Name: Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: Leer flowcytometrie-analyse van immuuncellen in murine aorta en adventitia. Deze methode karakteriseert leukocytenfenotypes en ondersteunt onderzoek naar atherosclerose en vasculaire ontsteking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen: PO1 HL55798 (naar KL) en de American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (naar bijv.).

1. Isolatie van muizen aorta Institutionele IACUC commissie goedkeuring van de procedure is nodig om te werken met muizen. <ol><li> Bereid heparinzed PBS door het toevoegen van 1.000 eenheden heparine natrium tot 50 ml PBS en omdraaien van de buis te mengen. Bereid een lege collectie buis voor het bloed en een verzameling buis met PBS voor elke aorta te worden verzameld. Houd alle buizen op ijs. </li><li> Heparinize een injectiespuit voor het tekenen van bloed (0,1 ml van 1000 U / ml Heparine natrium), voor te bereiden chirurgische instrumenten (twee paren van gebogen pincet, een paar ontleden schaar, en een paar microshears), en een dissectie podium voor de dissectie. </li><li> Euthanaseren een muis met behulp van kooldioxide in een goedgekeurde kamer na NIH en Institutionele IACUC commissie beleid ten aanzien van euthanasie knaagdier. Controleren op effectiviteit alvorens de muis om het ontleden podium. </li><li> Kort genieten van de muis met 70% ethanol en zet de muis om de dissectie podium. Teken het bloed van de muis via de cardiale punctie. </li><li> Open de buik-en borstholte. Met behulp van een 10 ml spuit met een 25 g naald, volledig perfuseren het vaatstelsel met PBS met 2% van heparine volledig bloed te verwijderen uit de schepen door het hart doorboren. Zorg ervoor dat er geen bloed in de aorta weefsels. De perfusie moet langzaam worden uitgevoerd met weinig druk om ervoor te zorgen dat alle plaques in de vaatwand intact blijven. </li><li> Ontleden en verwijder de viscerale organen, urogenitale organen, diafragma en milt, waardoor de nieren, het hart en aorta intact. </li><li> Zorgvuldig te ontleden vetweefsel en para-aortale lymfeklieren uit de buurt van de aorta, waardoor de aorta en adventitia intact. Verzamel de gehele aorta inclusief aortaboog, oplopende, aflopende, thoracale en abdominale porties. Plaats het geïsoleerde aorta in een verzameling buis met PBS. Tijdens de isolatie procedure, probeer het schip vochtig te houden. </li></ol> 2. De voorbereiding van enkele celsuspensies <ol><li> Maak een 1X Aorta Dissociatie Enzyme-stamoplossing (ADES) (125 U / ml Collagenase type XI, 60 U / ml hyaluronidase type 1-s, 60 U / ml DNase I, en 450 U / ml Collagenase type I, in 2,5 ml van PBS, gewijzigd bij Galkina et al.. 7). Alle enzymen zijn van Sigma-Aldrich. Leg de voorraad enzymoplossing op ijs. </li><li> Haal de PBS uit de collectie buis met de aorta. Voeg 2,5 ml 1X ADES aan elke aorta. Snijd de aorta's in kleine stukjes voor enzymatische vertering te vergemakkelijken of het gehele aorta intact laten. Incubeer de aorta met de 1X enzym oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C (langzamer schudden is optioneel). </li><li> Na de 1 uur incubatie, bereiden enkele cel schorsingen van de aorta verteerd door knippen van de aorta's van elkaar en ze door te geven door middel van een 70 micrometer cel zeef in 5 ml polypropyleen buizen FACS (BD Falcon). Pellet de cellen door centrifugeren (400xg, 5 minuten, 4 ° C). </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml FACS buffer (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,05% NaN 3) en bepalen hoeveel cellen aanwezig zijn in de aorta celsuspensie met behulp van trypan blauw, een hemocytometer, en een lichtmicroscoop. Het totale aantal cellen verkregen na de spijsvertering zal afhangen van de muis leeftijd en voeding of de ernst van atherosclerose. </li></ol> 3. Flowcytometrie vlekken <ol><li> Label een passend aantal nieuwe FACS buizen. In het algemeen moeten flow cytometrie experimenten hebben een niet-gekleurde controle buis, set van een kleur buizen, geschikt fluorescentie-minus-een-controles (FMO) 8, passende isotype controles, en een set van experimentele buizen. Aangezien er een beperkt aantal aorta leukocyten die kunnen worden geïsoleerd, kan de milt leukocyten worden gebruikt om enkele controle vlekken uit te voeren. </li><li> We maken gebruik van een standaard protocol om flowcytometrie aorta celsuspensies vlek. Kortom, de overdracht een portie van 0,5-1x10 6 cellen van een aorta-celsuspensie in een FACS buis (s). Voeg 1 ml FACS buffer en pellet van de cellen door centrifugeren. