Name: Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer een snelle diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare rRT-PCR en gevriesdroogde reagentia in het veld. Deze methode maakt testen op de vanglocatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen M. en R. Scullion Crisp van Idaho Technologies bedanken voor technische ondersteuning en het USGS West-Ecologisch Research Center voor de financiering van (S. Schwarzbach) en bijstand (K. Spragens, T. Graham). Dit onderzoek werd uitgevoerd onder auspiciën van het Centrum voor Innovatieve technologie - Instituut voor Defensie en Binnenlandse Veiligheid (www.idhs.org), ter ondersteuning van het ministerie van Defensie en Air Force Research Laboratory. Dieren omgaan gevolgd protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de US Geological Survey West-Ecologisch Research Center en maakt van de US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Elk gebruik van de handel, product of bedrijf namen in deze publicatie is voor beschrijvende doeleinden en impliceert geen goedkeuring door de Amerikaanse overheid.

1. Wilde vogels te vangen met behulp van mistnetten <ol><li> Voor shorebird vast te leggen, dat is opgericht mistnetten op een actieve foerageergebied site zoals een moeras, kustlijn, of modder plat. </li><li> Schuif schakelnetten lijn lussen van het ene uiteinde van de mist net rond de paal en verticaal steek stok in de modder. </li><li> Strek net, steek seconden stok door schakelnetten lussen aan de andere kant van de mist net als verticaal stok in te voegen in modder, zorg ervoor dat de schakels lijnen worden onderwezen. </li><li> Zodra een vogel is gevangen, extract van de vogel uit het net en terugkeren naar de banding station. </li></ol> 2. Cloaca swab bemonstering <ol><li> Verzamel cloacaswabs onmiddellijk na de vangst </li><li> Zoek de cloaca en het gebruik van de vingertoppen terug te dringen omliggende veren </li><li> Pak een steriel Dacron-of polyester-tip swab, stengel eind eerste, en maak de tip met een steriele virale vervoersmiddel voor meer gemak in zwabberen. Na het bevochtigen, is het hele hoofd van het wattenstaafje voorzichtig ingebracht in de cloaca. Wattenstaafje de binnenkant omtrek van de cloaca door langzaam twirling het wattenstaafje en verwijder de swab uit cloaca. </li><li> Het plaatsen van het staafje tip direct in de virale transport media monsterflesje, draai de swab as tussen duim en wijsvinger, terwijl het staafje wordt in de media. Heb je een assistent de procedure te voltooien door te trekken de punt van het staafje terug van de bodem van de flacon ~ 1 cm en snijd de as van het staafje met een schaar, zodat het staafje tip blijft in de flacon en de as niet interfereert met cap sluiting. Cap flacon stevig vast. Desinfecteer de schaar met alcohol in tussen het snijden wattenstaafje assen. </li><li> Plaats de vaatjes in een diepvries doos met zowel droog ijs of ijs packs. </li></ol> 3. Orofaryngeale wattenstaafje bemonstering <ol start="1"><li> Open voorzichtig de vogel snavel, zodat de choanal spleet zichtbaar is </li><li> Pak een schoon wattenstaafje uit de verpakking, stam eind eerste, en maak de tip met virale vervoersmiddel voor meer gemak in zwabberen </li><li> Zonder het aanraken van de tip op een andere oppervlakken, plaatst u deze in de mond en veeg de choanal opening op het dak van de mond en gaan terug naar de orofaryngeale of de keel regio </li><li> Plaats het wattenstaafje tip direct in de virale transport media flacon. Draai het staafje as tussen duim en wijsvinger, terwijl het staafje wordt in de media. Zoals hierboven, hebben een assistent het uiteinde van het staafje terug te trekken uit de bodem van de flacon ~ 1 cm en snijd de as van het staafje met een schaar, zodat het staafje tip blijft in de flacon en de as niet interfereert met dop sluiting. Cap flacon stevig vast. Desinfecteer de schaar met alcohol in tussen het snijden wattenstaafje assen. </li><li> Plaats de vaatjes in een diepvries doos met droog ijs of ijs packs. </li></ol> 4. Bird handling en laat <ol start="1"><li> Keer terug vogel op de site van vast te leggen en laat tijdig (&lt;20 minuten). Handlers moeten zich bewust zijn van de beginselen van het welzijn van dieren en wees alert op tekenen van vogels lijden tijdens de bemonstering (dat wil zeggen schaafwonden, vast te leggen myopathie en hypo-of hyperthermie). Een basis EHBO-kit moet worden opgenomen in de apparatuur lijst. </li></ol> 5. Testfaciliteiten <ol start="1"><li> Monsters kunnen worden getest in een afgesloten ruimte, zoals een