Name: Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Leer hoe je veilig oncogenen in menselijke cellen introduceert met ecotroop lentivirus en polymercomplexatie. Deze methode verhoogt transductie-efficiëntie en minimaliseert risico's voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering voor dit project werd verstrekt door het California Institute voor regeneratieve geneeskunde.

1. Productie, oogst en invriezen van lentivirus
<ol>
	<li>Raadpleeg de veiligheidsfunctionaris van uw instelling voordat u met dit protocol begint en volg de door hen aanbevolen veiligheidsrichtlijnen.</li>
	<li>Dag 1. Begin met gezonde, snel groeiende 293T-cellen voor de productie van het virus. Zaai de cellen uit met 5 x 106 
	cellen per 10 cm plaat. Gebruik antibioticumvrij 293T-medium (high-glucose DMEM met 10% FBS en 4 mM L-glutamine) voor de virusproductie.</li>
	<li>Dag 2. Transfect in de late namiddag de 293T-cellen als volgt (de opgegeven hoeveelheden zijn voor één 10 cm plaat). 
	Laat alle reagentia opwarmen tot kamertemperatuur. Pipetteer 375 μl OptiMEM in een microcentrifugebuis en voeg vervolgens 25 μl 
	Fugene HD toe. Zorg dat onverdunde Fugene de wand van de buis niet raakt.</li>
	<li>Meng in een microcentrifugebuis het volgende:
		<ul>
			<li>5 μg transferplasmid (Slc7a1, targetvector of fluorescentiecontrolevector)</li>
			<li>3,75 μg packagingplasmid (pCMV-dR8.91 of psPax2)</li>
			<li>1,25 μg envelopplasmid (pMD2.G voor pantroop, pHCMV-EcoEnv voor ecotroop)</li>
			<li>serumvrij OptiMEM tot 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Voeg de twee buisjes samen en incubeer het mengsel 20-30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Vervang het medium van de 293T-cellen door 10 ml vers antibioticumvrij 293T-medium. Voeg het Fugene/plasmid-mengsel 
	druppelsgewijs toe aan de plaat en incubeer dit gedurende de nacht bij 37°C, 5% CO2.</li>
	<li>Dag 3. Vervang het medium van de 293T-cellen door 10 ml vers antibioticumvrij 293T-medium. Ga voorzichtig te werk, 
	omdat 293T-cellen slechts zwak hechten en kunnen loslaten wanneer medium te krachtig op de 
	monolaag wordt gepipetteerd. Incubeer gedurende twee dagen in een bevochtigde incubator voor de virusproductie.</li>
	<li>Dag 5. Oogst het virus en filter dit met een 0,45 mm filter met lage eiwitbinding. Gebruik het direct of verdeel het 
	in eenmalige aliquots en vries deze in bij -80°C. Bevroren pantrope en ecotrope virussen moeten respectievelijk na zes maanden 
	en één maand bewaring opnieuw worden getitreerd.</li>
	<li>Titreer het virus als volgt, met gebruik van cellen die relatief vatbaar zijn voor transductie. Transduceer de cellen gedurende de nacht met het fluorescentiecontrolevirus met behulp van seriële verdunningen (bijv. 1:10, 1:100, 1:1000) in vers medium met 6 μg/ml PB. Vervang dit de volgende dag door vers medium. Geef de cellen na transductie twee dagen de tijd om het fluorescenteiwit tot expressie te brengen en bepaal vervolgens de fractie getransduceerde cellen via FACS. Bereken de titer in transforming units (TU) per ml, op basis van verdunningen die &lt; 15% transductie opleveren om meervoudige transductie-events te minimaliseren. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Formule voor titerberekening, vergelijking voor viruskwantificatie, wiskundige analyse in de virologie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Vergelijking 1">
	</li>
</ol>
2. Transductie van menselijke doelcellen met de murine retrovirusreceptor Slc7a1
<ol>
	<li>Selecteer een multiplicity of infection (MOI) = 2 om te waarborgen dat de meeste cellen worden getransduceerd. Voor doelcellen die resistent zijn tegen transductie, zoals HDF's, is een hogere MOI vereist; wij verdunnen het virale supernatant slechts 1:2 om transductie van de meerderheid van de cellen te bereiken.</li>
	<li>Transduceer de doelcellen overnacht met viraal supernatant verdund in vers kweekmedium met 6 μg/ml PB, wat de transductie verhoogt door de elektrostatische interactie tussen het virus en de doelcel te verbeteren.1 Idealiter dient men een minimaal volume virus te gebruiken, zoals 1 ml voor een 35 mm plaat, omdat diffusie een beperkende factor is voor de transductie-efficiëntie.</li>
	<li>Kweek de cellen gedurende ten minste 48 uur na het verwijderen van het virus voordat ze worden getransduceerd met ecotroop virus, om voldoende expressie van de Slc7a1-receptor te waarborgen.</li>
	<li>(Optioneel) Indien gewenst is het mogelijk om blasticidine te gebruiken om te selecteren op stabiel getransduceerde cellen die Slc7a1 tot expressie brengen. Er moet vooraf een blasticidine-killcurve worden opgesteld om de laagste effectieve concentratie te bepalen, over het algemeen tussen 2 – 10 μg/ml, die alle niet-getransduceerde doelcellen binnen 7 dagen doodt. Schakel de getransduceerde cellen ongeveer 2 dagen na het verwijderen van het Slc7a1-virus over naar medium dat blasticidine bevat. Kweek de cellen gedurende 7 dagen in medium met blasticidine; op dat moment zullen alle resterende cellen de retrovirusreceptor stabiel tot expressie brengen, waarna ze kunnen worden getransduceerd met ecotroop virus en kunnen worden opgeslagen voor toekomstig gebruik als een stabiele Slc7a1-expressielijn.</li>
</ol>
3. Titratie van polymeercomplexen om toxiciteit te bepalen
<ol>
	<li>Dag 1. Zaai cellen uit met 5000 cellen/well in een 96-wellplaat, waarbij ten minste triplikaat wells per experimentele groep worden gebruikt. Neem niet-getransduceerde cellen in compleet medium op om een basiswaarde voor gezonde cellen te verkrijgen, evenals monsters bestaande uit cellen in serumvrij medium om groeistop te induceren als controle. Zaai parallel cellen uit in een geschikt formaat (zoals een 24-wellplaat) voor microscopische of FACS-gebaseerde analyse van de transductie-efficiëntie in elke experimentele conditie.</li>
