Sequencing van Bacteriële Microflora in het perifere bloed: onze ervaring met HIV-geïnfecteerde patiënten

Sequencing van bacteriële microflora die transloceert in perifeer bloed. Op basis van onze ervaring met hiv-geïnfecteerde patiënten — ik ben junior Marti en ik werk als universitair docent bij de Kliniek voor Infectieziekten en Tropische Geneeskunde aan de Universiteit van Milaan in Italië — zullen we u nu experimenten laten zien over hoe bacteriële DNA uit perifeer bloed van hiv-geïnfecteerde patiënten kan worden gedetecteerd en gesequenced.

Het gezonde maag-darmstelsel wordt gekoloniseerd door een grote verscheidenheid aan commensale microben die de ontwikkeling van het humorale en cellulaire immuunsysteem beïnvloeden. De microbiota wordt afgeschermd van het immuunsysteem via een sterke mucosale barrière; na verschillende klinische aandoeningen, zoals infecties, antibioticabehandeling, postoperatieve complicaties, alsook bij patiënten met een carcinoom, pancreatitis en malnutritie, treedt er een verandering in het maag-darmstelsel op.

HIV-infectie veroorzaakt een doorbraak van de gastro-intestinale barrière met progressief falen van de mucosale immuniteit en lekkage van bacteriële bioproducten, zoals lipopolysacharide en bacteriële DNA-fragmenten, naar de systemische circulatie, wat bijdraagt aan systemische immuunactivatie; hierin worden de experimentele fasen van de detectie en sequencing van bacterieel DNA gedemonstreerd. Aanwezig in het perifere bloed van HIV-geïnfecteerde patiënten zullen zijn Camilla ti, een fellow infectieziekten, Esther, me, een PhD-student en ju MariaI, een postdoctoral fellow, allen verbonden aan de kliniek voor Infectieziekten en Tropische Geneeskunde aan de Universiteit van Milaan. Ons experiment heeft als doel het identificeren van bacteriële soorten in perifere bloedmonsters van HIV-geïnfecteerde patiënten.

We zullen volbloed gebruiken van zowel HIV-geïnfecteerde als gezonde proefpersonen, aangezien gezonde individuen een normale intestinale homeostase vertonen. We verwachten geen translocerende microflora te zien bij deze patiënten. Volbloed zal worden afgenomen van de patiënten, gevolgd door plasmascheiding.

Vervolgens zal DNA worden geëxtraheerd om een breed-spectrum PCR-reactie uit te voeren voor het 16 s ribosomale gen van PCIC. Na de PCR zal productzuivering, klonering en sequentieanalyse worden uitgevoerd. De eerste stap van ons experiment is bloedafname via venapunctie, gevolgd door plasmascheiding.

Er wordt ongeveer 9 ml volbloed afgenomen in buizen met EDTA. De buizen worden in een centrifuge geplaatst bij 2000 RPM gedurende 10 minuten. Centrifugatie bij kamertemperatuur maakt de scheiding van plasma mogelijk.

Het DNA zal nu worden geëxtraheerd uit onze plasmaproeven. Desinfecteer de zuurkast, pipetten en het benodigde materiaal voor het experiment adequaat om steriliteit te garanderen; plaats al het materiaal gedurende ten minste 30 minuten onder UV-lampen. Schakel de UV-lampen uit, veeg de handschoenen af met een desinfectiemiddel, week enkele papieren handdoeken in ethanol en plaats deze in de zuurkast zodat elke weggegooide tip hierin kan worden gelegd. Veeg de pipet tijdens de DNA-extractieprocedure af aan de natte papieren handdoeken.

U bent nu klaar voor de DNA-extractie. DNA wordt geëxtraheerd met behulp van een commerciële kit, volgens de instructies van de fabrikant. Kort samengevat worden 350 µL plasma in een Eppendorf-buisje van 2 ml geplaatst.

Ultrazuiver water wordt gebruikt als negatieve controle. 10 µL lysosoom bij een eindconcentratie van 1 mg/mL wordt aan de monsters toegevoegd. De monsters worden vervolgens 30 minuten geïncubeerd.

Na centrifugatie worden bij 37 °C oplossing A, chloroform en oplossing B aan de monsters toegevoegd volgens de instructies. Er verschijnen drie aparte fasen. Het supernatant wordt verzameld en toegevoegd aan ethanol, waardoor DNA neerslaat; de DNA-concentratie wordt vervolgens bepaald met een spectrofotometer.

De volgende stap is een breed-spectrum PCR-reactie voor de amplificatie van het PRIC 16 s ribosomaal gen; de PCR wordt uitgevoerd in een speciale ruimte. Een PCR-mix wordt samengesteld met behulp van deze reagentia. De PCR-mix wordt 30 minuten gecentrifugeerd bij 500 G bij vier graden Celsius om mogelijke contaminatie door bacteriële Taq-polymerase te voorkomen.

Het PCR-mengsel wordt vervolgens verdeeld in aliquoten, afhankelijk van het aantal monsters dat geamplificeerd moet worden. Houd hierbij rekening met aliquoten voor negatieve en positieve reactiecontroles.

