Name: Sequencing van Bacteriële Microflora in het perifere bloed: onze ervaring met HIV-geïnfecteerde patiënten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Leer sequencing-analyse van bacteriële DNA in perifeer bloed bij HIV-geïnfecteerde patiënten. Deze methode identificeert translocerende microflora en hun relatie met immuunresponsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar Gianni Scimone voor een uitstekende hulp bij het maken van video.

Het hanteren van hiv-besmet bloed monsters vereist een aantal belangrijke aanbevelingen. Alle exemplaren van het bloed moet worden vervoerd in stevige lekvrije containers. Zorg moet worden genomen bij het verzamelen van het monster om verontreiniging van de buitenkant van de container en van alle papierwerk bij het monster te voorkomen. Alle personen die de verwerking van besmet bloed moeten handschoenen dragen. Handschoenen moeten worden gewijzigd en de handen gewassen na voltooiing van het monster verwerking. Verwerking van HIV-besmet bloed monsters moeten worden gedaan in een klasse II biohazard kast kap. Mechanische Pipetteerhulpen moet worden gebruikt. Het gebruik van naalden of andere scherpe voorwerpen (inclusief glas bijvoorbeeld pipetten of capillaire buizen) moet worden beperkt tot situaties waarin er geen alternatief is. Laboratorium oppervlakken, moet gereinigd worden met een geschikte chemische desinfecterende na een lekkage van bloed en wanneer werkzaamheden zijn voltooid. Gebruikte verontreinigde materialen, moet gereinigd worden voor hergebruik of moet worden afgevoerd via de juiste klinische afval route. Ieder incident van beroepsmatige blootstelling aan potentieel besmettelijke bloed of vocht (dat wil zeggen, degenen die universele voorzorgsmaatregelen) moeten worden behandeld als een medisch noodgeval als interventies moet onmiddellijk worden begonnen om effectief te zijn. Het protocol vereist dat 5 dagen voor de voltooiing ervan. De termijn is gedetailleerd in figuur 1. Bacteriesoorten worden geïdentificeerd met behulp van de methoden beschreven in figuur 2. 1. Monstername <ol><li> 9 ml bloed is getrokken in EDTA met buizen. </li><li> Buizen worden gecentrifugeerd bij 2000 rpm gedurende 10 minuten bij RT aan plasma te verkrijgen. </li><li> Plasma wordt opgevangen in een steriele 2 ml Eppendorf-buis. </li></ol> 2. DNA-extractie van plasmamonsters <ol><li> Adequaat te desinfecteren kap, pipetten en materialen die nodig zijn voor het experiment, om steriliteit te garanderen. </li><li> Plaats alle materialen onder UV-licht voor ten minste 30 minuten. </li><li> Veeg handschoenen met een desinfecterend middel. </li><li> Geniet van een paar papieren handdoekjes in ethanol en leg ze onder de motorkap. Iedere keer dat een tip is weggegooid veeg de pipet op de natte papieren handdoeken. </li></ol> DNA wordt geëxtraheerd met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol start="5"><li> 350 pi van plasma worden geplaatst in een steriele 2ml eppendorfbuisje. </li><li> 350 pi van ultrapuur water gefilterd worden gebruikt als negatieve controle. </li><li> Voeg 10 ul van lysozyme (1mg/ml) om de monsters. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 500 ul van Lysis Solution en meng zachtjes om de monsters. </li><li> Incubeer gedurende 7 minuten bij 65 ° C. </li><li> Voeg 900 ul van chloroform om de monsters. </li><li> Vortex krachtig tot de monsters gelijkmatig viskeus. </li><li> Voeg 200 ul van Neerslag Solution en vortex krachtig. </li><li> Centrifugeer monsters op 10500 rpm gedurende 10 minuten bij RT om de fasen te scheiden en de interface te vormen. </li><li> Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis met 1 ml ethanol 100%. </li><li> Centrifugeer monsters op 10500 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de ethanol. </li><li> Voeg 1 ml ethanol 70%. </li><li> Centrifugeer monsters op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de ethanol. De resterende ethanol moet worden verwijderd met een pipettator. </li><li> Resuspendeer de pellet in 50 uL van ultrapuur water. </li><li> Lees DNA-concentratie met een spectrofotometer. </li></ol> 3. 16S rRNA PCR Gene PCR-amplificatie wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven 9. <ol><li> Versterken DNA in een 100 ul reactiemengsel bestaande uit 10 pi van 10X PCR-buffer, 5 ul 25 mM MgCl2, 5 ul van 2 mM totaal dNTPs, 1 ul van 50 uM primer RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 ul van 50 uM primer DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 pi van H20 en 0,5 ul Taq-polymerase (AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). </li><li> Overdracht van de PCR-mix in de filters om mogelijke besmetting door bacteriën Taq polymerase te voorkomen. </li><li> Centrifuge filters (Microcon, Millipore, Billerica, MA, USA) gedurende 30 minuten op 500 RCF bij 4 ° C. </li><li> Aliquot de PCR-mix op basis van het aantal monsters die moeten worden versterkt (positieve en negatieve PCR-controles, monsters en onttrokken water). </li><li> Gebruik de volgende thermische cycler voorwaarden: 94 ° C gedurende 10 minuten, 40 keer 1 minuut elke keer bij 94 ° C, 55 ° C en 72 ° C, en 10 min bij 72 ° C. </li><li> Visualiseer het PCR-product op een 2% agarose gel. Gebruik 100 bp DNA ladder. PCR-product is ongeveer 360 bp (figuur 3). </li></ol> 4. PCR-product Zuivering Alleen PCR-positieve monsters moet worden gezuiverd. Zuivering wordt uitgevoerd met behulp vaneen commerciële kit na instructies van de fabrikant (Purelink PCR MicroKit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Voeg 4 volumes Binding Buffer met isopropanol per 1 volume PCR-product. </li><li> Transfer PCR-product met Binding Buffer naar een kolom. </li><li> Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 RCF bij RT. </li><li> Was kolom met Wash Buffer met ethanol. </li><li> Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 RCF bij RT. </li><li> Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 1 minuut bij RT om het silica membraan droog en verwijder alle resten van het wassen Buffer met ethanol. </li><li> Voeg 10 ul van ultrapuur water. </li><li> Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 2 minuten bij RT om het gezuiverde DNA te verzamelen. </li></ol> 5. Klonen Lysogeny bouillon (LB) Plate Voorbereiding <ol><li> Los 25 gr van de LB mix in ongeveer 800 ml water. </li><li> Breng het uiteindelijke volume van 1 L. </li><li> Voeg 15 gr van Bactoagar. </li><li> Autoclaaf gedurende 20 minuten. </li><li> Na de autoclaaf, krachtig krul de oplossing in de kolf gesmolten agar