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit het ingehulde cellen door decanteren. </li><li> Bereid Fc blok oplossing en antilichaam cocktails voor de experimentele buizen, fluorescentie-minus-een-buizen, en isotype buizen. Voeg 100μl van Fc blok in FACS buffer (14.2μg/ml, kloon 2.4G2) om alle van de buizen en vinger flick of zacht vortex om de cellen te mengen. Incubeer de monsters gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid antilichaam kleuring, isotype vlekken of FMO controle vlekken cocktails. Bepaal de optimale concentratie van antilichamen in uw voorlopige titratie-experimenten. In aanwezigheid van Fc blokkeren, toe te voegen antilichaam cocktails (100ul/0.5-1.0x10 6 cellen) aan het monster buizen. Incubeer 20-30 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Voeg 1 ml FACS buffer aan elke buis, om Vortex, en pellet de cellen door centrifugeren. Herhaal de procedure nog een keer. </li><li> Giet het supernatant en resuspendeerhet ingehulde cellen in 300μl van 2% PFA. Voer de monsters op een flowcytometer. <ul><li> Let op: Typisch anti-CD45 antilichaam (gemeenschappelijke leukocyten antigen marker) wordt toegevoegd aan alle van de monsters om de gate CD45 + leukocyten later 7 Bovendien, CD45 FMO en isotype controles moeten in eerste instantie worden gebruikt om de CD45 + leukocyten poort plaats. CD45 expressie kan variëren tussen leukocyten. </li><li> Opmerking: Om met lage dichtheid uiten van oppervlakte-antigenen of lage evenement antigenen te detecteren, "helder fluorochromen", zoals R-phycoerythrin (PE) of Allophycocyanin (APC). Daarnaast kunnen zeldzame gebeurtenissen worden gedetecteerd door het samenbrengen van verschillende afgestemd aorta's bij elkaar, maar als er meer dan een miljoen cellen worden gebruikt, de hoeveelheid antilichamen die per test moet evenredig verhoogd. </li><li> Opmerking: Om ervoor te zorgen dat er minimaal bloed verontreinigingen in de geïsoleerde aorta en dus ook in de aorta celsuspensie, in sommige experimenten extra kleuring werd uitgevoerd voor TER-119, 7 een antigen uitgedrukt door rode bloedcellen (RBC). Het aantal RBC aan witte bloedcellen (WBC) in het bloed is ongeveer 10x10 6 cell / ul tot 8x10 3 cellen / ul. Op basis van de expressie van TER-119 bij aorta-monsters, kan het percentage van de op basis van bloed witte bloedcellen in het monster worden berekend. Typisch hebben we minder dan 0,02% van de op basis van bloed WBC bij aorta-monsters. (Fig.1) </li><li> Let op: Omdat het enzym behandeling kan de uitdrukking van oppervlakte-antigenen van invloed zijn, de weerstand tegen enzymdigestie moet worden bepaald voor de antigenen van belang. Kortom, zijn perifere lymfeknoop (PLN) of kleine stukjes milt geïncubeerd met of zonder enzym cocktail gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na 1 uur, is de uitdrukking van antigenen bepaald door flowcytometrie. Het enzym cocktail heeft geen effect op meerdere oppervlakte-antigenen (Fig.2) 7. In sommige andere gevallen, het enzym behandeling resulteerde in een aanzienlijk verlies van antigeen expressie. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van alternatieve cel markers. </li><li> Let op: Live / dead levensvatbaarheid van de cellen verkleuring kan worden uitgevoerd na stap 4 indien gewenst. Gebruiken meestal Live / Dead Muur Dead Cell Stain kit (Invitrogen, Molecular Probes). Om vlekken op de cellen met Live / Dead kleurstof, maak dan een 1x Live / Dead-oplossing door het toevoegen van 1μl opnieuw opgelost live / dood kleurstof in 1 ml PBS en vortex te mengen. Voeg 100 tot 200 ul van 1x Live / Dead kleurstof naar de live / dode single, cocktail, FMO en isotype controle monsters. Incubeer de monsters met de kleurstof bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in het donker. De single controle buis voor Live / Dead moet worden geïncubeerd bij 56 ° C in het donker gedurende 10 minuten naar de cellen te doden door hitte shock. Was de cellen met 1 ml PBS en pellet van de cellen door centrifugeren. Hervat het protocol bij stap 5. </li><li> Let op: Intracellulaire kleuring voor intracellulaire antigenen en cytokines is compatibel met dit protocol. Kortom, kan intracellulaire kleuring worden uitgevoerd met behulp van cel-fixatie / permeabilisatie reagentia van BD Pharmingen, eBioscience, of Caltag laboratoria - afhankelijk van de antigenen van belang. Vast te stellen en permeabilize de cellen voor intracellulaire kleuring, voert u de fixatie / permeabilisatie stap, volgens de instructies van de fabrikant, na de extracellulaire vlekken stap (hoofdstuk 3, stap 5). Naar aanleiding van de intracellulaire wasstap, hervatten ons protocol bij stap 6 (hoofdstuk 3 stap 6). </li></ul></li></ol> 4. Flowcytometrie-analyse van geïsoleerde omgeving adventitia en vaatwand Zoals leukocyten kunnen migreren naar de aorta adventitia als atherosclerotische plaques in de aorta, naar adventitia en aorta leukocyten te onderzoeken door middel van flowcytometrie een protocol voor het isoleren en het uitvoeren van flowcytometrie op deze twee anatomische sites werd ontwikkeld. Negen kort, voor de gehele aorta worden verteerd met ADES (hoofdstuk 2, stap 2) van de aorta adventitia is gedeeltelijk verteerd en verwijderd van de rest van het schip. Zodra de adventitia is verwijderd en vernietigd, is de rest van de aorta verteerd met ADES naar leukocyten te bevrijden van de vaatwand. <ul><li> Aorta adventitia Isolatie Protocol </li></ul><ol><li> Naar aanleiding van de voorbereiding van 1X ADES (deel 2 stap 1), voor te bereiden 2,5 ml / aorta van 1X Aorta adventitia spijsvertering enzym-oplossing (AADES) (781.25 U Collagenase II en 14.0625 U Elastase in 2.5mls PBS (Worthington biochemische Corp, Lakewood, NJ )). 9 Plaats de stockoplossing op ijs tot gebruik. </li><li> Haal de PBS uit de collectie buis met de aorta. Voeg 2,5 ml 1X AADES aan elke aorta. Knip niet de aorta's in kleine stukjes. Incubeer de aorta met de 1X adventitia enzymoplossing gedurende 10-20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na de 10-20 minuten spijsvertering, de overdracht van de gedeeltelijk verteerde aorta uit het 1x AADES om een ​​petrischaal met verse PBS. Heel voorzichtig, gebruik van twee paar gebogen pincet, schil de adventitia laag weg frOM de aorta als een eenheid. <ul><li> Let op: langere digestietijden maken het makkelijker om de adventitia te verwijderen, maar als de adventitia is over-verteerd zal scheuren. </li></ul></li><li> Als de adventitia volledig is verwijderd, de overdracht van de adventitia en de aorta te scheiden FACS buizen. Voeg 1 ml PBS op de adventitia buis, en plaats de buis op het ijs. Voeg 2,5 ml van 1X aorta dissociatie enzym oplossing voor de aorta buis en incubeer de aorta gedurende 40 minuten bij 37 ° C. <ul><li> Opmerking: Om de enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken, de aorta kan worden verdeeld in kleinere stukken op dit punt. </li></ul></li><li> Na de 40 minuten spijsvertering, plaats de aorta buis op ijs en voor te bereiden single cell schorsingen van de aorta en de adventitia door knippen van de aorta en de adventitia van elkaar en ze door te geven door middel van een 70 micrometer cel zeef in 5 ml polypropyleen buizen FACS (BD Falcon). Pellet de cellen door centrifugeren (400xg, 5 minuten, 4 ° C). Ga terug naar hoofdstuk 2 stap 4 en hervat het protocol. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Hier presenteren wij een aantal figuren die flowcytometrie vlekken om het immuunsysteem samenstelling van de gehele aorta, de aorta vaatwand en de omringende aorta adventitia analyseren laat zien. Eerst tonen we een vertegenwoordiger FACS plot dat een TER-119 vlekken op de vol bloed en geïsoleerd aorta celsuspensie (afb. 1) toont. TER-119 positieve rode bloedcellen goed voor 18% van de cellen in de aorta celsuspensie, wat aangeeft dat slechts 0,014% van de cellen geïsoleerd uit aorta celsuspensies zijn op basis van bloed. Dit is een belangrijk controle-experiment dat duidelijk aantoont dat verteerd schepen, maar niet circulerende perifeer bloed is de bron voor de meeste leukocyten geanalyseerd in de aorta celsuspensie. Daarnaast is het valideren van de methode, onderzochten we de effecten van de aorta dissociatie enzym cocktail op splenocyten oppervlakte-antigenen (afb. 2). Het enzym cocktail heeft geen effect op de expressie van verschillende antigenen, met inbegrip van, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ en diverse andere oppervlakte-antigenen 7. CD45 kleuring in combinatie met Live / Dead levensvatbaarheid dye en passende isotype controles worden gebruikt voor het detecteren en sub-gate grote populaties van belang en de cellulaire puin uit te sluiten tijdens de analyse. In de Fig.3, live aorta-CD45 + leukocyten waren gated om het percentage van de IFN bepalen Υ + T-cellen in de gepoolde aorta's van twee jonge ApoE - / - muizen. Om te benadrukken de veelzijdigheid van deze methode, met behulp van de gating schema in figuur 