Name: High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer een high-throughput protocol voor gisttransformatie met een vloeistofhandelingsrobot. Deze methode identificeert genetische modifiers van toxiciteit bij Saccharomyces cerevisiae voor neurodegeneratief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Packard Center voor ALS onderzoek in Johns Hopkins (ADG), Nieuw-Innovator een NIH Director&#39;s Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), de Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG is een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen, ondersteund door The Pew Charitable Trusts.

1. De voorbereidingen voor gist transformatie Dit protocol is bedoeld voor tien 96-wells platen, maar kan worden opgeschaald naar boven of beneden aangepast. We hebben ontdekt dat dit protocol niet goed werkt voor meer dan twintig 96-well platen per ronde van transformatie. De gehele transformatie procedure (vanaf stap I.3) duurt ongeveer acht uur. <ol><li> Aliquot 5-10μL van plasmide DNA (100 ng / ul) van de gist FLEXGene ORF bibliotheek in elke well van een ronde bodem 96-well plaat met Biorobot RapidPlate vloeistof handler. Plaats 96-well platen ontdekt in schone bench zuurkast 's nachts om te drogen. Wij hebben gevonden soortgelijke transformatie efficiëntie met CEN en 2μ gist plasmiden. </li><li> Inoculeren 200mL van gist pepton dextrose (YPD) media (10 g / L gistextract, 20 g / L pepton, 20 g / L glucose) met vragen stam in een 500ml verbijsterd erlenmeyer. Incubeer overnacht bij 30 ° C onder schudden (200 rpm). Indien gewenst kan selectieve media ook worden gebruikt voor deze starter culturen. </li><li> De volgende ochtend, verdunnen de query stam tot OD 600 = 0,1 in 2L van YPD. Schud voor 4-6 uur bij 30 ° C (200 rpm), totdat de cultuur in OD 600 = 0.8 tot 1.0. Voor een optimale groei, groeien twee culturen 1L in afzonderlijke 2,8 L verbijsterd kolven. Indien gewenst kan selectieve media ook worden gebruikt in plaats van YPD. </li></ol> 2. Gist transformatie <ol><li> Oogst cellen door centrifugeren. Vult vier disposable 225ml conische buizen met gistcultuur en draaien op 3000rpm (~ 1800 xg) voor 5 minuten in tafelblad centrifuge (Eppendorf 5810R). Giet supernatant en herhaal tot alle cellen worden geoogst. </li><li> Was de cellen in 200mL van geautoclaveerd gedistilleerd H 2 O. Resuspendeer celpellet door schudden of vortexen. Combineer cellen in een 225 ml conische buis. Draaien op 3000rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant. </li><li> Bereid 0.1MLiOAc/1XTE oplossing (0,1 M LiOAc, 10mm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 in geautoclaveerd gedestilleerd water). Was de cellen in 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE. Draaien op 3000rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant. </li><li> Resuspendeer cel pellet in 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Schudden en / of vortex om ervoor te zorgen pellet volledig geresuspendeerd. </li><li> Incubeer met schudden bij 30 ° C gedurende 30 minuten (200 rpm). </li><li> Voeg β-mercapto-ethanol op 0,1. Incubeer met schudden bij 30 ° C gedurende 30 minuten (200 rpm). Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen bij gebruik van gist stammen die gevoelig zijn voor β-mercapto-ethanol. We hebben ontdekt dat deze stap niet is essentieel voor een succesvolle transformatie, maar het doet verbeteren transformatie-efficiëntie. </li><li> Kook 2 ml gesoniceerd zalmsperma DNA (10mg/mL) gedurende 15 minuten, en daarna chillen op ijs. </li><li> Voeg 2 ml gekookt zalmsperma DNA naar cel mengsel. Let op: een neerslag kan ontstaan ​​bij toevoeging van de zalm sperma-DNA naar de cel mengsel. Met behulp van een Pipetman en 200 ul tip, verwijder voorzichtig alle neerslag die zich vormt, omdat dit kan interfereren met stroomafwaarts pipetteren. </li><li> Aliquot 50μL van cel mengsel aan elke well van de 96-wells plaat met behulp van de BioRobot Rapidplate (kan ook gebruik maken van multi-channel pipet). Gaan niet samen. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten zonder schudden. </li><li> Bereid 200 ml 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml van 50% PEG-3350, 20 ml DMSO, 20 ml 1M LiOAc). Maak een oplossing onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Voeg 125μL van de PEG / LioAc / DMSO oplossing voor elk putje. Meng door opzuigen en doseren celsuspensie acht keer met RapidPlate. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten zonder schudden. </li><li> Heat shock de cellen bij 42 ° C gedurende 15 minuten in een droge incubator. Niet stapelen platen. Opmerking: We hebben gemerkt dat deze heat shock stap niet is essentieel voor een succesvolle transformatie. Voor bepaalde giststammen (bijvoorbeeld, temperatuur gevoelige mutanten), heat shock is schadelijk. We hebben eerder verlaagde de heat shock tijd om een ​​minuut en in staat zijn geweest om met succes te transformeren een giststam drager zijn van een ypt1 temperatuurgevoelige mutatie met behulp van dit protocol. </li><li> Spin platen bij 2500rpm (~ 1100 xg) voor 5 minuten, met behulp centrifuge adapters voor 96-well platen tegemoet te komen. Verwijder de PEG-oplossing door het omkeren van platen over afval emmer. Blot omgekeerd bord op papier handdoek om de resterende vloeistof te verwijderen (cellen zullen blijven aan de onderkant van putten). </li><li> Spoel cellen door het toevoegen van 200μL van minimale media (bijv. SD /-Ura) aan elk putje met RapidPlate. </li><li> Spin platen op 2500rpm gedurende 5 minuten en verwijder supernatant door het omkeren van meer dan afval emmer en blotting op keukenpapier. </li><li> Voeg 200μL van minimale media (bijv. SD /-Ura) aan elk putje met RapidPlate. </li><li> Incubeer bij 30 ° C gedurende 2 dagen zonder schudden. Na 2 dagen, moeten kleine kolonies van cellen beginnen te vormen op de bodem van iedere succesvolle goed getransformeerd. </li></ol> 3. Spotting assay <ol><li> Doseer 200μL van raffinose op basis van minimale media (bijv. SRaf /-Ura) in elk putje vaneen nieuwe vlakke bodem 96-well plaat. </li><li> Meng elke well van transformatie plaat door opzuigen en doseren celsuspensie acht keer met Rapidplate. </li><li> Inoculeren SRaf platen met 5μL van cel-mengsel uit de transformatie plaat. </li><li> Incubeer bij 30 ° C gedurende een dag. Kleine kolonies aanwezig zou moeten zijn aan de onderkant van elk putje na een dag. </li><li> Spot kolonies op SD /-Ura en SGal /-Ura platen in capuchon. Steriliseer 96-bout replicator (Frogger) door flamberen. Meng kolonies met Frogger voor de vlekken op selectieve media platen. Na het spotten, laat platen te drogen in de kap voor 5-10 minuten. </li><li> Incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. </li></ol> Foto platen met digitale camera, en visueel te vergelijken groei van de kolonies op SGal /-Ura platen om kolonies, waarin vraag stam toxiciteit wordt versterkt (tragere groei / minder dichte kolonies) of onderdrukt (een snellere groei / meer dichte kolonies) te vinden. 4. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Gist plasmide overexpressie scherm om onderdrukkers en versterkers van TDP-43 toxiciteit te identificeren. TDP-43 is een menselijk eiwit dat is betrokken bij de pathogenese van amyotrofe laterale sclerose (ziekte van Lou Gehrig). Cytoplasmatische aggregaten van TDP-43 zich ophopen in de hersenen en het ruggenmerg neuronen van ALS patiënten 17. Uiten van TDP-43 in gist cellen resulteert in aggregatie en cytotoxiciteit 18. We hebben gebruik gemaakt van dit model systeem om mechanismen van TDP-43 toxiciteit 19,20 definiëren. Getoond worden repesentative voorbeelden van platen uit onze gist TDP-43 toxiciteit modifier scherm. Deze platen weer kolonies met een geïntegreerde galactose-induceerbare TDP-43 plasmide en ook getransformeerd met plasmiden uit de FLEXGene ORF uitdrukking bibliotheek. De plaat aan de linkerkant bevat glucose, die expressie van TDP-43 of de FLEXGene plasmiden onderdrukt. De plaat aan de rechterkant bevat galactose, die de expressie van TDP-43 en de ORF's in de FLEXGene plasmiden induceert. De groene pijlpunt geeft een kolonie getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP-43 onderdrukt. De rode pijlpunt geeft een kolonie getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP-43 verbetert.