onderzoeks-caravan of tent, met een voeding (voltage-gereguleerde stroom generator) van de PCR-toestel en aangesloten computer draaien. </li></ol> 6. RNA-extractie <ol start="1"><li> RNA extractie werd uitgevoerd met de RNeasy Mini kit met kleine aanpassingen de instructies van de fabrikant volgende Spackman et al. 1. </li><li> Vortex het wattenstaafje medium voor 3-5 s en overdracht 350 ul van een 2 ml microcentrifugebuis. Let op: Houd rest monster op ijs in geval PCR-positieve monsters moeten worden rescreened of H5 test moet worden uitgevoerd. </li><li> Voeg 350 ul van RLT buffer (met β-me) en vortex voor 5 s. </li><li> Voeg 350 ul van RNA graad 70% ethanol. </li><li> Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 600 ul van de supernatant een spin kolom geplaatst in een 2 ml collectie buis. Behoudt het resterende monster in reageerbuis rek. </li><li> Centrifugeer gedurende 20 s bij 10.000 xg en gooi flow-through. </li><li> Herhaal de stappen 17-18 tot alle monster is gepasseerd door spin kolom. </li><li> Plaats spin-kolom in een schone 2 ml collectie buis. </li><li> Voeg 700 ul van RW1 buffer om de spin kolom en centrifugeer 25 s bij 10.000 x g. Gooi de flow-through. </li><li> Voeg 500 ul RPE buffer om de spin kolom en centrifugeer gedurende 25 s bij 10.000 x g. Gooi de flow-through. </li><li> Herhaal stap 22 voor een totaal van twee wassen met RPE buffer. </li><li> Centrifugeer de spin kolom voor een extra 2 minuten bij 14.000 x g. Gooi collectie buis. </li><li> Plaats de spin kolom in een schoon 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 50μl van nuclease-vrij water. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 s. </li><li> Elueer RNA door het draaien van voor 60 s bij 10.000 xgfof 60 s. Plaats gezuiverd monster op ijs. </li></ol> 7. Voorbereiden negatieve controles <ol start="1"><li> Gevriesdroogde reagentia werden gereedgemaakt voor gebruik in de PCR-test volgens de instructies van de Idaho Technologies Freeze-Dried Reagens Detection Kit voor TaqMan probes Influenza A Target 1 (Asay-ASY-0109). </li><li> Centrifuge negatieve controle reagens flesje (rood) voor 3 s om ervoor te zorgen pellets zijn aan de onderkant. </li><li> Verwijder de dop, visueel zorg ervoor dat pellets zijn aan de onderkant. </li><li> Voeg 20 ul van 2 X Reconstitutie Buffer en 20 ul Reagens Grade Water. </li><li> Samenvatting en vortex gedurende 5 s op maximale snelheid. </li><li> Centrifuge voor 3 s te brengen vloeistof naar onderkant van de flacon. </li><li> Controleer visueel de pellet heeft gerehydrateerd, zo niet herhaal dan de stappen 31-32. </li><li> Pipetteer 19 ul van het gehydrateerde mengsel in een LightCycler capillair, herhaalt pipet stap in een tweede capillair om een ​​duplicaat te verkrijgen. </li></ol> 8. Voorbereiden van monsters voor de beproeving <ol start="1"><li> Centrifugeer het onbekende serum flacon (blauw) voor 3 sec om ervoor te zorgen pellets zijn aan de onderkant. </li><li> Verwijder de dop, visueel zorg ervoor dat pellets zijn aan de onderkant. </li><li> Voeg 40 ul van RNA gezuiverd. </li><li> Samenvatting en vortex gedurende 5 s op maximale snelheid. </li><li> Centrifuge voor 3 s te brengen vloeistof naar onderkant van de flacon. </li><li> Controleer visueel de pellet heeft gerehydrateerd, zo niet herhaal dan de stappen 38-39. </li><li> Pipetteer 19 ul van gehydrateerd mengsel in een LightCycler capillair, herhaalt pipet stap in een tweede capillair om een ​​duplicaat te verkrijgen. </li></ol> 9. Voorbereiden positieve controles <ol start="1"><li> Centrifugeer de positieve controle reagens flesje (groen) voor 3 s om ervoor te zorgen pellets zijn aan de onderkant. </li><li> Verwijder de dop, visueel zorg ervoor dat pellets zijn aan de onderkant. </li><li> Voeg 20 ul van 2 X Reconstitutie Buffer en 20 ul Reagens Grade Water. </li><li> Samenvatting en vortex gedurende 5 s op maximale snelheid. </li><li> Centrifuge voor 3 s te brengen vloeistof naar onderkant van de flacon. </li><li> Controleer visueel de pellet heeft gerehydrateerd, zo niet herhaal dan de stappen 45-46. </li><li> Pipetteer 19 ul van het gehydrateerde mengsel in een LightCycler capillair, herhaalt pipet stap in een tweede capillair om een ​​duplicaat te verkrijgen. </li></ol> 10. Centrifugeren het capillair <ol start="1"><li> Wanneer alle van de capillaire buizen voor de partij zijn voorbereid laden ze in de mini-centrifuge voorzien van capillaire adapters. </li><li> Centrifugeer op de laagste stand van de pols houden ingedrukt voor een s. Deze transfers vloeistof naar de bodem als voorbereiding