3, presenteren we in Fig.4 representatief intracellulaire kleuring voor CD68 + CD11b + macrofagen en IFNy + TCRαβ + cellen van twee ApoE - / - muizen gevoed westerse dieet voor 12 week. Zoals verwacht, in het westen van dieet gevoed ApoE - / - aorta, de meerderheid van de leukocyten in de aorta zijn macrofagen (40% CD68 + CD11b +) of andere myeloïde cellen (CD68 + CD11b laag en CD11b + CD68-). Daarnaast, Th1-cellen bestaan ​​uit een groot deel van de aorta infiltrerende TCRαβ T-cellen (Fig.4). Als het totale percentage van de aorta leukocyten en leukocyten subsets varieert afhankelijk van de leeftijd van de muis en de ernst van atherosclerose, moet de optimale gating strategie voor grote populaties van belang empirisch worden bepaald Om aan te tonen de haalbaarheid van het isoleren van de aorta adventitia voor flowcytometrie kleuring, presenteren wij vertegenwoordiger CD45 + leukocyten kleuring voor aorta-en adventitia celsuspensies (figuur 5). Kortom, drie jaar ApoE - / - muis aorta waren verteerd en samen gebundeld zoals hierboven beschreven (punten 2 en 4). Infiltreren CD45 + leukocyten werden ontdekt in zowel de adventitia (18% van de celsuspensie) en de resterende aorta (11% van de celsuspensie). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. TER-119 kleuring in verteerd aorta celsuspensie. Aorta werd geperfuseerd door hart doorboren met PBS met 2% heparine. Dan is de aorta werd gedigereerd met het enzym cocktail gedurende 1 uur bij 37 ° C. Aorta cellen schorsing en bloedmonster (als een positieve controle) werden gekleurd met anti-TER-119-PE Abs en geanalyseerd door flowcytometrie. TER-119-positieve rode bloedcellen goed zijn voor 18% van alle cellen in de aorta celsuspensie geeft aan dat slechts 0,014% van alle leukocyten geïsoleerd uit aorta's zijn waarschijnlijk op basis van bloed leukocyten. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Enzyme-cocktail behandeling heeft geen effect op CD45 (boven) of CD19 (onder) expressie op lymfocyten. + / CD19 + lymfocyten. Profielen zijn gated op CD45 + leukocyten. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Gating strategie voor de analyse van de aorta leukocyten twee aorta's werden geïsoleerd en samengevoegd uit atherosclerotische gevoelige ApoE.. - / - Muizen en aorta cel suspensies werden bereid zoals hierboven beschreven. De cel suspensies werden gekleurd voor CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNy (eFluor 450), en Live / Dead Aqua, en geanalyseerd met behulp van een Cytek DXP 8 Kleur opgewaardeerd BD FACS Calibur. Kortom, CD45 + Leukocyten waren gated (B) en verder geanalyseerd (CF). Dode cellen werden verwijderd uit de analyse op basis van Live / Dead Aqua kleuring (D) en FSC percelen (E). Live-aorta leukocyten werden vervolgens onderzocht op TCRαβ en IFNy expressie (F). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> .. Figuur 4 intracellulaire kleuring voor intracellulaire antigenen en cytokines Cell suspensies werden bereid uit een hele ApoE - / - aorta en de milt zoals beschreven. Aorta (A) en milt (B, C) celsuspensies werden gekleurd voor CD45, CD11b en CD68 of een isotype controle met behulp van BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences). Cellen werden gated op CD45 + leukocyten en het puin werd uitgesloten op basis van de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing profielen. Voor intracellulaire IFNy kleuring, aorta en de milt cel suspensies werden gekweekt voor vijf uur in RPMI 1640 aangevuld met Golgi stoppen, PMA, en ionomycine C, zoals eerder beschreven. Negen Gestimuleerd single aorta (D) en milt (E, F) cel suspensies werden vervolgens gekleurd met CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), Live Dead Aqua, en IFNy (eFluor 450, E) of een isotype (IgG1-eF450, F). T-cellen (DF) werden gated van levende CD45 + CD3 + leukocyten (CD45 + Live / Dead Aqua-) en onderzocht op TCRαβ en IFNy. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> .. Figuur 5 representatief beeld van de geïsoleerde muizen aorta adventitia en aorta vaatwand vertegenwoordiger flowcytometrie teller plot toont de aanwezigheid van CD45 + T-cellen in de adventitia en de aorta van de leeftijd van ApoE - / - muizen. SSC-zijwaartse verstrooiing. Te elimineren autofluorescentie van puin en necrotische weefsels, plots werden gated voor FSC&gt; 750. Om te voorkomen dat extra autofluorescentie van doubletten de poorten werden ook opgezet als FSC &lt;3500, SSC &lt;3500. De percentages geven CD45 + cellen in de poorten.