	<li>Dag 2. Transduceer cellen in platen die zijn klaargezet voor zowel de MTT- als FACS-analyses met virus dat GFP codeert, bij een MOI van 0,5 om ~40% van de doelcellen te transduceren. Test variërende concentraties van CS/PB (bijv. 50, 100, 200, 400, 600 en 800 mg/ml van elke component), evenals 6 μg/ml PB, om de optimale hoeveelheden te bepalen. Genereer polymeercomplexen zoals beschreven in Deel 4, hieronder.</li>
	<li>Dag 3. Verwijder het virusbevattende medium en vervang dit door vers medium. Plaats de platen terug in een bevochtigde incubator.</li>
	<li>Dag 5. Analyseer de FACS-plaat om de transductie-efficiëntie bij elke polymeerconcentratie te bepalen. </li>
	<li>Dag 6. Verwijder het medium uit alle wells van de MTT-plaat en vervang dit door 100 μl MTT-oplossing (1 mg/ml MTT in compleet medium). Cultiveer gedurende drie uur in een bevochtigde incubator om de MTT te laten reduceren in de mitochondriën van metabool actieve cellen.</li>
	<li>Verwijder de MTT-oplossing en vervang deze door 200 ml MTT-oplosmiddel (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 in isopropanol). </li>
	<li>Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of totdat al het paarse MTT-formazan-precipitaat is opgelost. Lees de absorbentie af op een microplate-reader bij 570 nm, waarbij de achtergrondmeting bij 690 nm wordt afgetrokken. </li>
	<li>Selecteer de optimale polymeerconcentratie die een maximale toename van de transductie oplevert, bepaald via FACS, met een minimaal effect op de metabole activiteit, bepaald via MTT. Voor HDFs hebben we 100 μg/ml CS/PB geselecteerd op basis van de gegevens getoond in de Representatieve Resultaten, hieronder.</li>
</ol>
4. Ecotrope transductie met polymeercomplexatie
<ol>
	<li>Bereid steriel gefilterde voorraadoplossingen van PB en chondroïtinesulfaat voor in water bij een concentratie van 20 mg/ml. Verdeel deze in aliquoten en bewaar ze bij -20°C.</li>
	<li>Pipetteer viraal supernatant in een microcentrifugebuisje en verdun dit met vers kweekmedium tot de gewenste eindconcentratie (bijv. een MOI van 2). Voeg opeenvolgend gelijke volumes PB en chondroïtinesulfaat toe (concentraties bepaald in stap 3 hierboven), waarbij het buisje na elke toevoeging wordt geschud om te mengen. Het virale mengsel wordt onmiddellijk troebel door de vorming van neerslag. Incubeer het virale mengsel 5 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van complexen mogelijk te maken.</li>
	<li>Verwijder het medium van de receptor-expresserende doelcellen, vervang dit door het virale mengsel en incubeer dit gedurende de nacht bij 37°C, 5% CO2. Was na het verwijderen van het virale mengsel het celloppervlak twee keer met PBS om te helpen bij het verwijderen van virale complexen. Volledige verwijdering is niet noodzakelijk; we hebben geen nadelige effecten op de gezondheid van de cellen waargenomen door residuele polymeercomplexen.</li>
</ol>
5. Verificatie van de specificiteit van ecotrope transductie
<ol>
	<li>Bij de eerste productie van ecotroop virus is het vanuit veiligheidsoogpunt raadzaam om te verifiëren dat het virus niet in staat is om ongemodificeerde menselijke cellen te transduceren. Transduceer menselijke cellen gedurende de nacht met ecotroop lentivirus in een relatief hoge concentratie (slechts een 1 tot 2-voudige verdunning van het viraal supernatant in vers medium) met 6 μg/ml PB of een geoptimaliseerde CS/PB-concentratie.</li>
	<li>Verwijder het virushoudende medium en vervang dit door vers medium. Valideer na 2 dagen incubatie van de cellen de expressie van het transgen via FACS met behulp van fluorescente vectoren en/of via RT-PCR met transgeen-specifieke primers.</li>
</ol>
6. Representatieve resultaten:
Fig. 1A toont het proces voor de productie van lentivirus, en Fig. 1B toont de transductie van menselijke cellen met ecotroop lentivirus, inclusief pre-transductie met de murine retrovirusreceptor Slc7a1. Voor het bepalen van de virustiter gebruiken we een menselijke rhabdomyosarcoom-cellijn die stabiel is getransduceerd met Slc7a1 (Slc-hRMS). Bij het gebruik van fluorescente controlevectoren om de transductie-efficiëntie te monitoren, bereiken we routinematig een transductie-efficiëntie van &gt; 90% van Slc-hRMS met ecotroop virus, zoals weergegeven in Fig. 2A en 2B. Transductiesnelheden van HDFs zijn over het algemeen lager omdat de cellen niet met blasticidine zijn geselecteerd op receptor-expressie (Fig. 2C). Titers van ecotroop lentivirus zijn over het algemeen 10-20% van VSV-pseudotype virus wanneer gemeten op Slc-hRMS (Fig. 2D).
Eén vries-dooi-cyclus vermindert de titer van het ecotrope virus met 16 - 3%, wat gelijk is aan het titerverlies tijdens een enkele vries-dooi-cyclus van VSV-pseudotype virus (p &gt; 0,05). In tegenstelling tot eerdere rapporten,2 observeren wij geen positief effect op de virustiter door flash-freezing in droogijs. In plaats daarvan bereiken we hogere titers na het ontdooien van beide pseudotypes door de buisjes met virus simpelweg in een -80°C vriezer te plaatsen (gegevens niet getoond). 
De MTT-viabiliteitsassay maakt een gevoelige detectie van groeistop in doelcellen mogelijk. Transductie met virus plus concentraties CS/PB tot 800 μg/ml heeft geen effect op het metabolisme van HDF (Fig. 3A). Blootstelling aan CS/PB zonder virus heeft eveneens geen toxisch effect op de cellen (gegevens niet getoond). FACS-analyse van HDF's getransduceerd met virus plus verschillende concentraties CS/PB laat een verbetering van de transductie zien in vergelijking met PB alleen (Fig. 3B). De maximale verbetering treedt op bij 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), wat enkele malen lager is dan eerder gerapporteerde waarden.3 Daarom is het belangrijk om de omstandigheden te optimaliseren voor elk specifiek type doelcel.
Complexatie met CS/PB verhoogt de waargenomen titer ongeveer 3-voudig in Slc-hRMS (Fig. 4A, p &lt; 0,01). In de praktijk levert dit een groter effect op de transductie-efficiëntie op bij lage virusconcentraties dan bij hogere concentraties (Fig. 4B), wat zeer waarschijnlijk te wijten is aan meervoudig getransduceerde cellen en receptorverzadiging bij hogere virusconcentraties.
