Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

Het algemene doel van deze procedure is om de plooiing van eicellen in metafase twee te beoordelen. Begin na experimentele manipulatie met het verzamelen van volgroeide muizeicellen van geprimede, seksueel volwassen vrouwtjes. Micro-injecteer vervolgens de oocyten met de gekozen materialen om het eiwit van belang te verstoren en laat de oocyten in vitro rijpen tot metafase van meiose twee. Stimuleer daarna de chromosoomspreiding in de eicel door behandeling met mantro, wat resulteert in een monopolaire spoel.

Uiteindelijk kunnen deze resultaten de ploidiestatus van de eicel weergeven via immunofluorescentie en confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de voortplantingsbiologie en het veld van chromosoomsegregatie, zoals het begrijpen van de moleculaire mechanismen die leiden tot aneuploïdie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de micro-injectietechniek moeilijk aan te leren is omdat verschillende stappen schriftelijk lastig over te brengen zijn. Injecteer seksueel volwassen vrouwelijke muizen intraperitoneaal met vijf IU's zwanger-merrie serumgonadotropine om het aantal antrale follikels dat uit elke muis wordt geïsoleerd te maximaliseren.

Warm ongeveer 48 uur na de PMSG-priming drie milliliter opvangmedium per muis op tot 37 °C en laat dit equilibreren. Laat één milliliter kweekmedium gedurende ten minste één uur equilibreren. Breng van beide vloeistoffen microdruppels aan in een Petrischaal en bedek deze met minerale olie.

Plaats nu de kweekschaal in de incubator en de schaal met opvangmedium op een objectglasverwarmer. Offer de muis, dissecteer de eierstokken en plaats deze in een horlogeglas met voorverwarmd opvangmedium.

Bevestig de eierstokken aan de schaal met een insulinespuit van één milliliter en laat de antrale follikels vrij door ze meerdere keren door te prikken met aan elkaar bevestigde naalden van gauge 27. Verzamel onder een dissectiemicroscoop cumulus-oocytencomplexen met een mond-bediende glazen pipet. Verzamel uitsluitend grote antrale follikels en geen kleinere pre-antrale follikels of gedenudeerde oocyten.

Breng de complexen over naar een microdruppel van het voorbereide opvangmedium met een kleine pipette die iets groter is dan de diameter van de oocyt. Verwijder de cumuluscellen van de complexen. Breng de gedenudeerde oocyten met een grotere pipette over naar een microdruppel kweekmedium.

Laat de oocyten minstens één uur herstellen in de incubator vóór de manipulatie. Maak injectiepijpetten door borosilicaatglas capillaire buisjes uit te trekken met een mechanische puller. Verwijder de mediakamer uit een chamber slide met één putje.

Om een micro-injectieplatform te creëren, plaatst u een druppel van 5 µL opvangmedium zo dicht mogelijk bij een druppel van 0,5 µL SIR N-A-C-R-N-A of morpholino-oligonucleotide-injectiemateriaal, bedekt met minerale olie, en plaatst u dit op de objecttafel van de microscoop. Plaats de injectie- en houdoppipetten in de houders en positioneer deze in de druppel opvangmedium. Zet de stikstoftanks die verbonden zijn met de pico-injector en de trillingsvrije tafel aan.

Open de punt van de injectiepipet door deze voorzichtig tegen de houderpipet te tikken terwijl u de pipet vult met medium. Breng vijf tot 10 oocyten uit de incubator over naar de druppel collectiemedium op het platform. Stel nu de parameters van de pico-injector in op een injectievolume van vijf tot 10 picoliter terwijl u op clear drukt.

Beweeg de injectienaald naar de druppel met materiaal en vul deze. Breng de naald vervolgens terug naar de druppel met medium. Gebruik de vasthoudpipet om een oöcyt vast te pakken en lijn de injectienaald, oöcyt en vasthoudpipet uit langs de x-as.

Beweeg bij een hogere vergroting de injectiepipet door de oocyte, waarbij u er zorgvuldig op let de nucleus te vermijden. Zodra het plasmamembraan is doorboord, drukt u op injecteren. Trek na de injectie de naald terug, laat de oocyte los en herhaal dit proces. Wanneer alle oocyten zijn geïnjecteerd, plaatst u ze terug in de incubator om ze gedurende de gewenste tijd, gewoonlijk tussen 12 en 24 uur, in cultuurmedium te houden.

Was vervolgens de cellen door verschillende druppels CZB en breng ze over naar een microdruppel CZB onder olie; incubeer deze gedurende 16 uur om de rijping tot de metafase van meiose twee te voltooien. Plaats 750 µL CZB met 100 µM Mastri in de put van een organ cultuurplaat met water in de buitenring. Was nu de eitjes door verschillende druppels CZB plus mastri, breng ze vervolgens over naar de organ cultuurplaat en incubeer ze gedurende een uur.

Fixeer de eitjes in een horlogeglas met 2% paraformaldehyd in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Breng de eitjes vervolgens over in blokkeringsoplossing en bewaar deze bij vier graden Celsius tot het permeabel maken van de eitjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Spoel daarna meerdere keren met grote volumes blokkeringsoplossing.

Voer de rest van de procedure uit op het deksel van een 96-wellplaat die in een bevochtigingskamer tegen licht is beschermd. Breng de eitjes bij kamertemperatuur over naar druppels van 25 µL blokkeringsoplossing voor 15 minuten. Om de centromeren te labelen, brengt u de eitjes vervolgens over naar een druppel blokkeringsoplossing met Crest-antiserum in een verdunning van 1:40 en incubeert u deze gedurende ten minste één uur.

Was daarna met drie druppels blokkeeroplossing, waarbij telkens 15 minuten wordt geïncubeerd. Breng de eitjes over naar een druppel blokkeeroplossing met fluoro-vier-geconjugeerd antilichaam en incubeer gedurende één uur. Was twee keer met blokkeeroplossing om de chromosomen te detecteren.

Incubeer in een verdunning van 1:5.000 van cytx green en blokkeringsoplossing; monteer de monsters in 5 µL Vector Shield. Breng vier kleine stipjes vaseline aan op de beoogde posities van de hoeken van het dekglas om te voorkomen dat de eitjes worden geplet. Plaats het dekglas en verzegel dit met nagellak; bewaar in een objectglazendoos bij 4 °C tot verwerking via confocale microscopie. Leg tijdens het beelden met een 100x objectief stappen van 0,4 µm vast in het Z-vlak en beeld het volledige gebied van de metafase af; tel de centromeren met behulp van beeldsbehandelingssoftware zoals Image J van de NIH. Euploïde muizeitjes bevatten 20 kinetochore-paren, wat resulteert in 40 stippen in totaal in deze Z-projectie van een euploïde metafase II-eitje. DNA is groen gekleurd en kinetochoren zijn rood gekleurd.

De pijlen wijzen naar twee verschillende chromatidenarmen die overlap aangeven bij kinetochoor nummer 17 en nummer 18, na de microinjectieprocedure. Andere methoden zoals Western blotting, real-time PCR, beoordelingen van de spoelconfiguratie en chromosoomuitlijning en in vitro fertilisatie kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe perturbatie van het eiwit van interesse de mitotische rijping en het ontwikkelingspotentieel beïnvloedt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u alle sites kunt manipuleren en de PLO van metafase II-oocyten kunt beoordelen.