<ol><li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li>
<li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+in+atherosclerosis%3A+a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li>
<li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+influx+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li>
<li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids%3A+a+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li>
<li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+%22mock%22+FL3+channel+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li>
<li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
<li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li>
<li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li>
</ol>

Hier presenteren wij een flow-cytometrie-gebaseerde methode voor het onderzoek van de immuun cel samenstelling van muriene aorta. Het grote voordeel van deze methode is de mogelijkheid om aorta immuuncellen analyseren op een enkele cel niveaus en om de activering status van de aorta leukocyten karakteriseren. Deze methode is niet beperkt tot muriene aorta en we (ongepubliceerde gegevens) en anderen 10 gebruikte deze benadering van de menselijke specimens zoals interne mamma-arterie, aorta-kleppen en kransslag...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal </td><td> Catalogusnummer </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> Collagenase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, type 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biochemische Corporation </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biochemische Corporation </td></tr></tbody></table>

flowcytometrie-analyse van de immuuncellen binnen murine aorta

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerose is een chronisch ontstekingsproces van middelgrote en grote schepen die wordt gekenmerkt door de vorming van plaques bestaande uit schuimcellen, immuuncellen, vasculaire endotheliale en gladde spiercellen, bloedplaatjes, extracellulaire matrix, en een lipide-rijke kern met uitgebreide necrose en fibrose van de omliggende weefsels. 1 De aangeboren en adaptieve armen van de immuunrespons betrokken zijn bij de initiatie, ontwikkeling en voortbestaan ​​van atherosclerose. 2, 3 Er is een aanzienlijke hoeveelheid bewijs dat verschillende subgroepen van de immuun cellen, zoals macrofagen, dendritische cellen, T-en B-lymfocyten, zijn aanwezig in de aorta&#39;s van gezonde en atherosclerose-gevoelige muizen 4. Daarnaast worden immuuncellen in de omliggende aorta adventitia, die een belangrijke rol van dit weefsel suggereert in atherogenese 2. Al enige tijd werd de kwantitatieve detectie van verschillende soorten immuuncellen, de activatie-status, en de cellulaire samenstelling binnen de aorta beperkt door de RT-PCR en immunohistochemische methoden voor de studie van atherosclerose. Er zijn maar weinig pogingen werden ondernomen om flowcytometrie met behulp van menselijke aorta uit te voeren, en een aantal problemen, zoals een hoge autofluorescentie, zijn gemeld 5,6. Human atherosclerotische plaques werden verteerd met collagenase 1, en vrije cellen werden verzameld en gekleurd voor CD14 + / + CD11c tot macrofaag-afgeleide schuimcellen te markeren. In deze studie werd een &#39;mock &quot;kanaal gebruikt om vals-positieve kleuring te vermijden. 6 necrotische materiaal accumuleren tijdens het verteringsproces leiden in een grote hoeveelheid puin dat een hoge autofluorescentie bij aorta-monsters genereert. U lost dit probleem, heeft een panel van negatieve en positieve controles voorgesteld, maar slechts twee kleuren kan worden toegepast in deze monsters. We hebben een nieuwe flow cytometrie-gebaseerde methode 7 om het immuunsysteem cel samenstelling te analyseren en te karakteriseren de activatie, proliferatie, differentiatie van immuuncellen in gezonde en atherosclerose-gevoelige aorta. Deze methode maakt het mogelijk het onderzoek van de immuun cel samenstelling van de aorta en opent mogelijkheden om een ​​breed spectrum van immunologische methoden voor het onderzoeken van het immuunsysteem van aspecten van deze ziekte.

Dit document presenteert een flow cytometrie-gebaseerde methode om het immuunsysteem samenstelling van de aorta&#39;s te onderzoeken. De paper illustreert ook een extra techniek die het mogelijk maakt te onderzoeken omringende adventitia en vaatwand afzonderlijk. Deze methode biedt mogelijkheden om fenotypische analyses van de aorta leukocyten uit te voeren en een aantal immunologische testen toe te passen voor atherosclerose studies.

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerose is een chronisch inflammatoir proces van middelgrote en grote vaten dat wordt gekenmerkt door de vorming van plaques bestaande uit schuim...

