Evaluatie van de ontwikkeling van de borstklier en functie in muismodellen

Het algemene doel van deze procedure is om de ontwikkeling van de melkklieren bij wild-type en mutante muizen te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst een muis te dissekeren om de melkklieren bloot te leggen. Vervolgens worden de melkklieren zorgvuldig geoogst en uitgespreid op glazen objectglazen, calm lum.

Vervolgens wordt kleuring gebruikt om de mate van epitheelontwikkeling te analyseren. Ten slotte wordt een analyse uitgevoerd van de myo-epitheliale contracties na blootstelling aan oxytocine, INEA J. Uiteindelijk zullen de verkregen resultaten onthullen of de melkkliergangen en de alveoli correct zijn gevormd, en of het myo-epitheel kan worden gestimuleerd om samen te trekken en melk uit te stoten na blootstelling aan oxytocine. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot de ontwikkeling en differentiatie van de melkklier, zoals de impact van een genmutatie of knockout op de morfologie en functie van de melkklier.

Een visuele demonstratie van deze methode garandeert een correcte dissectie van de melkkliert, aangezien zowel de montage in het gat als de oxytocine-gebaseerde assay goed geprepareerde melkklierten vereisen. Een gebrekkige dissectie van de klier kan leiden tot de afwezigheid van sommige epitheliale gangen of de aanwezigheid van vreemd weefsel, zoals huid- of spierweefsel. Bereid ten minste één dag vóór de dissectie een CalMin-aluminiumoplossing door één gram CalMin en 2,5 gram aluminiumkaliumsulfaat op te lossen in 500 milliliter gedistilleerd water.

Kook de oplossing 20 minuten in een kolf van één liter en vul het uiteindelijke volume aan tot 500 milliliters met water. Filtreer de oplossing door een watman-filterpapier en voeg enkele korrels thiol toe als conserveermiddel. Koel de oplossing vervolgens af na het kleuren.

Koolstofalumoplossing kan worden teruggegoten in de voorraadfles en gedurende meerdere weken vele malen worden hergebruikt. Maak een nieuwe oplossing wanneer de kleur vervaagt. Om te beginnen met de dissectie van de geheugenklier, moet een muis worden geofferd via koolstofdioxide-inhalatie.

Vermijd cervicale dislocatie indien mogelijk, aangezien dit grote bloedvaten in de nek kan beschadigen en kan leiden tot bloedophoping rond de melkklier, waardoor de dissectie op in folie gewikkeld polystyreenfoam bemoeilijkt wordt. Plaats de muis op zijn rug en spreid de vier ledematen.

Zet alle vier de ledematen stevig vast met naalden van 16 tot 20 gauge. Bespuit de muis ruim met 70% ethanol met behulp van een pincet. Trek de abdominale huid in de middenlijn omhoog en maak met een scherpe schaar een kleine incisie vanaf het beginpunt van de insnijding.

Snijd de huid open tot aan de nek van het dier, waarbij u voorkomt dat de abdominale of thoracale holtes worden doorboord. Snijd de huid op de voorpoten door tot aan de midline-incisie, zodat er een Y-vorm ontstaat. Snijd de huid op de achterpoten op dezelfde wijze open.

Gebruik hemostatische klemmen. Pel indien nodig voorzichtig de abdominale en thoracale huid van de muis opzij. Snijd voorzichtig het bindweefsel door.

Bevestig de huid aan het polystyreenschuim met naalden van maat 16 tot 20, waarbij de melkklieren die aan de onderzijde van de huid vastzitten, worden blootgelegd. Disseceer telkens één klier met een pincet. Til de betreffende melkklier voorzichtig op en knip tussen de klier en de huid met kleine scherpe scharen, beginnend vanaf de buitenkant in de richting van de ruggengraat van het dier.

Zorg ervoor dat u voorzichtig snijdt, zodat er geen stukjes huid of spier op de klier achterblijven. Alle melkklieren kunnen met dit protocol worden verwijderd, maar de abdominale melkklieren nummer vier zijn het meest geschikt voor hele mounts. Nadat de melkklier uit de muis is weggesneden, spreidt u deze direct uit op een glazen objectglas.

Probeer het zo plat mogelijk te drukken. Door de oorspronkelijke vorm in situ te behouden, zal de klier goed op het objectglas hechten. Wanneer de klier in een zuurkast correct is uitgerekt, kan deze worden gefixeerd door het objectglas in een pot met carnoise te dompelen.