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
<li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li>
<li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li>
<li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li>
<li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li>
<li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%28%28R%29%29+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li>
<li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17, 536-543 (2007).</li>
<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).</li>
<li>Mnaimneh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Hier presenteren wij een protocol om een ​​high-throughput plasmide overexpressie screen in gist uit te voeren. Deze aanpak maakt het mogelijk om snelle en onpartijdige screening op genetische factoren van een groot aantal verschillende cellulaire fenotypes. Met behulp van deze aanpak, een onderzoeker kan een aanzienlijk deel van de gist genoom scherm in een kwestie van weken. Deze onpartijdige aanpak maakt het ook mogelijk voor de identificatie van modifiers, die niet mag worden voorspeld op basis van eerdere bevinding...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 bout replicator (frogger) </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF Bibliotheek </td><td> Instituut van Proteomics, de Harvard Medical School </td><td></td></tr><tr><td> Tafelblad centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500ML verbijsterd fles </td><td> Bellco </td><td> 2543 tot 00.500 </td></tr><tr><td> 2.8L triple-verbijsterd Fernbach fles </td><td> Bellco </td><td> 2.551 tot 02800 </td></tr><tr><td> 100μL Rapidplate pipettips </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200μL Rapidplate pipettips </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

high-throughput gist plasmide overexpressie screen

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

De gist Saccharomyces cerevisiae, is een krachtig model systeem voor het definiëren van fundamentele mechanismen van de vele belangrijke cellulaire processen, waaronder die met directe relevantie voor de menselijke ziekte. Vanwege de korte generatietijd en goed gekarakteriseerd genoom, een grote experimentele voordeel van de gist modelsysteem is de mogelijkheid om genetische screens uit te voeren om genen en paden die betrokken zijn bij een bepaald proces te identificeren. In de afgelopen dertig jaar een dergelijke genetische screens zijn gebruikt om de celcyclus, secretieroute, en nog veel meer sterk geconserveerde aspecten van de eukaryote cel biologie 1-5 toe te lichten. In de afgelopen jaren zijn er verschillende genoomwijde bibliotheken van gist stammen en plasmiden is gegenereerd 6-10. Deze collecties nu zorgen voor de systematische ondervraging van gen-functie met behulp van winst-en verlies-van-functie benaderingen 11-16. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een high-throughput gist transformatie protocol met een liquid handling robot aan een plasmide overexpressie scherm uit te voeren, met behulp van een gekleed bibliotheek van 5.500 gist plasmiden. We hebben gebruik gemaakt van deze schermen aan genetische factoren van toxiciteit in verband met de accumulatie van aggregatie-gevoelige humane neurodegeneratieve ziekten eiwitten te identificeren. De methoden die hier gepresenteerd zijn gemakkelijk aan te passen aan de studie van andere cellulaire fenotypes van belang.

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Met behulp van een plasmide gekleed bibliotheek en een high-throughput gist transformatie protocol met een liquid handling robot.

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

De buddinggist, Saccharomyces cerevisiae, is een krachtig modelsysteem voor het definiëren van fundamentele mechanismen van vele belangrijke cellulaire processen, ...