Het doel van het volgende experiment is om de compositie en het fenotype van infiltrerende leukocyten in de aorta en de adventitia te karakteriseren middels flowcytometrie. Dit wordt bereikt door in eerste instantie een atherosclerotische aorta te isoleren als tweede stap. De omringende adventitia wordt gescheiden van de aorta en er worden enkelcel-suspensies geprepareerd van beide weefsels.Vervolgens worden de resultaten van de single-cell suspensies van fluorescent gelabelde cellen verkregen om specifieke subsets van leukocyten uit het adventitieweefsel en de aortawand te differentiëren; deze resultaten tonen de diversiteit van in de aorta infiltrerende leukocyten tijdens atherogenese en de haalbaarheid van het isoleren van leukocyten uit het aortadventitieweefsel op basis van flowcytometrische analyse van single-cell suspensies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunohistochemie is dat leukocyten uit een enkele aorta kunnen worden onderzocht en gefenotypeerd met behulp van meerdere markers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de cellulaire mediatoren van ontsteking bij de pathogenese van atherosclerose en andere vasculaire inflammatoire aandoeningen.De identificatie van aortale leukocyten en de fenotypische karakterisering van bestaande en nieuwe mediatoren van ontsteking zullen helpen bij het verduidelijken van de mechanismen van atherosclerose. Plaats een lege opvangbuis voor het bloed en een opvangbuis met PBS op ijs. Doop voor elke te verzamelen aorta een geëuthanaseerde muis kort in 70%ethanol en bevestig de muis met laboratoriumtape op een dissectieplaat.Trek vervolgens met een geheparineerde spuit bloed uit de muis via een hartpunctie. Open de buik- en borstholte met een dissectieschaar en spoel de vaten volledig door met PBS die 2% heparine bevat, met behulp van een spuit van 10 milliliter met een naald van 25 gauge. Dissekeer en verwijder vervolgens de visceraalorganen, de genitalie- en urinariaorganen, het diafragma en de milt, waarbij de nieren, het hart en de aorta intact blijven.Zorg ervoor dat er geen bloed in de aortawegen aanwezig is. Dissekeer zorgvuldig het vetweefsel en de para-aortische lymfeklieren weg van de aorta, waarbij de aorta en adventitia intact blijven. Verzamel vervolgens de gehele aorta, inclusief de aortaboog en de descenderende, descenderende thoracische en abdominale delen.Plaats de geïsoleerde aorta in een opvangbuis met PBS. Verwijder de PBS uit de opvangbuis waarin de aorta zich bevindt. Voeg 2,5 milliliters van een eenvoudige digestie-enzymoplossing voor de aortale adventitia toe aan de aorta.Incubeer vervolgens de aorta gedurende 10 tot 20 minuten met de enzymoplossing bij 37 °C. Voeg tijdens de incubatie PBS toe aan een Petrischaal.Na de incubatie wordt de gedeeltelijk verteerde aorta zeer voorzichtig vanuit de enzymoplossing overgebracht naar de Petrischaal met PBS. Pel met twee paren gebogen pincetten de adventitiallaag als één geheel van de aorta af.Zodra de adventitia volledig is verwijderd, brengt u de adventitia en de aorta over naar afzonderlijke fax-buisjes. Voeg vervolgens 2,5 milliliter van de eenmaal aorta-dissociatie-enzymoplossing toe aan de aorta en de adventitia. De aorta kan in kleinere stukjes worden gesneden.Om de enzymatische digestie te vergemakkelijken, worden de aorta en adventitia nog eens 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Plaats na deze incubatie de buisjes met aorta- en adventitieweefsel op ijs. Bereid enkelcel-suspensies van de aorta en adventitia door gebruik te maken van cellzeefjes van 70 µm en zuigerstempels van spuiten om het resterende weefsel mechanisch te dissociëren.Breng de celsuspensies over naar vijfmilliliter polypropyleen Fax-buisjes. Pelleteer de cellen door middel van centrifugatie gedurende vijf minuten bij 400 ×g bij vier °C. Resuspendeer de cellen in één milliliter Fax-buffer en gebruik trypanblauw en een hemocytometer om de cellen te tellen.Aangezien de enzymatische behandeling de expressie van oppervlakteantigenen kan beïnvloeden, worden kleine stukjes milt gedurende één uur bij 37 °C geïncubeerd met of zonder het enzymcocktail. Bevestig na één uur het uitblijven van effecten op de experimentele expressie van oppervlakteantigenen via flowcytometrie.Label een passend aantal nieuwe experimentele en controle-faxbuisjes. Voeg de experimentele en controle-antilichaamcocktails voor de gewenste extracellulaire antigenen toe in een aparte set gelabelde buisjes. Plaats de cocktailbuisjes op ijs en dek ze af om de fluoroforen tegen licht te beschermen.Overbreng vervolgens een aliquot van vijf tot acht keer 10⁵ aortacelelllen en adventitiale cellen naar de overeenkomstige, vooraf gelabelde FACS-buisjes. Voeg één milliliter FACS-buffer toe aan elk buisje en pellet de cellen door centrifugatie. Verwijder het supernatant van de gepellette cellen door decanteren om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.Een kit voor het kleuren van levende en dode cellen, die fixatie toestaat, kan eerst worden gebruikt; maak een 1× live-dead-oplossing door één microliter heropgeloste live-dead-kleurstof toe te voegen aan één milliliter PBS en vortex voor menging. Voeg vervolgens 100 tot 200 microliters van de 1× live-dead-kleurstof toe aan de experimentele en controlemonstertubes. Incubeer de monsters daarna met de kleurstof gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.Incubeer de enkele controlebuis voor levend-dood bij 56 °C in het donker gedurende 10 minuten om de cellen door hittestok te doden. Was na de incubatie alle cellen met 1 mL PBS en pellet de cellen