mix. </li><li> Koel de oplossing tot 50 ° C. </li><li> Voeg Ampicilline (50 ug / ml) en zwenken totdat het oplost. </li><li> Giet platen tot een diepte van ongeveer 3 mm. </li><li> Laat de platen uit bij kamertemperatuur. </li><li> Spread X-Gal (40mg/ml) en IPTG (100 mm) op elk LB plaat en incubeer bij 37 ° C tot klaar voor gebruik. </li></ol> Competente cellen Transformatie Transformatie is uitgevoerd met behulp van een commerciële kit na instructies van de fabrikant (Topo TA klonering kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Bereid het klonen reactie mix (1-4 pi van verse PCR-product, 1 ui zout-oplossing, 1 ui vector en water indien nodig). </li><li> Meng reactie en incubeer gedurende 5-10 minuten bij RT. </li><li> Plaats de reactie op het ijs. </li><li> Voeg 2 pi van het klonen reactie in een flacon van competente cellen en meng voorzichtig. </li><li> Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Heat-shock de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C. </li><li> Onmiddellijk overdracht van de buis in ijs. </li><li> Voeg 250 ul van medium. </li><li> Tighly dop van de buis en horizontaal schud de buis bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Spread 50 pi van elke transformatie op een voorverwarmde selectieve plaat. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C. </li></ol> Na de incubatie, witte en blauwe kolonies te ontwikkelen op de borden. Witte kolonies zijn positief voor PCR product inbrengen en blauwe kolonies zijn negatief voor PCR product inbrengen. 6. Sequencing Analyse Sequencing Reactie <ol><li> Een mix is ​​gemaakt met behulp van deze reagentia: 2,5 ul DNA, 1 ui primer (5pmol / ul) 1,1 ul BigDye (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). </li><li> Thermische cycler voorwaarden: 96 ° C voor 1 minuut, 25 keer voor de 96 ° C gedurende 10 seconden, 55 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 4 minuten. </li></ol> Column Zuivering <ol><li> Voor elke reactie, bereiden een MicroSpin kolom (Qiagen,, Milaan, Italië). </li><li> Omgekeerde kolom en vortex tot hars te mengen. </li><li> Snap de bodem van de kolom, los deksel ¼ draai, en plaats kolom in een microcentrifugebuis. </li><li> Centrifuge 3200 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Transfer kolom aan een schoon microcentrifugebuis. </li><li> Voorzichtig pipet de gehele PCR sequencing reactie in het midden van de kolom. </li><li> Centrifuge 3200 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Gezuiverde DNA zal eluite in de buis (20 ul van ultrapuur water). </li></ol> Sequencing Analyse <ol><li> Laad het gezuiverde monster (20 pl) in 96-multiwell-plaat. </li><li> Laad de plaat in de sequencer. Geautomatiseerde DNA sequencers het genereren van een vier-kleuren chromatogram met de resultaten van de volgorde uit te voeren. </li><li> Voer de nucleotidesequentie als een query tegen het publiek sequentie databanken. De zoekopdracht wordt uitgevoerd op de NCBI databases en servers, met Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). </li><li> Besteed alleen aandacht aan bacteriën met 98-100% homologieën. </li></ol> 7. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Tijdlijn van de procedure. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Stroomschema's van de gehele bacteriële identificatie procedure. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. 2% agarosegel tonen breed scala 16S rRNA-gen PCR-producten. Laan 1 bevat een 100 bp DNA ladder, baan 2 van de PCR-positieve controle bevat, baan 3 toont de negatieve PCR-controle. Laan 4 toont monsters van een HIV-positieve patiënt, en de baan 5 water bevat. Lane 6 shOWS monsters van een gezonde persoon en een negatieve PCR-reactie; laan 7 bevat water. Alleen HIV-positieve patiënten toont een positieve PCR-amplificatie. Ultrapuur water wordt gebruikt als een negatieve controle bij de extractie stap, betekent dat er geen besmetting heeft plaatsgevonden. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. 0,7% agarosegel met plasmide geëxtraheerd met Miniprep procedure. Laan 1 bevat een 1 kilobase DNA-ladder, laan 2 bevat de blauwe controle-kolonie, lanen 3 tot en met 12 bevatten witte kolonies. Het plasmide van de blauwe kolonie bevat niet het PCR-product in te voegen. Alle 10 witte kolonies bevatten plasmide met de juiste plaatsen. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Toont een voorbeeld van bacteriële sequencing analyse in het plasma van een HIV-positieve persoon. Onze resultaten tonen aan dat microbiële translocatie in de HIV-ziekte een polimicrobic flora, die niet wordt gezien bij HIV-negatieve personen, hetgeen suggereert substantieel niet van de darm immuniteit in het controleren van bacteriën translocatie betrokken zijn.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Hierbij tonen een PCR / sequencing protocol om de translocatie van bacteriën in het perifere bloed van HIV-geïnfecteerde individuen te karakteriseren.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; De meeste betrouwbare resultaten worden verkregen bij het gebruik van plasma verzameld in EDTA-bevattende buizen. Na de bloedafname moet het plasma worden gescheiden door middel van centrifugeren binnen 2 / 3 uur, hemolyse en DNA-fragment degradatie te voorkomen. Monsters worden eerst opgeslagen bij -20 ° C gedurende ongeveer 5 dagen e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus Nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> Easty-DNA Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K 180001 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> UltraPure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 ug / ml in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold </td><td> Applied Biosystem </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontroller 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR-primers </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> DNA-ladder </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR micro kit </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> LB Agar, poeder </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 mg / ml in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> 40mg/mL in DMF </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> 100mm in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink Quick Plasmide Miniprep kit </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> Big kleurstof </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2,0 spin-kit </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

