Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

Het algemene doel van het volgende experiment is om oncogenen of andere potentieel gevaarlijke genen in menselijke cellen te introduceren met behulp van echotrope lentivirussen. Dit wordt bereikt door de productie van pantrope lentivirussen die de receptor voor het muisretrovirus coderen, evenals echotrope lentivirussen die het gen van belang coderen; de cellen worden getransduceerd met de receptor voor het muisretrovirus, waardoor ze vatbaar worden voor transductie met het echotrope virus. Vervolgens worden de cellen getransduceerd met het echotrope virus om het oncogen te introduceren, waarbij gebruik wordt gemaakt van polymeercomplexatie met polybrene en chondroïtinesulfaat om de transductie te verbeteren. De resultaten tonen selectieve transductie van menselijke cellen met het echotrope lentivirus aan op basis van fluorescentiemicroscopie en FACS.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gamma-retrovirale transductie, is dat lentivirale deeltjes vele celtypen effectiever kunnen transduceren, inclusief niet-delende cellen zoals stamcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van kanker- en stamcelonderzoek, zoals het begrijpen van de functie van potentiële oncogenen. Raadpleeg vóór aanvang van deze procedure de veiligheidsfunctionaris van uw instelling en volg de door hen aanbevolen veiligheidsrichtlijnen.

Begin in een weefselkweekkast met een cultuur van gezonde, snelgroeiende 2 9 3 T-cellen. Resuspendeer onder aseptische omstandigheden 5 × 10⁶ 2 9 3 T-cellen in 10 ml antibioticumvrij 2 9 3 T-medium. Pipetteer de celsuspensie in een weefselkweekplaat van 10 cm en incubeer de plaat gedurende de nacht in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2.

Begin de volgende dag in de late namiddag met de transfectie. Verzamel eerst een aliquot Optum en de transferverpakkings- en envelopplasmiden en laat deze opwarmen tot kamertemperatuur. Pipetteer 375 µL Optum in een microcentrifugebuisje en voeg vervolgens 25 µL FUgene HD transfectiereagens toe. Zorg ervoor dat het FUgene-reagens direct in het medium wordt gepipetteerd en niet tegen de wand van de buis komt aan.

Combine vervolgens in een tweede microcentrifugebuis vijf microgram van het transferplasmid, 3,75 microgram van het packagingplasmid en 1,25 microgram van het envelopplasmid in de benodigde hoeveelheid Optum om het volume aan te vullen tot 100 microliter. Voeg daarna de Optum Fuji mixed toe aan de buis met het plasmidmengsel en incubeer dit gedurende 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur. Aspireer tijdens de laatste minuten van de incubatie zeer voorzichtig het medium uit de plaat met de 2 9 3 T cellen en vervang dit door 10 milliliter vers antibioticumvrij 2 9 3 T medium.

Voeg ten slotte de FU-genplasmide-mix druppelgewijs toe aan het medium van de 10 centimeter plaat. Plaats de plaat in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2 en incubeer deze gedurende de nacht. Aspireer de volgende dag zeer voorzichtig het medium van de plaat en vervang dit door vers antibioticumvrij 2 9 3 T-medium.

Plaats de plaat vervolgens terug in de weefselkweekincubator en incubeer deze nog twee dagen. Aspireer drie dagen na de transfectie het medium dat het virus bevat uit de plaat en filtreer dit met een 0,45 micron filter met lage eiwitbinding. Nadat het virus is gefiltreerd, worden seriële verdunningen van een fluorescent controlevirus gemaakt in vers antibioticumvrij medium met 6 µg/mL polybrene; gebruik deze verdunningen om cellen van de betreffende cellijn te transduceren. Vervang de volgende dag in een 24-wells plaat het medium door vers antibioticumvrij medium en zet de incubatie voort voor nog twee dagen om de cellen de tijd te geven het fluorescente eiwit tot expressie te brengen.

Gebruik feiten om de fractie getransduceerde cellen voor elke virale verdunning te bepalen. Bereken vervolgens de titer in transformerende eenheden per milliliter op basis van verdunningen die minder dan 15%transductie opleveren om meervoudige transductiegebeurtenissen te minimaliseren. Er wordt aangenomen dat de titers van andere niet-fluorescerende lentivirussen die parallel zijn geproduceerd, vergelijkbaar zijn met die van het fluorescerende virus.

