High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen
27 juli 2011
Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm in Saccharomyces cerevisiae, Met behulp van een plasmide gekleed bibliotheek en een high-throughput gist transformatie protocol met een liquid handling robot.
Het algemene doel van deze procedure is om gistcellen te transformeren met een arraybibliotheek van plasma-DNA's. Dit wordt bereikt door eerst een geschikte hoeveelheid gistcellen te laten groeien. De gistcellen worden vervolgens behandeld met lithiumacetaat om ze competent te maken voor DNA-transformatie.
Vervolgens worden de competente e-cellen getransformeerd door ze te mengen met DNA. De laatste stap van de procedure is het selecteren en analyseren van transformanten. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de effecten van het plasma-DNA op gistfenotypen laten zien door middel van gistspotting-assays en/of microscopie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande protocollen, zoals standaard gisttransformaties, is dat het de transformatie van een groot aantal verschillende Plasmiden in gistcellen op een geautomatiseerde manier mogelijk maakt. Dit hoogdoorvoer gist Transformatie protocol is ontworpen voor 10 96-well platen, maar kan dienovereenkomstig worden op- of afgeschaald. Voor grotere experimenten is de sleutel tot succes het georganiseerd houden van alle platen en reagentia.
Eenmaal het experiment is begonnen om verwarring te voorkomen, zal een biobot rapid plate liquid handler worden gebruikt in dit protocol Om te beginnen, wordt vijf tot tien microliters plasma-DNA van een array-gistplasmidbibliotheek in elk putje van de ronde. Bodem 96-well platen gepipetteerd. Plaats de 96-well platen onbedekt in een schone bench fume hood om te drogen overnacht.
Vervolgens worden 200 milliliter gistpeptide dextrose of YPD-medium geïnoculeerd met een query-stam in een 500 milliliter baffled Lin Meyer fles, geïncubeerd overnacht bij 30 graden Celsius met schudden. Verdun de query-stam tot een OD 600 van 0,1 in twee liter YPD-medium voor optimale groei. Laat tot één liter culturen groeien in afzonderlijke 2,8 liter baffled flessen.
Schud de flessen gedurende vier tot zes uur bij 30 graden Celsius totdat de culturen een OD 600 van 0,8 tot 1,0 bereiken. Wanneer de gistcultuur een OD 600 van 0,8 tot 1,0 heeft bereikt, worden de cellen geoogst door centrifugatie. Vul vier wegwerpbare 225 milliliter conische buisjes met cultuur en draai gedurende vijf minuten op 3000 RPM in een tafelcentrifuge.
Giet het S-supernatant uit elk buisje. Voeg meer cultuur toe aan dezelfde buisjes en centrifugeer opnieuw, herhaal indien nodig totdat alle cellen zijn geoogst. Was elke celpellet in 50 milliliter autoclaaf gedestilleerd water en Resuspend door te vortexen.
Combineer cellen in één tweehonderd vijfentwintig milliliter conische buis en draai gedurende vijf minuten op 3000 RPM. Na het verwijderen van de S-supernatant, was de cellen in honderd milliliter lithiumacetaatoplossing. Draai opnieuw gedurende vijf minuten op 3000 RPM.
Verwijder de SNA en hersuspendeer de celpellet in 70 milliliter lithiumacetaatoplossing. Vortex met hoge snelheid gedurende ongeveer 30 seconden totdat de pellet volledig is hersuspendeerd. Incubeer met schudden bij 30 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Voeg vervolgens beta me capto ethanol toe tot 0,1 molair en incubeer met schudden bij 30 graden Celsius gedurende nog eens 30 minuten. Voeg na de 30 minuten incubatie twee milliliter gekookt en gekoeld zalmsperma-DNA toe aan het cellenmengsel. Giet het cellenmengsel in een autoclaveerbare enkele putplaat en verwijder vervolgens eventueel gevormd precipitaat, omdat dit de downstream pipettering kan verstoren.
Gebruik de biobot rapid plate om 50 microliters celmengsel in elk van de vier eerder bereide 96-well platen te pipetten die plasma-DNA bevatten. Meng niet. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten zonder te schudden terwijl de cellen incuberen.
Bereid 200 milliliter PEG DMSO lithiumacetaatoplossing. Combineer 160 milliliter van 50%PEG 33, 50 20 milliliter DMSO en 20 milliliter van een molaire lithiumacetaatoplossing. Het is belangrijk dat deze oplossing net voor gebruik wordt bereid.
Voeg 125 microliters PEG lithiumacetaat DMSO-oplossing toe aan elk. Putje. Meng door de cellensuspensie acht keer op te zuigen en af te geven. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten zonder te schudden.
Vervolgens schok de cellen gedurende 15 minuten op 42 graden Celsius. In een droge incubator, stapelt u de platen niet na de hitteschok. Draai de platen met behulp van centrifugeadapters om de 96-well platen te kunnen plaatsen. Na centrifugatie, verwijdert u de PEG-oplossing door de platen omgekeerd over een afvalemmer te houden. Dep vervolgens de omgekeerde platen op papieren handdoeken.