Transductie met ecotroop virus is specifiek voor cellen die de muis-retrovirusreceptor tot expressie brengen. Bij transductie van ongewijzigde menselijke cellen met ecotroop virus hebben we geen fluorescentie waargenomen die hoger was dan de niet-getransduceerde achtergrond, ongeacht of PB of CS/PB werd gebruikt, zoals weergegeven in Fig. 5A. Microscopisch gezien vertonen HDF's geen transductie in afwezigheid van de receptor (Fig. 5B), terwijl pre-transductie met de receptor resulteert in fluorescente cellen (Fig. 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Diagram van het lentivirusproductieproces, met weergave van de transductie van 293T-cellen en de stadia van het virale supernatant." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Schematisch overzicht van (A) het virusproductieproces en (B) transductie van menselijke cellen met een muis retrovirusreceptor, gevolgd door ecotroop lentivirus.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Flowcytometrie-grafieken, analyse van GFP+ celpercentage, fluorescentiemicroscopie, staafdiagram van virusitering." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Hoogefficiënte transductie van menselijke cellen met ecotroop lentivirus dat GFP codeert. Cellen waren vooraf getransduceerd met de murine retrovirusreceptor Slc7a1. (A) Menselijke rhabdomyosarcoma-cellijn blasticidine-geselecteerd voor Slc7a1 (Slc-hRMS), getransduceerd (blauw) of niet-getransduceerd (roze) met GFP. (B) Fluorescente micrografie van ecotroop-getransduceerde Slc-hRMS (4X). (C) HDF's getransduceerd (blauw) en niet-getransduceerd (roze) met ecotroop GFP-lentivirus; cellen waren twee dagen vóór de ecotroope transductie getransduceerd met Slc7a1. (D) Iter van VSV-G pseudotypeerd en ecotroop lentivirus, gemeten op Slc-hRMS.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Effecten van polymeerconcentratie op GFP-expressie; grafieken van absorbentie, flowcytometrie en GFP%." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3. Optimalisatie van chondroïtinesulfaat/polybrene (CS/PB) concentraties in humane dermale fibroblasten. (A) Viabiliteit van HDFs gemeten met een MTT-assay na transductie in de aanwezigheid van alleen PB of met variërende concentraties CS/PB. (B) Verbetering van de transductie-efficiëntie in HDFs door verschillende concentraties CS/PB, gemeten via FACS. (C) Kwantificering van de verbetering van de transductie, waaruit blijkt dat maximale transductie optreedt bij 100 μg/ml CS/PB.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Analyse van gentransductie-efficiëntie versus titer, staafdiagram en spreidingsdiagram, vergelijking van het polybrene-effect." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 4"> 
Figuur 4. Effect van 400 μg/ml CS/PB op de transductie van Slc-hRMS met ectotroop lentivirus. (A) Titerverbetering, en (B) factor van verandering in transductiesnelheid vergeleken met 6 μg/ml polybrene alleen.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Flowcytometrie GFP-intensiteitsgrafiek met fluorescentiemicroscopiebeelden die de verdeling van GFP+ cellen tonen." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 5"> 
Figuur 5. Gebrek aan ecotrope transductie van HDF's bij afwezigheid van de murine retrovirusreceptor Slc7a1. (A) FACS-plot van menselijke BJ-fibroblasten, niet-getransduceerd (roze) of getransduceerd (blauw) met ecotroop GFP-lentivirus, in beide gevallen in afwezigheid van receptor Slc7a1. Menselijke BJ-fibroblasten getransduceerd met ecotroop GFP-lentivirus, zonder (B) en met (C) pre-transductie met receptor Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
<li>Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-+to+large-scale+production+of+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Small- to large-scale production of lentivirus vectors.</a> Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).</li>
<li>Landazuri, N., LeDoux, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retroviruses+with+charged+polymers+enhances+gene+transfer+by+increasing+the+rate+that+viruses+are+delivered+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells.</a> J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).</li>
<li>Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).</li>
<li>Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EOS+lentiviral+vector+selection+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).</li>
<li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+nondividing+cells+using+pseudotyped+defective+high-titer+HIV+type+1+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+to+the+center+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Journey to the center of the cell.</a> Cell. 105, 697-700 (2001).</li>
<li>Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+tropism+of+lentiviral+vectors+through+pseudotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.</a> Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).</li>
<li>Schambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+murine+ecotropic+envelope%3A+increased+biosafety+and+convenience+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research.</a> Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).</li>
<li>Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+embryonic+stem+cells+by+ecotropic+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+a+novel+human+gene+homologous+to+the+murine+ecotropic+retroviral+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor.</a> Virology. 185, 10-17 (1991).</li>
<li>Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+preparation+and+concentration+of+retrovirus+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).</li>
<li>Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retrovirus+with+cationic+and+anionic+polymers+increases+the+efficiency+of+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
</ol>