voor het testen. </li></ol> 11. Bediening van de RAPID <ol start="1"><li> Maak een nieuw bestand. Label positieve controle, negatieve controle, en de monsters (door hun ID-nummer). </li><li> Programma 1: RNA Monstervoorbereiding Hold <ol><li> Cycli = 1 </li><li> Analyse Mode = Geen </li><li> Doel Temperatuur = 40 </li><li> Incubatie tijd = 30 min. </li><li> Temperatuur Transition Rate = 20 ° C / s (standaard) </li><li> Secundaire Temperatuur Target = 0 (standaard) </li><li> Stap Size = 0 (standaard) </li><li> Stap Delay = 0 (standaard) </li><li> Acquisitie Mode = Geen (standaard) </li></ol></li><li> Programma 2: RNA Denaturatie <ol><li> Cycli = 1 </li><li> Analyse Mode = Geen </li><li> Doel Temperatuur = 94 </li><li> Incubatietijd = 120s </li><li> Temperatuur Transition Rate = 20 ° C / s (standaard) </li><li> Secundaire Temperatuur Target = 0 (standaard) </li><li> Stap Size = 0 (standaard) </li><li> Stap Delay = 0 (standaard) </li><li> Acquisitie Mode = Geen (standaard) </li></ol></li><li> Programma 3: RNA Amplification <ol><li> Cycli = 45 </li><li> Analyse Mode = Auto Analyse </li><li> Gewenste temperatuur, Segment 1 = 94; Segment 2 = 60 </li><li> Incubatietijd, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s </li><li> Temperatuur Transition Rate, Seg 1 &amp; 2 = 20 ° C / s (standaard) </li><li> Secundaire Temperatuur Target, Seg 1 &amp; 2 = 0 (standaard) </li><li> Stapgrootte, Seg 1 &amp; 2 = 0 (standaard) </li><li> Stap Delay, Seg 1 &amp; 2 = 0 (standaard) </li><li> Acquisitie Mode, Segment 1 = Geen; Segment 2 = single </li></ol></li><li> Fluorescentie Parameters <ol><li> Display Mode: fluorescentie kanaal 2 (CH2 / 1) Winsten: <ol><li> Ch 1 (F1) = 1 </li><li> Ch 2 (F2) = 8 </li><li> Ch 3 (F3) = 1 </li></ol></li><li> Als u de real-time fluorescentie data voor elk monster, selecteert u de steekproef van belang en klik op de 'Show Graph' knop aan de onderkant van het scherm </li></ol></li><li> Voor elke capillair, de resultaten omvatten het volgende: <ul><li> # - Identificeert de carrousel positie van de carrousel </li><li> Sample naam - geeft de naam van het monster </li><li> Control - identificeert het monster type voor elk monster </li><li> Score - berekend op basis van de relatie tussen fluorescentie van het monster en het niveau van de achtergrond fluorescentie in het monster </li><li> Resultaat - geeft het totale resultaat voor het monster </li></ul></li></ol> 12. Representatieve resultaten: Aanwezig: 'aanwezig' Een rode oproep voor een test / onbekende monster geeft aan dat het doel was die in dat monster en de controles waren succesvol. Niet gedetecteerd: Een groene 'niet herkend' oproep voor een test / onbekende monster geeft aan dat de doelstelling niet werd geïdentificeerd in dat monster en de test controles waren succesvol. Herhaal: Een 'kunt u herhalen' geeft aan dat de positieve of negatieve controle mislukt. Een voorbeeld van een succesvolle analyse van de RAPID 7200 is weergegeven in Figuur 4. De positieve controle wordt versterkt en genereert detecteerbare fluorescentie (y-as) bij ongeveer 25 cycli (x-as). Een cyclus drempel (CT)&gt; 35 is de overeengekomen cut-off voor de meeste AIV referentielaboratoria. Daarom is de positieve controle voor deze methode leverde een fluorescent signaal binnen de geaccepteerde aantal cycli (0-35) voor de AIV detectie. In tegenstelling, is de negatieve controle niet het genereren van een fluorescent signaal, zelfs na 45 cycli. Evenzo heeft de twaalf monsters uit West-strandlopers niet het genereren van een fluorescent signaal dat aangeeft dat de vogels negatief waren voor AIV. Follow-up testen van alle positieve monsters in een traditioneel laboratorium is aangemoedigd ervoor te zorgen dat er geen valse positieven ten onrechte worden geproduceerd. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig1.jpg" alt="Figuur 1"> Figuur 1. Shorebird vast te leggen met behulp van mistnetten. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig2.jpg" alt="Figuur 2"> Figuur 2. Inzameling van cloacaswabs en orofaryngeale monsters uit de minst strandlopers. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig3.jpg" alt="Figuur 3"> Figuur 3. Programmeren van de RAPID 7200 voor RNA-amplificatie. <img src="files/ftp_upload/2829/2829fig4.jpg" alt="Figuur 4"> Figuur 4. Fluorogram gegenereerd door de RAPID 7200 portable RRT-PCR laten zien hoe positieve en negatieve controles zou moeten verschijnen in een succesvolle test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2829/2829fig4large.jpg">Klik hier om de volledige grootte te bekijken</a>