Om doelcellen te transduceren, begint u met het selecteren van een multipliciteit van infectie van meer dan twee om te garanderen dat de meeste cellen worden getransduceerd. Verdun eerst het virale supernatant tot de vereiste multipliciteit van infectie in vers compleet kweekmedium. Vul dit aan met zes microgram per milliliter polybrene tot een eindvolume van één milliliter.

Zuig het medium af uit een schaal van 35 millimeter met doelcellen en voeg één milliliter verdund viraal supernatant toe. Incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 24 tot 48 uur om indien gewenst voldoende expressie van de SLC7A1-receptor mogelijk te maken. Gebruik antibioticaselectie met blasticidine om stabiel getransduceerde cellen die SLC7A1 tot expressie brengen te selecteren, volgens de instructies in de schriftelijke procedure.

Om te beginnen met de toxiciteitsbepaling, bereid een stamoplossing van 20 mg/mL chondroïtinesulfaat en een stamoplossing van 20 mg/mL poly-L-lysine in water en filter deze steriel. Overtollige stamoplossingen kunnen tot gebruik worden bewaard bij -20 °C.

Bepaal vervolgens het aantal 96-wells celculturen dat nodig is om de toxiciteit van het polymeercomplex nauwkeurig vast te stellen. Met behulp van de MTT-assay moeten ten minste zes concentraties van chondroitinesulfaat en poly green in triplo worden getest. Daarnaast dienen ongereduceerde cellen en cellen die in serumvrij medium zijn gekweekt, te worden meegenomen.

Medium moet worden toegevoegd om respectievelijk een basislijn voor gezonde cellen te bieden en om te controleren op groeistop. Zodra het aantal benodigde wells is vastgesteld, plaatst u 5.000 doelcellen in elke well van een 96-wells plaat en plaatst u parallel cellen in een 24-wells plaat voor microscopische of feitengebaseerde analyse van de transductie-efficiëntie in elke experimentele conditie; laat beide sets cellen een nacht groeien. Voeg de volgende dag een aliquot van de chondroïtinesulfaat-stamlopingsoplossing en een aliquot van de poly-L-lysine-stamlopingsoplossing toe.

Verdun vervolgens het virus dat GFP codeert in antibioticumvrije media met zes microgram per milliliter poly L-lysine tot een multipliciteit van infectie die voldoende is om ongeveer 10 tot 50% van de doelcellen per putje te transduceren. Zorg dat er voldoende verdund virus is voor elke testconditie plus de controleputjes op elke plaat. Label een set buisjes met elke te testen concentratie chondroïtinesulfaat en poly l-lysine polymeer.

Verdeel vervolgens voldoende van de virale suspensie in drievoud voor elke conditie over de buisjes. Pipetteer daarna het vereiste volume chondroïtinesulfaat en poly brain-stoomoplossing om de testconcentraties in elk van de buisjes na elkaar te bereiken. Tik direct na de toevoeging van chondroïtinesulfaat en poly green tegen de buis om te mengen.

Laat de mengsels van virus, chondroïtinesulfaat en poly green vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur. Het mengsel kan troebel worden naarmate er virale precipitaties worden gevormd. Aspireer na de incubatie het medium uit de wells van de 96-well plaat.

Voeg vervolgens het virus-chondroïtinesulfaat-poly green-mengsel toe aan de wells zoals gepland. Pipetteer daarnaast de controle en het serumvrije medium in de overeenkomstige wells. Herhaal dit proces voor de 24-wellsplaat en incubeer deze gedurende de nacht in de weefselkweekincubator.

Aspire vervolgens het virusbevattende medium uit de platen en vervang dit door vers medium. Plaats de platen terug in de incubator voor 48 uur. Verwijder na 48 uur de 24-well plaat en gebruik facts om de transductie-efficiëntie van elke chondroïtinsulfaat- en polybrain-concentratie te analyseren.