Recombinant ecotropic gammaretrovirus gebaseerd op Moloney murine leukemia virus (MLV) en zijn receptor mSlc7a1 zijn goed bestudeerd en op grote schaal beschikbaar, die al meer dan 20 jaar transgenen te leveren aan muizen cellen. Ecotropic gammaretrovirus is ook meer recent gebruikt om oncogenen te leveren aan menselijke cellen,. In het kader van cellulaire herprogrammering, het gebruik van mSlc7a1 op generatie van amfotrope virus herbergen menselijke oncogenen te voorkomen is goed ingeburgerd maar 4,5, lentivirus biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van gammaretrovirus in transduceren vuurvaste celpopulaties, 6 inclusief primaire cellen die vaak gewenst zijn doelen voor herprogrammering, omdat de lentivirale pre-integratie complex maakt transductie van niet-delende cellen. 7 Lentivirussen zijn geproduceerd met tientallen verschillende pseudotypes, waaronder MLV, in een poging om virus tropisme, toxiciteit en andere eigenschappen. 8 MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus is gebruikt om muizen cellen, 9 transduceren maar is zelden gebruikt op menselijke cellen te veranderen 10. Daarom het gebruik van de MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus te stellen als een veilige, kosteneffectieve en zeer efficiënte voertuig bekend is of vermoed oncogenen, met inbegrip van cellulaire herprogrammering factoren, te leveren aan menselijke cellen. Het is van cruciaal belang op te merken dat dit protocol niet helemaal de noodzaak om te produceren en te gebruiken pantropic lentivirus te elimineren, maar eerder dit protocol scheidt het oncogen (s) van de pantropic virus, isolerende onderzoekers van potentiële self-inoculatie met kanker-gerelateerde virussen. Het eiwit mSlc7a1 en haar menselijke homoloog hSlc7a1 zijn alom uitgedrukt aminozuur transporteurs zonder bekende tumorgeniciteit of het vermogen om een selectieve groei voordeel op ontvangende cellen, waardoor 11 mSlc7a1 van een relatief laag risico voor opname in amfotrope virus. Deze extra stap kan met name nuttig zijn in laboratoria ontbreken gewijd virus of weefselkweek faciliteiten van het vereiste niveau van bioveiligheid. In sommige situaties kan het mogelijk zijn om volledig te elimineren van het gebruik van pantropic virus door het transfecteren van de Slc7a1 plasmide direct in doelcellen, maar veel cellen die nuttig zouden zijn doelwit van deze techniek zijn ook ongevoelig zijn voor transfectie. Als alternatief, de mogelijkheid om te isoleren Slc7a1-getransduceerde cellen door blasticidine selectie houdt in dat VSV-G pseudogetypeerde lentivirus kan eenmaal worden gebruikt om een ​​voorraad van receptor-expressie cellen, waarna ecotropic virus routinematig gebruikt kunnen worden om deze cellen transduceren voor velen te genereren experimenten. Onderzoekers moeten altijd volgen hun institutionele veiligheid van richtlijnen voor het werken met een lentivirus, ongeacht de tropisme. Titers van ecotropic virus bereikt met dit protocol zijn matig lager zijn dan VSV-virus pseudogetypeerde, over het algemeen 10-20% van de pantropic virus titer, in overeenstemming met eerdere studies. Negen Deze titers werden gemeten in menselijke cellen stabiel getransduceerd met Slc7a1, zodat de lagere waargenomen titer voor ecotropic virus kan gedeeltelijk te wijten aan verschillende expressie van de receptor-gen in target cellen. Niettemin, de virale titers bereikt in ons protocol zijn meer dan voldoende voor de meeste toepassingen en leiden tot transductie van de meerderheid van de cellen, in sommige gevallen&gt; 90% van de cellen. Centrifugatie-gebaseerde technieken worden vaak gebruikt om virale deeltjes concentreren. Echter, centrifugeren vereist verscheidene uren, genereert infectieuze aërosolen kunnen voortbrengen, en kan resulteren in een significant verlies van virale deeltjes. 12 Als een alternatief, complexatie met CS / PB kan worden gebruikt om transductie te verbeteren zonder dat virale tropisme. 3 Deze methode is snel (5 minuten ) en goedkoop ($ 0,03 per 10 ml virus), terwijl ongeveer een verdrievoudiging van de waargenomen titer. Geen speciale uitrusting of merkgebonden reagentia nodig zijn, en zagen we een minimale acute toxiciteit na blootstelling van HDFS aan CS / PB, in overeenstemming met eerder werk in andere cellijnen. 13 Een potentieel nadeel van dit protocol is dat een aantal microscopisch zichtbare polymeer complexen zich te houden aan de cellen voor meerdere dagen in de cultuur. We kunnen niet uitsluiten dat deze complexen, maar niet openlijk toxisch voor de cellen, kan meer subtiele effecten op cellulaire processen. Hier hebben we beschreven een methode voor het veilig en efficiënt transducerende menselijke cellen met oncogene factoren. Deze aanpak moet worden van groot nut voor onderzoekers bestuderen van oncogenen en stamcelbiologie inclusief iPS cellen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> Murine MLV receptor </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G envelop </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono lab 14 </td><td></td><td> Verpakking plasmide (equivalent plasmide psPax2 is verkrijgbaar bij Addgene, Cat. Number 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Ecotropic envelop </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFP controle plasmide </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimethrine bromide (polybreen) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> Chondroïtinesulfaat natriumzout van haaienkraakbeen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> Visser </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