Het algemene doel van deze procedure is om gistcellen te transformeren met een array-bibliotheek van plasma-DNA's. Dit wordt bereikt door eerst een geschikte hoeveelheid gistcellen te kweken. De gistcellen worden vervolgens behandeld met lithiumacetaat om ze competent te maken voor DNA-transformatie.Transformeer vervolgens de competente e-cellen door ze te mengen met DNA. De laatste stap van de procedure is het selecteren en analyseren van de transformanten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de effecten van het plasmida-DNA op gistfenotypen aantonen via gist-spottingassays en/of microscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen, zoals standaard gisttransformaties, is dat het de transformatie van een groot aantal verschillende plasmiden in gistcellen op een geautomatiseerde manier mogelijk maakt. Dit high-throughput gisttransformatieprotocol is ontworpen voor 10 platen van 96 wells, maar kan naar behoefte worden op- of afgeschaald. Voor experimenten op grotere schaal is het organiseren van alle platen en reagentia de sleutel tot succes.Zodra het experiment is gestart, wordt er in dit protocol een Biobot rapid plate liquid handler gebruikt om verwarring te voorkomen. Begin met het aliquoteren van 5 tot 10 µL plasma-DNA uit een array-gistplasmidbibliotheek in elke put van de ronde 96-wells platen met ronde bodem. Plaats de onafgedekte 96-wells platen overnacht in een schone laminaire flowkast om te drogen.Inoculeer vervolgens 200 milliliter yeast peptide dextrose of YPD-medium met een query-stam in een 500 milliliter gebaffelde Lin Meyer-kolf en incubeer dit gedurende de nacht bij 30 °C onder schudcondities. Verdun de volgende ochtend de query-stam tot een OD 600 van 0,1 in twee liter YPD-medium voor optimale groei. Kweek culturen tot een volume van één liter in afzonderlijke gebaffelde kolven van 2,8 liter.Schud de kolven vier tot zes uur bij 30 °C totdat de culturen een OD 600 van 0,8 tot 1,0 bereiken. Wanneer de gistcultuur een OD 600 van 0,8 tot 1,0 heeft bereikt, worden de cellen geoogst door centrifugatie. Vul vier wegwerp conische buizen van 225 ml met cultuur en centrifugeer deze 5 minuten bij 3000 RPM in een tafelcentrifuge.Giet het S-supernatans uit elke buis af. Voeg meer cultuur toe aan dezelfde buizen en centrifugeer opnieuw; herhaal dit indien nodig totdat alle cellen zijn geoogst. Was elke celpellet in 50 milliliters autoclaaf-gedestilleerd water en resuspendeer door middel van vortexen.Combineer de cellen in één conische buis van 225 ml en centrifugeer 5 minuten bij 3000 RPM. Verwijder na het afnemen van het supernatant de cellen en was deze in 100 ml lithiumacetaatoplossing. Centrifugeer opnieuw 5 minuten bij 3000 RPM.Verwijder de SNA en resuspendeer de celpellet in 70 milliliters lithiumacetaatoplossing. Vortex op hoge snelheid gedurende ongeveer 30 seconden totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Incubeer onder schudding bij 30 degrees Celsius gedurende 30 minuten.Voeg vervolgens beta-mercapto-ethanol toe tot 0,1 M en incubeer onder schudden bij 30 °C gedurende nog eens 30 minuten. Voeg na de incubatie van 30 minuten twee milliliter gekookt en afgekoeld zalmsperma-DNA toe aan het cellenmengsel. Giet het cellenmengsel in een autocleefbare plaat met één putje en verwijder vervolgens eventueel gevormd precipitaat, omdat dit het daaropvolgende pipetteren kan beïnvloeden.Gebruik de biobot rapid plate om 50 µL van het cellenmengsel in elke put van de vier eerder geprepareerde 96-wells platen met plasma-DNA te pipetteren; meng dit niet. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder schudden terwijl de cellen incubeeren.Bereid 200 milliliter PEG DMSO lithiumacetaat-oplossing. Meng 160 milliliter 50%PEG 33, 50, 20 milliliter DMSO en 20 milliliter één molair lithiumacetaat. Het is belangrijk dat deze oplossing vlak voor gebruik wordt bereid.Voeg 125 µL PEG lithiumacetaat DMSO-oplossing toe aan elk monster. Meng grondig door de celсусpensie acht keer op te zuigen en weer te dispenseren. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden.Zet de cellen vervolgens 15 minuten lang bloot aan een hittestress van 42 °C in een droge incubator; stapel de platen na de hittestress niet op. Centrifugeer de platen met behulp van centrifuge-adapters die geschikt zijn voor 96-wells platen. Verwijder na centrifugatie de PEG-oplossing door de platen boven een afvalbak om te keren. Dep de omgekeerde platen vervolgens droog met keukenpapier.Om resterende vloeistof te verwijderen, blijven de cellen op de bodem van de wells. Spoel de cellen door 200 µL minimaal medium aan elke well toe te voegen. Centrifugeer de platen opnieuw.Verwijder het supernatant door de plaat boven een afvalbak om te keren en te drogen op papieren handdoeken. Voeg met een rapid plate incubatie 200 µL minimaal medium toe aan elke put en incubeer gedurende twee dagen bij 30 °C zonder schudden. Na twee dagen zouden er kleine celkolonies moeten ontstaan op de bodem van elke succesvol getransformeerde put.Om u voor te bereiden op de Spatting-assay, doseer eerst 200 µL OSE-gebaseerd minimaal medium in elke put van een nieuwe vlakbodem 96-well plaat. Meng vervolgens elke put van de transformatieplaat door de cel-suspensie acht keer op te zuigen en weer te dispenseren met een rapid plate.Inoculeer elke well van de raffinoseplaat met vijf µL van het celmengsel van de transformatieplaat en incubeer dit gedurende één dag bij 30 °C. De volgende dag zouden er kleine kolonies aanwezig moeten zijn op de bodem van elke well.Voer de spotting-assay uit in de zuurkast en steriliseer een 96-pins replicator of frogger door middel van vlammen. Meng de kolonies met een frogger en spot vervolgens de kolonies op selectieve mediumplaten. Laat de platen na het spotten vijf tot 10 minuten drogen in de zuurkast.Incubeer de platen bij 30 °C gedurende twee tot drie dagen. Hier worden representatieve resultaten getoond van een gist-plasmide overexpressiescreening om suppressoren en enhancers van TDP 43-toxiciteit te identificeren. TDP 43 is een menselijk eiwit dat betrokken is bij de pathogenese van amyotrofische laterale sclerose of de ziekte van Lou Gehrig; de expressie van TDP 43 in gistcellen leidt tot aggregatie en cytotoxiciteit.Deze platen tonen kolonies met een geïntegreerd galactose-induceerbaar T DP 43-plasmide die daarnaast zijn getransformeerd met plasmiden uit de flex-gen ORF-expressiebibliotheek. De kolonies hier hebben een rode kleur omdat de stam een mutatie heeft die leidt tot de accumulatie van een rood pigment. De plaat links bevat glucose, wat de expressie van T DP 43 of de flex-gen-plasmiden onderdrukt.De plaat rechts bevat galactose, wat de expressie van TDP 43 en de O Fs in de flex-genplasmiden induceert. De groene pijl wijst naar een kolonie die is getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP 43 onderdrukt, wat blijkt uit een snellere groei en dichtere kolonies. De rode pijl wijst naar een kolonie die is getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP 43 verhoogt, wat blijkt uit een tragere groei en minder dichte kolonies.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een bibliotheek van plasma-DNA's uit cellen kunt transformeren.

high-throughput-yeast-plasmid-overexpression-screen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Dit artikel presenteert een paring gebaseerde methode om overexpressie screening in ontluikende gist met behulp van een gekleed plasmide-bibliotheek.

Paring gebaseerde overexpressie bibliotheek Screening in het gist

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Eiwittechniek door gist Surface Display

Hier introduceren we een protocol voor het gebruik van substraten met gistoppervlak voor enzymatische modificatietests. Het platform werd gedemonstreerd met behulp van de analyse van de defosforyleringsactiviteit van tyrosinefosfatase SHP-2 tegen een van zijn substraten als een representatieve enzymatische modificatietest.

Enzymatische modificatie en beoordeling van flowcytometrie van door het gistoppervlak weergegeven eiwitten

Leer een high-throughput protocol voor gisttransformatie met een vloeistofhandelingsrobot. Deze methode identificeert genetische modifiers van toxiciteit bij Saccharomyces cerevisiae voor neurodegeneratief onderzoek.

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

Meer video's verkennen