis. En vandaag gaan we een videoprotocol presenteren dat de techniek van X explan elektroporatie in pasgeboren muisretina's demonstreert voor het kwantificeren van de activiteit van fotoreceptorspecifieke CYS regulatorische elementen. Dit protocol zal worden gedemonstreerd door een afstudeerstudent uit mijn lab, Cindy Montana. Steriliseer eerst de elektroporeerkamer en alle instrumenten met 70%ethanol ter voorbereiding op het oogsten van de ogen.
Desinfecteer zowel handschoenen als werkblad met ethanol en handhaaf steriele omstandigheden gedurende de hele procedure. Pipetteer vervolgens in een weefselkweekhood zes milliliter dissectiemedium in één steriele 60 millimeter petrischaal en drie milliliter medium in twee steriele 35 millimeter schalen. Teruggekeerd aan het werkblad, desinfecteer het hoofd en de nek van een pasgeboren muisjong met 70%ethanol.
Na het snel onthoofden van het hoofd met een schaar, breng het hoofd over in een steriele 100 millimeter schaal, verwijder de hoofdhuid met kleine schaar om de ogen bloot te leggen onder een dissectiemicroscoop. Gebruik gekromde pincetten om het oog voorzichtig uit de oogkas te scheppen en plaats het oog vervolgens in een 35 millimeter schaal met dissectiemedium. Blijf ogen verzamelen zodat er drie tot vier ogen per aliquot DNA zijn om geëlektroperd te worden, houd de ogen en het dissectiemedium op kamertemperatuur tot het klaar is.
Desinfecteer zowel een scheermesje als de verpakking van een steriele plastic overdrachtspipet met 70%ethanol en gebruik vervolgens het scheermesje om de punt van de pipet af te snijden hoog genoeg zodat een heel oog kan worden gepipetteerd. Gebruik de verwijde pipet om één oog van de 35 millimeter schaal over te brengen naar de 60 millimeter schaal onder hoge vergroting van een dissectiemicroscoop. Gebruik fijne pincetten om eventueel weefsel zoals extraoculaire spieren en vet te verwijderen van het oppervlak van het oog.
Verwijder vervolgens de oogzenuw door deze af te knijpen aan de basis. Om de retina te isoleren, maak een klein gaatje in de sclera bij de limbus, de sclera en het gepigmenteerde oppervlak van de retina zien er glanzend uit in vergelijking met het retinale weefsel, dat mat grijs is. Steek een tand uit beide paren pincetten in het gaatje en scheurt voorzichtig de sclera en het RPE open.
Zorg ervoor dat de lens op zijn plaats blijft. Gebruik de verwijde pipet om de gedissecteerde retina naar de tweede 35 millimeter schaal met medium te verplaatsen. Verzamel alle retina's en bewaar ze in een weefselkweekincubator van 37 graden Celsius.
Tot de elektroporering, werk in een weefselkweekhood voor elk DNA Eloqua dat moet worden geëlektroperd, vul één steriele 35 millimeter schaal met dissectiemedium en een tweede schaal met kweekmedium. Gebruik een P 200 pipet om de kamers in de elektroporeerschaal drie keer met steriele één XPB S te spoelen. Vul de kamers met de 60 microliter DNA aliquots en vul eventuele ongebruikte kamers met 60 microliters van één XPBS.
Verbind de elektroden met de elektroporeerschaal en voer de juiste instellingen in op de elektro. Gebruik fijne pincetten om de retina's bij de lens vast te grijpen en breng ze over in de elektroporeerkamers. Plaats maximaal vier retina's in elke kamer.
Plaats de retina's zodat de lens tegen de metalen staaf aan de positieve elektrode leunt. Veeg de pincetten schoon tussen elke kamer om overdracht van DNA van de ene naar de andere kamer te voorkomen. Zodra alle retina's zijn uitgelijnd, druk op start op de elektro.
Er zouden kleine bubbels moeten ontstaan op de metalen staaf die aan de negatieve elektrode is bevestigd. Ontkoppel de elektroden en schakel de elektro uit met behulp van pincetten. Verplaats de retina's voorzichtig weg van de kamerwanden.
Breng de retina's over van de kamers naar de 35 millimeter schalen met dissectiemedium. Gebruik een steriele overdrachtspipet om de retina's over te brengen van het dissectiemedium naar de 35 millimeter schalen met kweekmedium. Label de putjes van een steriele zes-putjes kweekplaat en vul elk putje met drie milliliter kweekmedium.
Gebruik steriele pincetten om ronde watman nucleofilters bovenop het medium in elk putje te plaatsen met de glanzende kant van de filters naar boven gericht. Met behulp van een dissectiemicroscoop, breng een enkele retina over op de filter met steriele overdrachtspipet lenszijde naar beneden. Als de retina lenszijde omhoog landt, trek hem terug in de pipet en probeer het opnieuw.