sequencing van bacteriële microflora in het perifere bloed: onze ervaring met hiv-geïnfecteerde patiënten

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

De gezonde maag-darmkanaal is fysiologisch gekoloniseerd door een grote verscheidenheid aan commensale microben die de ontwikkeling van de humorale en cellulaire mucosale immuunsysteem 1,2 beïnvloeden. Microbiota is afgeschermd van het immuunsysteem via een sterke mucosale barrière. Infecties en antibiotica is bekend dat zowel de normale maag-darmkanaal barrière en de samenstelling van de ingezeten bacteriën, wat kan leiden tot mogelijke immuun afwijkingen drie veranderen. HIV veroorzaakt een breuk in de gastro-intestinale barrière met progressieve uitval van mucosale immuniteit en lekkage in de systemische circulatie van bacteriële bioproducten, zoals lipopolysaccharide en bacteriële DNA-fragmenten, die bijdragen tot systemische activering van het immuunsysteem 4-7. Microbiële translocatie is betrokken in HIV / AIDS immunopathogenese en de respons op de therapie 4,8. Ons doel was om de samenstelling van de bacteriën transloceren in het perifere bloed van HIV-geïnfecteerde patiënten te karakteriseren. Na te streven ons doel hebben we het opzetten van een PCR-reactie voor de panbacteric 16S ribosomial gen, gevolgd door een sequentie-analyse. In het kort, is volbloed van zowel HIV-geïnfecteerde en gezonde proefpersonen gebruikt. Gezien het feit dat gezonde personen normale darm homeostase momenteel geen translocatie van microflora wordt verwacht in deze patiënten. Na de hele bloedafname door venapunctie en plasma scheiding, wordt DNA geëxtraheerd uit plasma en wordt gebruikt om een breed scala PCR-reactie voor de panbacteric 16S ribosomial gen 9 uit te voeren. Na de PCR product zuivering, klonen en sequencing analyses worden uitgevoerd.