door middel van centrifugatie. Was vervolgens de cellen door 1 mL FACS-buffer aan elke buis toe te voegen.Vortex de buisjes om ze te mengen en pellet vervolgens de cellen door centrifugatie. Verwijder het supernatant van de cellen door deze af te gieten. Voeg 100 µL FC-blokkeringsreagens toe.Voeg Fax-buffer toe aan alle buisjes en vortex de buisjes voorzichtig om de cellen opnieuw te suspenderen. Incubeer de monsters 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was vervolgens de cellen zoals eerder beschreven.Verwijder het SUP natum van de cellen door te decanteren. Voeg 100 µL van het juiste antilichaamcocktail toe aan de overeenkomstige buisjes. Vortex voorzichtig om te resuspenderen.Resuspendeer de pellet en incubeer alle buisjes gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker na de extracellulaire kleuring van 20 tot 30 minuten. Was de cellen tweemaal zoals eerder beschreven, schenk het supernatant af en resuspendeer de gepelletteerde cellen in 300 µL 2% Paraformaldehyde; analyseer de monsters met een flowcytometer. De TER one 19 demonstreert dat gedigesteerde vaten en niet circulerend perifeer bloed de bron zijn voor de meeste van de geanalyseerde leukocyten in de aortacelsuspensie.TER 1 1 9 positieve rode bloedcellen maken 18% van de cellen uit in deze representatieve aortacelsuspensie. Dit geeft aan dat minder dan 0,02% van de cellen die uit aortacelsuspensies zijn geïsoleerd, afkomstig zijn uit bloed. De effecten van de enzymcocktail voor aortadissociatie op oppervlakteantigenen van cellen werden beoordeeld. De enzymcocktail heeft geen effect op de expressie van CD 45 of CD 19 zoals hier te zien is, noch op CD drie TCR, alpha beta TCR Gamma delta en diverse andere oppervlakteantigenen die niet in deze figuur zijn weergegeven.In de volgende figuren werden levende aortale CD 45-positieve leukocyten gegated om het percentage interferon gamma-positieve T-cellen binnen de aortapoel van twee jonge APO-lipoproteïne e-deficiënte muizen te bepalen. Hier worden de forward scatter- en side scatter-profielen van een representatieve APOE-aorta getoond; om uitsluitend leukocyten te analyseren, werd het gemeenschappelijke leukocytenantigeen CD 45 gebruikt om de aortale leukocyten te gaten, zoals hier te zien is. De kleine granulaire populatie langs de side scatter-as in het forward- en side scatter-profiel van de aortale leukocyten in deze figuur suggereert dat er necrotische cellen aanwezig zijn in onze leukocyten-gate; om deze cellen te verwijderen, werd live-dead aqua gebruikt om de levensvatbare leukocyten te gaten, die tot 30% van de representatieve populatie vormden die hier in deze figuur wordt getoond.De aanwezigheid van kleine, niet-granulaire cellen in het CD 45-positieve, live/dead-negatieve forward- en side-scatterprofiel suggereert dat er nog steeds cellulaire fragmenten aanwezig zijn in de CD 45-positieve, live/dead-negatieve gate. Er is een polygoon forward/side-scatter-gate getekend om alleen de grotere levensvatbare cellen in de analyse op te nemen, zoals hier te zien is. Onderzoek van de CD 45-positieve, live/dead-negatieve forward/side-scatterpopulatie op TCR Alpha Beta en interferon gamma onthult dat 6% van de levende aortale leukocyten TCR alpha beta-positieve, interferon gamma-positieve T-helper 1-cellen zijn. Met gebruik van een soortgelijk gating-schema als in de vorige reeks figuren, kunnen in de volgende figuren representatieve intracellulaire kleuringsgegevens worden gezien voor CD 68-positieve, CD 11 B-positieve macrofagen en interferon gamma-positieve, TCR alpha beta-positieve cellen van twee A P OE-null muizen die gedurende 12 weken een westers dieet kregen, zoals verwacht in deze figuur.De aorta van een APOE-null muis die een westers dieet heeft gekregen. De meerderheid van de leukocyten in de aorta zijn macrofagen, waarvan 40% dubbel positief zijn voor CD 68 en CD 11 B. Andere CD 11 B-positieve myeloïde cellen vormen 15% van de aortic leukocytenpopulaties binnen de milt van dezelfde APOE-null muis die een westers dieet heeft gekregen.7% van de levensvatbare SP-cyten waren CD 11 B-positieve CD 68-positieve macrofagen en 10% waren andere CD 11 B-positieve myeloïde cellen. In contrast hiermee zijn in deze afbeelding van een representatief, vergelijkbaar gekleurd isotype-controlemonster slechts 0,01% van de levensvatbare APOE-null-cyten foutief positief voor het isotype. Bovendien vormen binnen 12 weken bij APOE-null-muizen gevoed met een westers dieet, TCR alfa, bèta-positieve interferon gamma-negatieve T-helpercellen en interferon gamma-producerende TH1-cellen een groot deel van de aortainfiltrerende en miltresidente T-celpopulaties.Zoals te zien is in deze figuur, suggereert het onderzoek van aov, waarbij geen cyte is gekleurd met een isotypecontrole, dat slechts 0,5% van de TCR alpha beta positieve interferon gamma positieve cellen fout-positief zijn voor interferon gamma. Om de haalbaarheid aan te tonen van het isoleren van de aortale adventitia voor flowcytometrie-kleuring, worden hier representatieve CD 45 positieve leukocytenkleuringen voor aortale en adventitiale weefselcel-suspensies getoond. Infiltrerende CD 45 positieve leukocyten vormden ongeveer 18% van de adventitiale celsuspensie en 11% van de aortale celsuspensie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de reagentia en de cellen op ijs en in het donker moeten worden bewaard, tenzij anders vermeld.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u enkelcel-suspensies uit de aorta en de aortale adventitia isoleert en voorbereidt voor gebruik in flowcytometrie-experimenten.