transductie van menselijke cellen met polymer-gecomplexeerd ecotropic lentivirus voor enhanced biosafety

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem en tumor celbiologie studies vereisen vaak virale transductie van menselijke cellen met bekende of vermoedelijke oncogenen, het verhogen van de belangrijkste veiligheidsproblemen voor laboratorium personeel. Pantropic lentivirussen, zoals de veelgebruikte VSV-G pseudotype, zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van genen de functie omdat ze transduceren vele soorten cellen, waaronder niet-delende cellen. Echter, kunnen onderzoekers willen de productie en centrifugeren van pantropic virussen coderen oncogenen als gevolg van hogere bioveiligheidsniveau handling-eisen en veiligheid te voorkomen. Een aantal krachtige oncogenen, zoals c-Myc en SV40 grote T antigen, is bekend dat de productie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) te verbeteren. Alle andere bekende IPSC-inducerende genetische veranderingen (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, en p53 verlies van functie) hebben ook links naar kanker, waardoor ze van de relatief hoge veiligheid zorg ook. Hoewel deze kanker-gerelateerde virussen zijn nuttig in het bestuderen van cellulaire herprogrammering en pluripotentie, moeten ze veilig gebruikt worden. Om deze problemen bioveiligheid, demonstreren we een methode voor de transductie van menselijke cellen met ecotropic lentivirus, met extra nadruk op de lagere kosten en comfortabele bediening. Wij hebben ecotropic lentivirus met een voldoende hoge titer tot meer dan 90% van de transduceren receptor-expressie menselijke cellen blootgesteld aan het virus, het valideren van de effectiviteit van deze aanpak. Lentivirus wordt vaak geconcentreerd door ultracentrifugatie, maar dit proces duurt enkele uren en kunnen produceren aërosolen besmettelijk voor de mens biomedische onderzoekers. Als alternatief, virale deeltjes kunnen meer veilig gesedimenteerd op cellen door complexvorming met chondroïtine sulfaat en polybreen (CS / PB). Deze techniek verhoogt de functionele virale titer tot 3-voudig in cellen die stabiel uitdrukken muriene retrovirus receptor, met een verwaarloosbare extra tijd en kosten. Transductie van menselijke dermale fibroblasten (HDFS) is maximaal verbeterd met behulp van CS / PB concentraties van ongeveer 4-maal lager dan de optimale waarde die eerder gerapporteerd voor kanker cellijnen, wat suggereert dat polymeerconcentratie moet worden getitreerd voor het doel celtype van belang. Wij zijn dan ook beschrijven het gebruik van methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) voor het testen van toxiciteit voor het polymeer in een nieuwe cel type. We observeren equivalent leefbaarheid van HDFS na het virale transductie met behulp van polymeer complexering of de standaard dosis van polybreen (PB, 6 ug / ml), wat aangeeft een minimale acute toxiciteit. In dit protocol beschrijven we het gebruik van ecotropic lentivirus voor overexpressie van oncogenen in menselijke cellen, het verminderen van bioveiligheid risico&#39;s en het verhogen van de transductie tarief. We tonen ook aan het gebruik van polymeer complexatie aan transductie te verbeteren terwijl het vermijden van aërosolvormende centrifugeren van virale deeltjes.