De volgende dag. Aspireer het medium uit alle wells van de 96-wells plaat en vervang dit door 100 µL MTT-oplossing; cultiveer gedurende drie uur in een bevochtigde incubator zodat MTT gereduceerd kan worden in de mitochondriën van metabolisch actieve cellen. Aspireer na drie uur de MTT-oplossing en vervang deze door 200 µL oplosmiddeloplossing.

Incubeer de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur of totdat al het paarse MTT is gevormd en het precipitaat is opgelost. Meet de absorptie op een microplaatlezer bij 570 nanometer, waarbij de achtergrondmeting bij 690 nanometer wordt afgetrokken. De optimale polymeerconcentratie zal een maximale verbetering van de transductie opleveren, bepaald door feiten, met een minimaal effect op de metabole activiteit, bepaald door MTT voor hdfs.

100 µg/mL chondroïtinesulfaat. Poly brain is de optimale polymeerconcentratie zoals bepaald met deze methode. Bereid eerst voldoende mengsel van 100 µg/mL chondroïtinesulfaat poly green viraal supernatant voor om het benodigde aantal 35 millimeter schalen met SLC7A1-receptor-expresserende HDF-cellen te transduceren. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten om de vorming van polymeercomplexen mogelijk te maken.

Aspireer vervolgens het medium van de receptor-expresserende doelcellen en vervang dit door het virale mengsel; incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Verwijder daarna het virale mengsel. Was het celoppervlak tweemaal met PBS om te helpen bij het verwijderen van virale complexen. Volledige verwijdering is niet noodzakelijk, aangezien er geen nadelige effecten op de celgezondheid zijn waargenomen door residuele polymeercomplexen.

Deze fluorescentiemicroscopie-afbeelding illustreert een voldoende transductie van menselijke sarcomacellen, die SLC7A1 stabiel tot expressie brengen, met tropisch virus bij gebruik van fluorescente controlevectoren om de transductie-efficiëntie te monitoren. Kwantificering van de fluorescentie middels FACS-analyse toont een transductie-efficiëntie van meer dan 90% aan. Transductiesnelheden van HDFS zijn over het algemeen lager omdat de cellen niet zijn geselecteerd op receptor-expressie; titers van atropisch lentivirus zijn doorgaans 10 tot 20% van het VSV-pseudotype virus gemeten op S-L-C-H-S-C. De MTT-viabiliteitsassay maakt een gevoelige detectie van groeistop in doelcellen mogelijk, zoals hier te zien is bij transductie met virus plus concentraties chondroïtinesulfaat.

Poly-L-lysine tot 800 µg/mL heeft geen effect op het metabolisme van HDF. Fax-analyse van HDF's getransduceerd met virus plus diverse concentraties chondroïtinesulfaat. Poly-L-lysine vertoont een verbetering van de transducering in vergelijking met poly-L-lysine alleen.

Maximale versterking treedt op bij 100 µg/mL. Chondroïtinesulfaatpoly is verschillende malen lager dan eerder gerapporteerde waarden. Daarom is het belangrijk om de condities voor complexatie met chondroïtinesulfaat voor elk specifiek celtype te optimaliseren.

Poly brain verhoogt de waargenomen titer, ongeveer drievoudig in S-L-C-H-S-C. In de praktijk resulteert dit in een groter effect op de transductie-efficiëntie bij lage virusconcentraties dan bij hogere concentraties, wat zeer waarschijnlijk te wijten is aan meerdere getransduceerde cellen en receptorverzadiging bij hogere virusconcentraties. Transductie met tropisch virus is specifiek voor cellen die de neuron retrovirusreceptor tot expressie brengen.

Bij het transduceren van ongemodificeerde menselijke cellen met tropisch virus is er geen fluorescentie waargenomen die groter is dan de ongereduceerde achtergrond, zoals gezien bij faxanalyse microscopisch. HDFS vertonen geen transductie bij afwezigheid van de receptor, terwijl voorafgaande transductie met de receptor resulteert in fluorescerende cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te verifiëren dat het virus geen transductie zal veroorzaken in ongemodificeerde menselijke cellen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe tropisch lentivirus kan worden gebruikt om potentieel gevaarlijke genen af te leveren in menselijke cellen, inclusief het gebruik van polymeercomplexatie om de transductie te verbeteren.