flow-cytometry-analysis-of-immune-cells-within-murine-aortas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven procedures om atherosclerotische laesies in muismodellen te kwantificeren en te karakteriseren door middel van nauwkeurig snijden van de aortasinus en de ascenderende aorta, gecombineerd met histochemische en immunohistochemische analyse.

Kwantitatieve analyse en karakterisering van atherosclerotische laesies in de muis aortasinus

Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.

Intracellulaire kleuring en flowcytometrie om lymfocyten in muizen Aorta, nieren en lymfeklieren te identificeren in een Model of Hypertension

Dit document beschrijft een werkwijze voor het meten van alloreactiviteit in een gemengde populatie van T-cellen met behulp van beeldvorming flowcytometrie.

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.

Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

Wij stellen voor een gestandaardiseerde protocol karakteriseren de cellulaire samenstelling van laat-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies met inbegrip van systematische methoden voor dierlijke dissectie, weefsel insluiten, afdelen, kleuring en analyse van brachiocephalic slagaders van atheroprone gladde spieren cel lineage tracering muizen.

Kwantitatieve analyse van cellulaire samenstelling in geavanceerde atherosclerotische laesies van de gladde spieren cel Lineage-Tracing muizen

Hier presenteren we een protocol voor immunofluorescentie kleuring om de endotheliale cellen van de muis aorta direct te observeren. Deze techniek is nuttig bij het bestuderen van het cellulaire en moleculaire fenotype van endotheel cellen in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose.

Met en gezichts immunofluorescentie kleuring om vasculaire endotheel cellen direct te observeren

Hier beschrijven we een gedetailleerd en reproduceerbaar stroomcytometrieprotocol om monocyten/macrofaag en T-celsubsets te identificeren met behulp van zowel extra- als intracellulaire kleuringstesten in de murine milt, beenmerg, lymfeklieren en synovaal weefsel, gebruikmakend van een gevestigd chirurgisch model van murineartrose.

Flow Cytometrie Analyse van immune cell subsets binnen de Murine Milt, Beenmerg, lymfeklieren en synoviale weefsel in een artrose model

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.

FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

Leer flowcytometrie-analyse van immuuncellen in murine aorta en adventitia. Deze methode karakteriseert leukocytenfenotypes en ondersteunt onderzoek naar atherosclerose en vasculaire ontsteking.

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Meer video's verkennen