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

Onderzoeken naar de biologie van stam- en tumorcellen vereisen vaak virale transductie van menselijke cellen met bekende of vermoedelijke oncogenen, wat aanzienlijke veiligheidskwesties oproept voor ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om oncogenen of andere potentieel gevaarlijke genen in menselijke cellen te introduceren met behulp van echotrope lentivirussen. Dit wordt bereikt door de productie van pantrope lentivirussen die de receptor voor het muisretrovirus coderen, evenals echotrope lentivirussen die het gen van belang coderen; de cellen worden getransduceerd met de receptor voor het muisretrovirus, waardoor ze vatbaar worden voor transductie met het echotrope virus. Vervolgens worden de cellen getransduceerd met het echotrope virus om het oncogen te introduceren, waarbij gebruik wordt gemaakt van polymeercomplexatie met polybrene en chondroïtinesulfaat om de transductie te verbeteren. De resultaten tonen selectieve transductie van menselijke cellen met het echotrope lentivirus aan op basis van fluorescentiemicroscopie en FACS.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gamma-retrovirale transductie, is dat lentivirale deeltjes vele celtypen effectiever kunnen transduceren, inclusief niet-delende cellen zoals stamcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van kanker- en stamcelonderzoek, zoals het begrijpen van de functie van potentiële oncogenen. Raadpleeg vóór aanvang van deze procedure de veiligheidsfunctionaris van uw instelling en volg de door hen aanbevolen veiligheidsrichtlijnen.Begin in een weefselkweekkast met een cultuur van gezonde, snelgroeiende 2 9 3 T-cellen. Resuspendeer onder aseptische omstandigheden 5 × 10⁶ 2 9 3 T-cellen in 10 ml antibioticumvrij 2 9 3 T-medium. Pipetteer de celsuspensie in een weefselkweekplaat van 10 cm en incubeer de plaat gedurende de nacht in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.Begin de volgende dag in de late namiddag met de transfectie. Verzamel eerst een aliquot Optum en de transferverpakkings- en envelopplasmiden en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur. Pipetteer 375 µL Optum in een microcentrifugebuisje en voeg vervolgens 25 µL FUgene HD transfectiereagens toe. Zorg ervoor dat het FUgene-reagens direct in het medium wordt gepipetteerd en niet tegen de wand van de buis komt aan.Combine vervolgens in een tweede microcentrifugebuis vijf microgram van het transferplasmid, 3,75 microgram van het packagingplasmid en 1,25 microgram van het envelopplasmid in de benodigde hoeveelheid Optum om het volume aan te vullen tot 100 microliter. Voeg daarna de Optum Fuji mixed toe aan de buis met het plasmidmengsel en incubeer dit gedurende 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur. Aspireer tijdens de laatste minuten van de incubatie zeer voorzichtig het medium uit de plaat met de 2 9 3 T cellen en vervang dit door 10 milliliter vers antibioticumvrij 2 9 3 T medium.Voeg ten slotte de FU-genplasmide-mix druppelgewijs toe aan het medium van de 10 centimeter plaat. Plaats de plaat in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2 en incubeer deze gedurende de nacht. Aspireer de volgende dag zeer voorzichtig het medium van de plaat en vervang dit door vers antibioticumvrij 2 9 3 T-medium.Plaats de plaat vervolgens terug in de weefselkweekincubator en incubeer deze nog twee dagen. Aspireer drie dagen na de transfectie het medium dat het virus bevat uit de plaat en filtreer dit met een 0,45 micron filter met lage eiwitbinding. Nadat het virus is gefiltreerd, worden seriële verdunningen van een fluorescent controlevirus gemaakt in vers antibioticumvrij medium met 6 µg/mL polybrene; gebruik deze verdunningen om cellen van de betreffende cellijn te transduceren. Vervang de volgende dag in een 24-wells plaat het medium door vers antibioticumvrij medium en zet de incubatie voort voor nog twee dagen om de cellen de tijd te geven het fluorescente eiwit tot expressie te brengen.Gebruik feiten om de fractie getransduceerde cellen voor elke virale verdunning te bepalen. Bereken vervolgens de titer in transformerende eenheden per milliliter op basis van verdunningen die minder dan 15%transductie opleveren om meervoudige transductiegebeurtenissen te minimaliseren. Er wordt aangenomen dat de titers van andere niet-fluorescerende lentivirussen die parallel zijn geproduceerd, vergelijkbaar zijn met die van het fluorescerende virus.Om doelcellen te transduceren, begint u met het selecteren van een multipliciteit van infectie van meer dan twee om te garanderen dat de meeste cellen worden getransduceerd. Verdun eerst het virale supernatant tot de vereiste multipliciteit van infectie in vers compleet kweekmedium. Vul dit aan met zes microgram per milliliter polybrene tot een eindvolume van één milliliter.Zuig het medium af uit een schaal van 35 millimeter met doelcellen en voeg één milliliter verdund viraal supernatant toe. Incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 24 tot 48 uur om indien gewenst voldoende expressie van de SLC7A1-receptor mogelijk te maken. Gebruik antibioticaselectie met blasticidine om stabiel getransduceerde cellen die SLC7A1 tot expressie brengen te selecteren, volgens de instructies in de schriftelijke procedure.Om te beginnen met de toxiciteitsbepaling, bereid een stamoplossing van 20 mg/mL chondroïtinesulfaat en een stamoplossing van 20 mg/mL poly-L-lysine in water en filter deze steriel. Overtollige stamoplossingen kunnen tot gebruik worden bewaard bij -20 °C.Bepaal vervolgens het aantal 96-wells celculturen dat nodig is om de toxiciteit van het polymeercomplex nauwkeurig vast te stellen. Met behulp van de MTT-assay moeten ten minste zes concentraties van chondroitinesulfaat en poly green in triplo worden getest. Daarnaast dienen ongereduceerde cellen en cellen die in serumvrij medium zijn gekweekt, te worden meegenomen.Medium moet worden toegevoegd om respectievelijk een basislijn voor gezonde cellen te bieden en om te controleren op groeistop. Zodra het aantal benodigde wells is vastgesteld, plaatst u 5.000 doelcellen in elke well van een 96-wells plaat en