<ol><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li>
<li>Takekawa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+detection+of+avian+influenza+virus+in+wild+birds%3A+evaluation+of+a+portable+rRT-PCR+system+and+freeze-dried+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents.</a> J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).</li>
<li>Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+internal+positive+control+for+rapid+diagnosis+of+avian+influenza+virus+infections+by+real-time+reverse+transcription-PCR+with+lyophilized+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents.</a> J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).</li>
<li>Spackman, E., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+virus+RNA+extraction+from+tissue+and+swab+material%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material.</a> Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).</li>
<li>Chen, R., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+inter-species+transmission+and+geographic+subdivision+in+avian+influenza+viruses+from+wild+birds.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology.</a> , 383-3156 (2009).</li>
<li>Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+turnover+by+reassortment+of+replication+complex+genes+from+avian+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus.</a> J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).</li>
<li>Dugan, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+genetics+and+emergence+of+avian+influenza+viruses+in+wild+birds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog.%22%5BJournal%5D)">The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds.</a> PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).</li>
<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analyses+of+type+A+influenza+genes+in+natural+reservoir+species+in+North+America+reveals+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation.</a> Virus Res. 114, 89-100 (2005).</li>
<li>Pasick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+molecular+based+techniques+for+the+diagnosis+and+characterization+of+avian+influenza+virus+infections.%5BTitle%5D)+AND+%22Transbound+Emerg+Dis%22%5BJournal%5D)">Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections.</a> Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OIE+Manual+of+diagnostics+tests+and+vaccines+for+terrestrial+animals+%28mammals%2C+birds+and+bees%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees).</a> 1, 258-269 (2004).</li>
<li>Weber, T. P., Stilianakis, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecologic+immunology+of+avian+influenza+%28H5N1%29+in+migratory+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).</li>
<li>Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ducks%3A+the+%22Trojan+Horses%22+of+H5N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+and+Other+Respiratory+Viruses%22%5BJournal%5D)">Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).</li>
<li>Gilbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flying+over+an+infected+landscape%3A+distribution+of+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+risk+in+South+Asia+and+satellite+tracking+of+wild+waterfowl%5BTitle%5D)+AND+%22Ecohealth%22%5BJournal%5D)">Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl.</a> Ecohealth. , (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methode van een snelle diagnose hier gepresenteerde maakt tijd-efficiënte en nauwkeurige testen van wilde vogels monsters voor bewaking van de AIV. De veel minder strenge exemplaar opslag eisen van draagbare RRT-PCR zijn geschikt voor het op afstand situaties waarin het onderhoud van een &#39;cold chain&#39; kan onpraktisch als vloeibare stikstof verladers of droog ijs is niet beschikbaar. Daarnaast vonden we dat monster-analyse met gevriesdroogde reagentia was eenvoudig genoeg om te worden uitgevoerd door veldbiolog...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> RNeasy mini spin-kolom </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inbegrepen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Collectie tubes (1,5 en 2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inbegrepen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Buffer RLT </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inbegrepen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Buffer RW1 </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inbegrepen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> Buffer RPE </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inbegrepen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> RNase-vrij water </td><td> Qiagen </td><td> 74106 </td><td> Inbegrepen in RNeasy Mini Kit </td></tr><tr><td> 14,3 M β-mercapto-ethanol-oplossing </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP176100 </td><td></td></tr><tr><td> 100% ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9602322 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie 2, 120V </td><td> Wetenschappelijke Industries </td><td> SI-0236 </td><td></td></tr><tr><td> Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolyse Probe) </td><td> Idaho Technologies </td><td> Asay-ASY-0109 </td><td></td></tr><tr><td> LightCycler 20ml capillairen </td><td> Roche Applied Science </td><td> 04929292001 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-centrifuge met rotator voor 2 ml buizen </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Inbegrepen in RAPID kit </td></tr><tr><td> Ruggedized Geavanceerd Pathogeen Identification Device (RAPID) 7200 </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Inbegrepen in RAPID kit </td></tr><tr><td> Pentium-laptop met Windows XP Professional </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Inbegrepen in RAPID kit </td></tr><tr><td> LightCycler data analyse software </td><td> Idaho Technologies </td><td></td><td> Inbegrepen in RAPID kit </td></tr></tbody></table>