Plaats niet meer dan vier retina's in elk putje en houd ze in aparte druppels. Zodra de retina's in de putjes zijn geplaatst, verplaats de kweekplaat naar een weefselkweekincubator van 37 graden Celsius en laat ze groeien voor de gewenste tijd. Meestal resulteert succesvolle elektroporering in expressie van het DNA-construct over een vierde tot een derde van het retinale oppervlak.
Fluorescentieniveaus worden gekwantificeerd door uniform geëlektropeerde gebieden die het CRE-construct tot expressie brengen te vergelijken met gebieden buiten de retina en vervolgens te normaliseren op controle GFP-expressie. Stamcellenfotoreceptoren in het bijzonder worden efficiënt getransduceerd. Hier zijn de resultaten van een elektroporering waarbij
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de activiteit van cis-regulatoire elementen in levende muisnetvliezen te kwantificeren door middel van explant electroporatie. Het beschrijft de processen van DNA-voorbereiding, netvliesdissectie, electroporatie en daaropvolgende analyse.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Cis-regulatoire elementen spelen een cruciale rol in genexpressie.
- Het begrijpen van hun activiteit in netvliescellen kan inzicht geven in visuele processen.
- Dit protocol maakt gebruik van electroporatie om DNA-constructen in netvliesweefsels te introduceren.
- Fluorescente reporters maken de visualisatie van genexpressieniveaus mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de expressieniveaus van fluorescente transcriptionele reporters in muisnetvliezen te kwantificeren.
- Om de effectiviteit van electroporatie in het leveren van DNA aan netvliesweefsels te demonstreren.
- Om de activiteit van specifieke promotorconstructen in fotoreceptorcellen te analyseren.
Gebruikte methoden
- Isolering van neonataal muisnetvliesweefsel door dissectie.
- Electroporatie van netvliesweefsels met fluorescente DNA-constructen.
- Kweek van geëlektroporeerd netvlies gedurende acht dagen.
- Kwantificering van expressieniveaus met behulp van fluorescentieanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle electroporatie resulteerde in expressie over een aanzienlijk deel van het netvliesoppervlak.
- Fluorescentieniveaus werden gekwantificeerd door geëlektroporeerd gebieden te vergelijken met controlegebieden.
- Staafjesfotoreceptoren vertoonden efficiënte transductie van de DNA-constructen.
- Expressiepatronen van verschillende promotoren werden gevisualiseerd en geanalyseerd.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van genexpressie in netvliescellen.
- Electroporatie is een effectieve techniek voor het leveren van genetisch materiaal aan muisnetvliezen.
- De resultaten dragen bij aan het begrijpen van de rol van cis-regulatoire elementen in de ontwikkeling van het netvlies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying cis-regulatory element activity in living retinal tissue enables mechanistic de-risking of transcriptional targets in neuroscience drug discovery. This approach provides quantitative, spatiotemporally resolved data that supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. By reducing reliance on non-quantitative transgenesis, it improves predictive confidence in early discovery decisions for retinal and neurodegenerative pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by measuring enhancer/promoter activity in native retinal tissue.
- Operational Value: Provides quantitative readouts that clarify dose-response relationships of cis-regulatory elements.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking regulatory variation to gene expression in photoreceptors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates normalized fluorescence data suitable for high-content screening of regulatory variants.
- Operational Value: Uses co-electroporated loading controls to normalize for transfection efficiency, improving assay reproducibility.
- Scalability: Enables side-by-side comparison of multiple promoter constructs in explanted tissue.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Measures activity of photoreceptor-specific cis-elements in a disease-relevant postnatal retinal model.
- Mechanistic Continuity: Bridges in vitro reporter assays with in vivo-like tissue context for target validation.
- Risk Mitigation: Reduces false positives by validating regulatory function in intact retinal explants.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits between target hypothesis generation and lead optimization, providing quantitative regulatory activity data to inform compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Tests transcriptional regulatory hypotheses in postnatal mouse retina, a model of rod photoreceptor development.
- Screening: Produces fluorescence-based readouts enabling comparison of enhancer/promoter strength across constructs.
- Analytics: Delivers normalized quantitative output via fluorescence intensity ratios, supporting statistical comparison of regulatory activity.
- Translational Research: Uses rodent retina to model human photoreceptor gene regulation relevant to inherited retinal diseases.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for quantifying regulatory element activity across developmental timepoints or disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by quantifying cis-regulatory function in native tissue.
- Operational Value: Standardizes assay conditions through explant culture and internal controls, reducing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insight into transcriptional regulation.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of targets with validated regulatory drivers in photoreceptor pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal dissection, electroporation, and fluorescence microscopy.
- Dependent on sterile tissue culture facilities and electroporation equipment with chamber optimization.
- Needs standardization of DNA construct loading and incubation timing across experiments.
- Limited to postnatal retinal explants due to decreased electroporation efficiency in mature tissue.
- Relies on co-electroporated controls to normalize for variable transfection efficiency.