plaatst u parallel cellen in een 24-wells plaat voor microscopische of feitengebaseerde analyse van de transductie-efficiëntie in elke experimentele conditie; laat beide sets cellen een nacht groeien. Voeg de volgende dag een aliquot van de chondroïtinesulfaat-stamlopingsoplossing en een aliquot van de poly-L-lysine-stamlopingsoplossing toe.Verdun vervolgens het virus dat GFP codeert in antibioticumvrije media met zes microgram per milliliter poly L-lysine tot een multipliciteit van infectie die voldoende is om ongeveer 10 tot 50% van de doelcellen per putje te transduceren. Zorg dat er voldoende verdund virus is voor elke testconditie plus de controleputjes op elke plaat. Label een set buisjes met elke te testen concentratie chondroïtinesulfaat en poly l-lysine polymeer. Verdeel vervolgens voldoende van de virale suspensie in drievoud voor elke conditie over de buisjes. Pipetteer daarna het vereiste volume chondroïtinesulfaat en poly brain-stoomoplossing om de testconcentraties in elk van de buisjes na elkaar te bereiken. Tik direct na de toevoeging van chondroïtinesulfaat en poly green tegen de buis om te mengen.Laat de mengsels van virus, chondroïtinesulfaat en poly green vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Het mengsel kan troebel worden naarmate er virale precipitaties worden gevormd. Aspireer na de incubatie het medium uit de wells van de 96-well plaat.Voeg vervolgens het virus-chondroïtinesulfaat-poly green-mengsel toe aan de wells zoals gepland. Pipetteer daarnaast de controle en het serumvrije medium in de overeenkomstige wells. Herhaal dit proces voor de 24-wellsplaat en incubeer deze gedurende de nacht in de weefselkweekincubator.Aspire vervolgens het virusbevattende medium uit de platen en vervang dit door vers medium. Plaats de platen terug in de incubator voor 48 uur. Verwijder na 48 uur de 24-well plaat en gebruik facts om de transductie-efficiëntie van elke chondroïtinsulfaat- en polybrain-concentratie te analyseren.De volgende dag. Aspireer het medium uit alle wells van de 96-wells plaat en vervang dit door 100 µL MTT-oplossing; cultiveer gedurende drie uur in een bevochtigde incubator zodat MTT gereduceerd kan worden in de mitochondriën van metabolisch actieve cellen. Aspireer na drie uur de MTT-oplossing en vervang deze door 200 µL oplosmiddeloplossing.Incubeer de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur of totdat al het paarse MTT is gevormd en het precipitaat is opgelost. Meet de absorptie op een microplaatlezer bij 570 nanometer, waarbij de achtergrondmeting bij 690 nanometer wordt afgetrokken. De optimale polymeerconcentratie zal een maximale verbetering van de transductie opleveren, bepaald door feiten, met een minimaal effect op de metabole activiteit, bepaald door MTT voor hdfs.100 µg/mL chondroïtinesulfaat. Poly brain is de optimale polymeerconcentratie zoals bepaald met deze methode. Bereid eerst voldoende mengsel van 100 µg/mL chondroïtinesulfaat poly green viraal supernatant voor om het benodigde aantal 35 millimeter schalen met SLC7A1-receptor-expresserende HDF-cellen te transduceren. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten om de vorming van polymeercomplexen mogelijk te maken.Aspireer vervolgens het medium van de receptor-expresserende doelcellen en vervang dit door het virale mengsel; incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder daarna het virale mengsel. Was het celoppervlak tweemaal met PBS om te helpen bij het verwijderen van virale complexen. Volledige verwijdering is niet noodzakelijk, aangezien er geen nadelige effecten op de celgezondheid zijn waargenomen door residuele polymeercomplexen.Deze fluorescentiemicroscopie-afbeelding illustreert een voldoende transductie van menselijke sarcomacellen, die SLC7A1 stabiel tot expressie brengen, met tropisch virus bij gebruik van fluorescente controlevectoren om de transductie-efficiëntie te monitoren. Kwantificering van de fluorescentie middels FACS-analyse toont een transductie-efficiëntie van meer dan 90% aan. Transductiesnelheden van HDFS zijn over het algemeen lager omdat de cellen niet zijn geselecteerd op receptor-expressie; titers van atropisch lentivirus zijn doorgaans 10 tot 20% van het VSV-pseudotype virus gemeten op S-L-C-H-S-C. De MTT-viabiliteitsassay maakt een gevoelige detectie van groeistop in doelcellen mogelijk, zoals hier te zien is bij transductie met virus plus concentraties chondroïtinesulfaat.Poly-L-lysine tot 800 µg/mL heeft geen effect op het metabolisme van HDF. Fax-analyse van HDF's getransduceerd met virus plus diverse concentraties chondroïtinesulfaat. Poly-L-lysine vertoont een verbetering van de transducering in vergelijking met poly-L-lysine alleen.Maximale versterking treedt op bij 100 µg/mL. Chondroïtinesulfaatpoly is verschillende malen lager dan eerder gerapporteerde waarden. Daarom is het belangrijk om de condities voor complexatie met chondroïtinesulfaat voor elk specifiek celtype te optimaliseren.Poly brain verhoogt de waargenomen titer, ongeveer drievoudig in S-L-C-H-S-C. In de praktijk resulteert dit in een groter effect op de transductie-efficiëntie bij lage virusconcentraties dan bij hogere concentraties, wat zeer waarschijnlijk te wijten is aan meerdere getransduceerde cellen en receptorverzadiging bij hogere virusconcentraties. Transductie met tropisch virus is specifiek voor cellen die de neuron retrovirusreceptor tot expressie brengen.Bij het transduceren van ongemodificeerde menselijke cellen met tropisch virus is er geen fluorescentie waargenomen die groter is dan de ongereduceerde achtergrond, zoals gezien bij faxanalyse microscopisch. HDFS vertonen geen transductie bij afwezigheid van de receptor, terwijl voorafgaande transductie met de receptor resulteert in fluorescerende cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te verifiëren dat het virus geen transductie zal veroorzaken in ongemodificeerde menselijke cellen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe tropisch lentivirus kan worden gebruikt om potentieel gevaarlijke genen af te leveren in menselijke cellen, inclusief het gebruik van polymeercomplexatie om de transductie te verbeteren.