Ons experiment zal laten zien hoe je een sequencing analyse van bacteriële soorten transloceren in het perifere bloed van HIV-positieve patiënten uit te voeren.

Sequencing van Bacteriële Microflora in het perifere bloed: onze ervaring met HIV-geïnfecteerde patiënten

Het gezonde maag-darmkanaal is fysiologisch gekoloniseerd door een grote verscheidenheid aan commensale microben die de ontwikkeling van de humorale ...

Sequencing van bacteriële microflora die transloceert in perifeer bloed. Op basis van onze ervaring met hiv-geïnfecteerde patiënten — ik ben junior Marti en ik werk als universitair docent bij de Kliniek voor Infectieziekten en Tropische Geneeskunde aan de Universiteit van Milaan in Italië — zullen we u nu experimenten laten zien over hoe bacteriële DNA uit perifeer bloed van hiv-geïnfecteerde patiënten kan worden gedetecteerd en gesequenced.Het gezonde maag-darmstelsel wordt gekoloniseerd door een grote verscheidenheid aan commensale microben die de ontwikkeling van het humorale en cellulaire immuunsysteem beïnvloeden. De microbiota wordt afgeschermd van het immuunsysteem via een sterke mucosale barrière; na verschillende klinische aandoeningen, zoals infecties, antibioticabehandeling, postoperatieve complicaties, alsook bij patiënten met een carcinoom, pancreatitis en malnutritie, treedt er een verandering in het maag-darmstelsel op.HIV-infectie veroorzaakt een doorbraak van de gastro-intestinale barrière met progressief falen van de mucosale immuniteit en lekkage van bacteriële bioproducten, zoals lipopolysacharide en bacteriële DNA-fragmenten, naar de systemische circulatie, wa

sequencing-bacterial-microflora-peripheral-blood-our-experience-with

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.

Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

Menselijk dubbele infectie is moeilijk te repliceren in vitro. Echter, menselijke malariaparasieten kunnen gemakkelijk worden gekweekt in vitro, net als vers geïsoleerde humane perifere bloedmononucleaire cellen die natuurlijk besmet zijn met HIV. Dit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van vroege immuunresponsen op malariaparasieten in de context van HIV-co-infectie.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model voor het meten van immuunrespons op Malaria in de context van HIV Co-infectie

Technieken die een gradiëntprocedure beschrijven om exosomen te scheiden van humaan immunodeficiëntievirus (HIV) deeltjes worden beschreven. Deze procedure werd gebruikt om exosomen te isoleren van HIV-deeltjes in menselijk plasma van met HIV geïnfecteerde personen. De geïsoleerde exosomen werden geanalyseerd op cytokine/chemokine-gehalte.

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) ex vivo biedt een waardevolle 3D-model van virus pathogenese. Hier beschrijven we een protocol voor het verwerken en infecteren van weefsel monsters van menselijke amandelen en vrouwelijke genitale mucosae met HIV-1 en onderhouden ze in cultuur in de vloeistof-lucht-interface.

Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Hier beschreven zijn drie experimentele benaderingen voor het bestuderen van de dynamiek van HIV-infectie in gehumaniseerde muizen. De eerste maakt de studie van chronische infectie gebeurtenissen, terwijl de twee laatsten voor de studie van acute gebeurtenissen na primaire infectie of virale reactivatie.

Chronische, acute en Gereactiveerde HIV-infectie in gehumaniseerde Immunodeficiënte Muismodellen

Leer sequencing-analyse van bacteriële DNA in perifeer bloed bij HIV-geïnfecteerde patiënten. Deze methode identificeert translocerende microflora en hun relatie met immuunresponsen.

Sequencing van Bacteriële Microflora in het perifere bloed: onze ervaring met HIV-geïnfecteerde patiënten

Meer video's verkennen