Om restvloeistof te verwijderen, blijven de cellen op de bodem van de putjes. Spoel de cellen door 200 microliters minimaal medium aan elk. Putje toe te voegen. Draai de platen opnieuw.
Verwijder het supernatant door om te keren over een afvalemmer en te deppen op papieren handdoeken. Voeg 200 microliters minimaal medium toe aan elk putje met een rapid plate en incubeer gedurende twee dagen bij 30 graden Celsius zonder te schudden. Na twee dagen zouden kleine kolonies cellen moeten beginnen te vormen op de bodem van elk succesvol getransformeerd.
Om zich voor te bereiden op de Spatting-assay, verdeel eerst 200 microliters OSE-gebaseerd minimaal medium in elk putje van een nieuwe platte bodem 96-well plaat. Mix vervolgens elk putje van de transformatieplaat door de celsuspensie acht keer op te zuigen en af te geven met een rapid plate.
Inoculeer elk putje van de raffinoseplaat met vijf microliters celmengsel van de transformatieplaat, incubeer gedurende een dag bij 30 graden Celsius. De volgende dag. Kleine kolonies zouden aanwezig moeten zijn op de bodem van elk.
Voer de spotting-assay uit in de kap, steriliseer een 96-bolt, replicator of frogger door te vlam. Mix de kolonies met een frogger en spot vervolgens kolonies op selectieve mediaplaten. Laat de platen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een plasmide overexpressiescherm in Saccharomyces cerevisiae, gebruikmakend van een hoogdoorvoerbaar gisttransformatieprotocol. Het proces omvat het transformeren van gistcellen met een arraybibliotheek van plasmide-DNA's om de effecten op gistfenotypen te analyseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genetica
- Celbiologie
Achtergrond
- Plasmid overexpressieschermen zijn essentieel voor het bestuderen van genfunctie.
- Saccharomyces cerevisiae dient als modelorganisme voor genetische studies.
- Hoogdoorvoerbare methoden verhogen de efficiëntie van genetische transformaties.
- Het begrijpen van gistfenotypen kan inzicht geven in bredere biologische processen.
Doel van het onderzoek
- Om gistcellen te transformeren met plasmide-DNA om genfunctie te beoordelen.
- Om een vloeistofmanipulerende robot te gebruiken voor hoogdoorvoerbare transformaties.
- Om de resulterende transformanten te analyseren op fenotypische veranderingen.
Gebruikte methoden
- Gistcellen worden gekweekt tot een geschikte dichtheid.
- Cellen worden behandeld met lithiumacetaat om competentie voor transformatie te induceren.
- Competente cellen worden gemengd met plasmide-DNA voor transformatie.
- Transformanten worden geselecteerd en geanalyseerd met behulp van gistspottests en microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transformatie van gistcellen met plasmide-DNA.
- Identificatie van fenotypische veranderingen in transformanten.
- Demonstratie van de effectiviteit van hoogdoorvoerbare methoden.
- Inzichten in de functionele rollen van specifieke genen in gist.
Conclusies
- Het plasmide overexpressiescherm is een waardevol hulpmiddel voor genetische analyse.
- Hoogdoorvoerbare technieken kunnen het onderzoek in gistgenetica aanzienlijk versnellen.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van genfunctie en -regulatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput yeast plasmid overexpression screens enable systematic identification of genetic modifiers impacting cellular phenotypes relevant to human disease. This scalable approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by leveraging a well-characterized eukaryotic model. Integration of automated liquid handling accelerates discovery inflection points and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in disease-relevant phenotypes.
- Supports identification of genetic suppressors and enhancers for mechanistic de-risking.
- Facilitates functional target validation through systematic gain-of-function screening.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets in complex biological systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes assay conditions using automated liquid handling for reproducibility.
- Generates quantitative phenotypic outputs for reliable compound or genetic evaluation.
- Enables scalable screening of thousands of plasmids in parallel for robust data generation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast phenotypes with human disease mechanisms for translational continuity.
- Supports identification of genetic modifiers relevant to neurodegenerative disease models.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of targets into preclinical validation.
- Offers predictive de-risking value by modeling aggregation-prone protein toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput yeast transformation protocol bridges early discovery and lead identification by enabling systematic genetic screens with direct translational relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible yeast models for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides quantitative colony growth and density measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast-based findings to preclinical disease models when aligned with human protein toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable screening capability for diverse phenotypic endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and high-throughput screening protocols.
- Depends on access to liquid handling robotics and 96-well plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay setup and data analysis.
- Adaptable to various phenotypes but may require optimization for specific readouts.
- Scalability and reproducibility depend on rigorous plate and reagent management.