een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: het gebruik van een portable rrt-pcr en gevriesdroogd reagentia in het veld

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wilde vogels zijn betrokken bij de verspreiding van hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) van het H5N1 subtype, wordt gevraagd het toezicht langs trekkende vliegroutes. Bemonstering van wilde vogels voor aviaire influenza virus (AIV) is vaak uitgevoerd in afgelegen gebieden, maar de resultaten zijn vaak vertraagd vanwege de noodzaak om monsters te vervoeren naar een laboratorium ingericht voor moleculaire testen. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RRT-PCR) is een moleculaire techniek die een van de meest nauwkeurige en gevoelige methoden voor de diagnose van AIV biedt. De eerder strenge laboratorium protocollen die nodig is voor RRT-PCR worden nu aangepast voor het veld. Ontwikkeling van gevriesdroogd (gelyofiliseerd) reagentia die geen &#39;cold chain&#39;, met gevoeligheid bij het niveau van de natte reagentia heeft gebracht on-site testen op afstand tot een praktisch doel. Hier presenteren we een methode voor de snelle diagnose van de AIV bij wilde vogels met behulp van een RRT-PCR-eenheid (Ruggedized Uitgebreid Pathogeen Identification Device of RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) dat gevriesdroogd reagentia werken (Influenza A Target een Taqman; Asay -ASY-0109, Idaho Technologies). De reagentia bevatten alle noodzakelijke componenten voor het testen op geschikte concentraties in een enkele buis: primers, probes, enzymen, buffers en interne positieve controles, waardoor fouten in verband met onjuiste opslag of overslag van natte reagentia. De draagbare eenheid voert een scherm voor het Influenza A door zich te richten de matrix-gen en levert resultaten binnen 2-3 uur. Genetische subtypering is ook mogelijk met H5 en H7 primer sets die gericht zijn op de hemagglutinine-gen. Het systeem is geschikt voor gebruik op cloaca-en orofaryngeale monsters van wilde vogels, zoals hier gedemonstreerd op de trekkende shorebird soort, de westelijke oeverloper (Calidrus Mauri), gevangen in Noord-Californië. Dieren omgaan gevolgd protocollen zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de US Geological Survey West-Ecologisch Research Center en maakt van de US Geological Survey Bird Banding Laboratory. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is te versnellen diagnose van wilde vogels, het vergroten van de kans op een uitbraak op een externe locatie. On-site diagnose zou ook nuttig voor het identificeren en bestuderen van geïnfecteerde individuen in wilde populaties. De mogelijkheid om informatie op de host biologie (immunologische en fysiologische reactie op infectie) en ruimtelijke ecologie (trek de prestaties van geïnfecteerde vogels) te verzamelen geeft inzicht in de mate waarin de wilde vogels kan fungeren als vectoren voor AIV over lange afstanden.