De THERMOCYCLING wordt geprogrammeerd onder de volgende condities: 94 °C gedurende vijf minuten; 94 °C, 55 °C en 72 °C gedurende één minuut voor 40 cycli, en 72 °C gedurende 10 minuten. De gemiddelde duur is drie uur.

PCR-producten worden gevisualiseerd op een 2% AGROS-gel. Dit is een 2% AGROS-gel waarop PCR-producten te zien zijn. De eerste baan bevat een ladder van 100 basenparen.

De tweede baan is een positieve PCR-controle. De derde baan bevat een negatieve PCR-controle. De vierde baan toont monsters van een hiv-positieve patiënt en de vijfde baan bevat een waterbaan.

Zes toont monsters van een gezond individu en een negatieve PCR-reactie. Baan zeven bevat water. PCR-verificatie is de volgende stap.

PCR-producten worden gezuiverd met behulp van een commerciële kit, volgens de instructies van de fabrikant. Voor deze stap worden diverse kolommen met filters gebruikt. De PCR-resultaten worden genoteerd op een werkblad.

We gaan nu verder met kloneren middels blue-white screening. Dit is een moleculaire techniek waarmee kan worden vastgesteld of DNA succesvol in een vector is geligeerd. De vector wordt vervolgens getransformeerd in competente bacteriële cellen.

De competente cellen worden gekweekt in de aanwezigheid van xal. Als de ligatie succesvol is, zal de bacteriële kolonie wit zijn. Zo niet, dan zal de kolonie blauw zijn.

X-gal wordt gebruikt om aan te geven of een cel het enzym bèta-galactosidase tot expressie brengt en om de transformatie van E. coli-kolonies te visualiseren; IPTG induceert de expressie van bèta-galactosidase. X-gal en IPTG worden over platen met ampicilline verspreid door middel van draaien. Een kloneringsmengsel bestaande uit PCR-producten, SALT en een kloneringsvector wordt bereid volgens de instructies van de fabrikant.

E coli-cellen worden op ijs geplaatst. Vervolgens wordt het kloneermengsel aan de cellen toegevoegd, waarna de cellen na een thermische shock op platen gedurende de nacht worden geïncubeerd bij 37 °C. Na de incubatie ontstaan er witte en blauwe kolonies op de platen.

Witte kolonies zijn positief voor PCR-producten. Invoeging en blauwe kolonies zijn negatief voor de invoeging van het PCR-product. Er worden 10 witte kolonies en één blauwe kolonie geselecteerd.

Elke kolonie wordt geplaatst in 2 mL vloeibaar LB-groeimedium met toevoeging van ampicilline. De kolonies worden overnacht geïncubeerd bij 37 °C. Na incubatie worden de overnacht gegroeide kolonies gebruikt voor plasmidextractie met een commerciële mini-prep kit.

Minikolommen met filters worden gebruikt voor deze stap. Na de plasmidextractie worden de plasmiden gevisualiseerd op een 0,7% agarosegel. Dit is een 0,7% agarosegel waarop miniprep-producten te zien zijn. De eerste baan bevat een ladder van één kilobase.

De tweede baan bevat de blauwe controlekolonie. Banen drie tot en met 12 bevatten witte kolonies. De resultaten worden genoteerd op een werkblad; de volgende stap is sequencing, waarna de plasmiden worden geamplificeerd.

Er wordt een mengsel gemaakt met behulp van deze reagentia. Het PCR-mengsel wordt verdeeld in aliquoten op basis van het aantal monsters dat geamplificeerd moet worden. De thermocyclus wordt geprogrammeerd volgens de volgende condities: 96 °C gedurende één minuut, 96 °C gedurende 10 seconden, 50 °C gedurende vijf seconden en 60 °C gedurende vier minuten.

Gedurende 25 cycli. De gemiddelde duur is ongeveer één uur. Na amplificatie worden de PCR-producten gezuiverd met behulp van kolommen met filters.

Gezuiverde producten worden op een plaat geladen, die vervolgens in een sequencer wordt geplaatst. Zodra een sequentie is verkregen, wordt deze via BLAST geanalyseerd en worden de bacteriële soorten van elke kolonie geïdentificeerd. Kolonies die een sequentiehomologie van 98% tot 100% vertonen, worden als positief beschouwd.

Dit is een voorbeeld van bacteriële sequencing in plasma van één hiv-positief individu. Onze resultaten laten zien dat microbiële translocatie bij hiv-ziekte een polymicrobiële flora omvat. We hebben hiermee aangetoond dat hiv-geïnfecteerde patiënten een hoge polymicrobiële microflora vertonen in de systemische circulatie.

Bacterieel DNA in perifeer bloed lag onder de detectielimiet voor onze HIV-negatieve gezonde personen, wat mogelijk de integriteit van het maag-darmkanaal weerspiegelt. Ons onderzoek is nu gericht op het begrijpen en onderzoeken van de mogelijke rol van microflora in perifeer bloed bij de conditionering, HIV-immunopathogenese en mogelijk de respons op therapie.