Fixeer gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Alternatief kan de klier overnacht worden gefixeerd bij vier graden Celsius. Was het weefsel vervolgens 15 minuten in 70% ethanol.

Rehydrateeer het vervolgens geleidelijk in water door de helft van de ethanoloplossing uit de pot te verwijderen en deze te vervangen door dubbel gedestilleerd water. Incubeer gedurende vijf minuten. Herhaal dit drie keer, spoel vervolgens met gedestilleerd water gedurende vijf minuten.

Kleur de klier vervolgens gedurende één nacht bij kamertemperatuur in koolstofalum. Verwijder de volgende dag de koolstofalumkleuring om deze opnieuw te gebruiken en dehydrateer het gekleurde weefsel geleidelijk door middel van opeenvolgende ethanolbaden van vijf minuten elk. Maak het weefsel vervolgens gedurende één nacht transparant in xyleen. Na het transparant maken wordt de melkklier ondergedompeld in methylsalicylaat, waarbij het methylsalicylaat in een zuurkast blijft staan totdat de beelden kunnen worden vastgelegd. De ontwikkeling van de melkklier kan worden gekwantificeerd door het aantal vertakkingen of zijtakken langs delen van de gangen te tellen, of er kan een beoordeling worden gemaakt van de lengte van de primaire gangen of de verhouding tussen het epitheel- en het vetweefselareaal.

Een tweede assay om de ontwikkeling en functie van de melkklier te evalueren, houdt in dat de klier wordt blootgesteld aan oxytocine en de melkuitscheiding in de epitheliale kanalen wordt beoordeeld. Om deze assay uit te voeren, moeten vers gevoede jongen worden gespind van de moeder en moet de moeder gedurende één uur in isolatie worden gehouden. Offer daarna de moeder op en leg de melkklieren vrij zoals beschreven voor de dissectie van de melkklier.

Laat ze echter in het dier zitten. Begin de analyse door met een transferpipet drie tot vijf milliliter PBS of de oxytocine-oplossing gelijkmatig direct op de betreffende melkklier te druppelen. Voor deze procedure wordt aanbevolen om de thoracale klieren te gebruiken, waarbij één zijde als controle dient en de andere zijde wordt gebruikt om de melkuitstroom te testen.

Incubeer de klieren gedurende één minuut en verwijder de oplossingen door ze voorzichtig af te zuigen met een transferpipet. Monitor de melkinstroom in de ducten via een video-opname of door afbeeldingen te maken vóór en na blootstelling aan PBS of oxytocine. Hier zijn voorbeelden van muisgeheugen. Whole mounts van de klier waarbij het epitheel van de ducten door pijlen wordt aangegeven en de lymfeknoop, gemarkeerd door een pijlspunt, gemakkelijk waarneembaar zijn in een mooi uitgespreide gehele mammaire klier.

Een slecht uitgespreide melkklier kan loslaten van het preparaatglas en inklappen, waardoor deze onbruikbaar wordt. Een onjuist geëxciteerde melkklier kan delen missen of stukjes spier- of huidweefsel bevatten. Oxytocine-geïnduceerde melkuitscheiding kan worden waargenomen in het epitheel van eenden na blootstelling aan oxytocine.

Echter, als de melkgangen aan het begin van de assay al gevuld zijn met melk door een ongepast lange latentieperiode na het laatste zogen van de pups, is verdere accumulatie van melk in de gangen na oxytocine-blootstelling moeilijk waarneembaar. Omgekeerd zal een korte latentieperiode na het zogen van de pups voorkomen dat er voldoende melk in de alveoli accumuleert om na oxytocine-blootstelling in de gangen correct waargenomen te kunnen worden na dissectie van de melklijkieren. In plaats van het monteren van hele organen of het beoordelen van de door oxytocine geïnduceerde melkuitstoot, kunnen de melkklieren worden ingevroren, cryosectie worden ondergaan en immunolabeling worden uitgevoerd voor een willekeurig aantal aanwezige eiwitten in de melkklieren.

Als alternatief kunnen de klieren worden gelyseerd en voorbereid voor western blotting. Samen maakten deze twee beoordelingen het mogelijk om fundamentele vragen met betrekking tot de ontwikkeling, differentiatie en functie van de klieren te beantwoorden in diverse muismodellen die zijn ontwikkeld om specifieke sleutelgenen te missen of arbor-genmutaties te vertonen.