Deze studie beschrijft diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare RRT-PCR-systeem. De methode maakt gebruik van gevriesdroogde reagentia om het scherm wilde vogels in een niet-laboratorium setting, typisch voor een uitbraak scenario. Het gebruik van moleculaire technieken biedt nauwkeurige en gevoelige alternatieven voor een snelle diagnose.

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld

Wilde vogels zijn betrokken bij de verspreiding van hoogpathogene aviaire influenza (HPAI) van het subtype H5N1, wat heeft geleid tot surveillance langs migratie...

Het algemene doel van deze procedure is om wilde vogels op het moment van vangst te testen op het aviair influenza virus of een IV, wat vaak gebeurt in afgelegen veldomstandigheden, ver verwijderd van laboratoriumfaciliteiten. Dit wordt bereikt door eerst wilde vogels te vangen met de techniek van mistnetten, gevolgd door de tijdige afname van cloacale en orofaryngeale monsters. Na verplaatsing naar een besloten ruimte wordt RNA uit de virale transportmedia geëxtraheerd met behulp van de RNZ Minikit; de preparatie van positieve en negatieve controles, evenals de testmonsters, wordt vervolgens uitgevoerd met gelyofiliseerde reagentia, gevolgd door de overdracht van de monsters naar microcapillaire buisjes.De laatste stap van de procedure is het amplificeren van viraal RNA uit positieve monsters met behulp van een draagbaar real-time PCR-apparaat, genaamd het Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device of Rapid. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de aanwezigheid van een IV en wilde vogels aantonen binnen 24 uur na de monstername in het veld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken in een diagnostisch laboratorium is d

rapid-diagnosis-avian-influenza-virus-wild-birds-use-portable-rrt-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.

ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza

Een methode om te bewaren, op te sporen en de volgorde RNA virussen van aviaire influenza werd gevalideerd en uitgebreid met behulp van natuurlijke fecesmonsters van vogels. Deze techniek verwijdert de noodzaak van het handhaven van een koelketen en behandeling van besmettelijke virussen en kan worden toegepast in een 96-wells high-throughput setup.

Aviaire Influenza Surveillance met FTA Kaarten: Field Methods, bioveiligheid, en transport problemen opgelost

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

This video demonstrates a quantitative method for detecting viral infection using real-time reverse transcription PCR. The reverse transcription step converts the RNA to cDNA, which is then amplified via PCR cycles. The presence of viral RNA in the sample is confirmed by analyzing the amplification and dissociation curves of DNA obtained from the PCR.

Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR for Diagnosing Viral Infections

Bevruchte kippeneieren worden veel gebruikt om grote hoeveelheden humaan influenza A-virus te produceren, omdat ze een handig en kosteneffectief systeem bieden om hoge opbrengsten van het virus te bewijzen.

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

De auteurs presenteren een protocol om varkens neusdoekjes te verzamelen voor het detecteren en isoleren van influenza A-virussen.

Nasale Doekjes voor het influenza A-virus detectie en isolatie van Varkens

We beschrijven een snelle, moleculair-gebaseerde Influenza A en B assay. De Influenza test detecteert elk doel binnen 15 minuten door het gebruik van isotherme amplificatie met influenza-specifieke primers, gevolgd door detectie van targets met moleculaire beacon sondes. De Influenza A en B test is gebruiksvriendelijk en vereist een minimale hands-on tijd om te presteren.

Snelle Moleculaire detectie en differentiatie influenzavirussen A en B

High-throughput testen van DNA en RNA gebaseerde pathogenen op nanoschaal PCR wordt omschreven met een syndromale honden en paarden luchtwegen PCR panel.

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Een snel-inzetbare, off-grid laboratorium is ontworpen en gebouwd voor externe, beperkt resource-globale instellingen. De functies en de kritieke aspecten van de modules van de logistiek-enhanced, uitbreidbaar, multifunctionele laboratorium worden onderzocht. Een checklist voor een basic Labor werkstroom en een protocol voor een respiratoire virale diagnostische test zijn ontwikkeld en gepresenteerd.

Externe Laboratoriumbeheer: Respiratoir Virus diagnostiek

We presenteren een compleet protocol voor postmortem diagnose van dierlijke hondsdolheid onder veldomstandigheden met behulp van een snelle immunochromatografische diagnostische test (RIDT), van hersenbiopsie bemonstering tot uiteindelijke interpretatie. We beschrijven ook verdere toepassingen met behulp van het apparaat voor moleculaire analyse en virale genotypering.

Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromagrafische Diagnostische Test voor Resource-Limited Settings met verdere moleculaire toepassingen

Leer een snelle diagnose van aviaire influenza bij wilde vogels met behulp van een draagbare rRT-PCR en gevriesdroogde reagentia in het veld. Deze methode maakt testen op de vanglocatie mogelijk.

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld (Video) | JoVE Journal

Een snelle diagnose van aviaire influenza virus bij wilde vogels: Het gebruik van een Portable RRT-PCR en gevriesdroogd reagentia in het veld

Meer video's verkennen