transduction-human-cells-with-polymer-complexed-ecotropic-lentivirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentivirale expressievectoren zijn het meest effectief voertuigen stabiel tot expressie verschillende effector-moleculen of reporter-constructen in delende en niet-delende zoogdiercellen en hele organismen. Hier bieden we een protocol over hoe lentivector expressie constructen te verpakken in pseudoviral deeltjes en target cellen met behulp van de pseudoviral deeltjes transduceren.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

RNA-interferentie (RNAi) beschikt over een groot aantal voordelen ten opzichte van gen knock-out en is in brede kring gebruikt als een instrument in gen functionele studies. De uitvinding van DNA-vector-gebaseerde RNAi-technologie heeft op lange termijn en induceerbaar gen knockdown mogelijk, en verhoogde ook de haalbaarheid van gene...

DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

We beschrijven een werkwijze voor genetisch primaire humane T cellen te veranderen met een transgen via de...

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

Hier maken we gebruik van retrovirale transductie en concatemere transfectie van een cellijn die de componenten van een lentivirale vector (LV) in de afwezigheid van tetracycline kan uitdrukken. Dit LV GFP codeert en gepseudotypeerd met een glycoproteïne, SVGmu, dat specifiek is voor een receptor op dendritische cellen.

Een tetracycline-gereguleerde Cell Line Produceert hoge titer lentivirale vectoren die specifiek zijn gericht op dendritische cellen

Werk met besmettelijke virussen Ebola is beperkt tot de bioveiligheid niveau 4 laboratoria. Tetracistronic-minigenoom met replicatie en transcriptie-bevoegde virusachtige deeltjes (trVLPs) vertegenwoordigen een levenscyclus modeling systeem dat ons in staat stelt om veilig te modelleren meerdere besmettelijke cycli onder bioveiligheid niveau 2 voorwaarden, die uitsluitend op Ebola-virus componenten.

Het modelleren van de levenscyclus van Ebola Virus onder Biosafety Level 2 Voorwaarden met het virus-achtige deeltjes die Tetracistronic minigenomen

Primaire humane bronchiale epitheelcellen zijn moeilijk te transduceren. Dit protocol beschrijft de productie van lentivirussen en hun concentratie, evenals de optimale kweekcondities die nodig zijn om zeer efficiënte transductionen in deze cellen te bereiken tijdens differentiatie naar een pseudostratified epitheel.

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

Hier beschrijven we een methode voor celgebaseerde visualisatie, subcellulaire lokalisatie en kwantitatieve analyse van poly(ADP-ribose) (PAR) verrijkte foci in vaste zoogdiercellen. Deze test maakt het mogelijk om plaatsen te kwantificeren van door DNA-schade veroorzaakte PARP-activatie, inclusief die geassocieerd met basenexcisieherstel of enkelstrengbreukreparatie, in de kernen van aan genotoxine blootgestelde cellen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van door genotoxine geïnduceerde PARP1/PARP2-activatie in cellen met behulp van een op fluorescent fusie eiwit gebaseerde reporter

Leer hoe je veilig oncogenen in menselijke cellen introduceert met ecotroop lentivirus en polymercomplexatie. Deze methode verhoogt transductie-efficiëntie en minimaliseert risico's voor kankeronderzoek.

Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

Meer video's verkennen