Name: De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer de cremaster-spierpreparatie voor intravitale microscopie bij muizen. Deze methode maakt visualisatie van microcirculatie en bloedstroomregulatie mogelijk voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in de auteurs &#39;laboratorium wordt ondersteund door de National Institutes of Health beurzen R37-HL041026, R01-R01-HL086483 en HL056786 (SSS) en door F32-HL097463 en T32-AR048523 (PB) van de Verenigde Staten Public Health Service.

1. Muis boord, spier voetstuk, body wig en superfusie oplossing <ol><li> Muis boord: Een transparante plexiglas rechthoekige bord (6 "breed X 8" lang x 3 / 16 "dik) is gemaakt om te passen op het podium van de microscoop The." Muis boord "is waar de verdoofde muis is beveiligd tijdens chirurgische voorbereiding van de de cremaster spier. </li><li> Muscle voetstuk: Een transparante silastic rubber voetstuk wordt bereid uit Sylgard 184, dat wordt gemengd volgens de fabrikant ° S instructies. Een handige mal is een 15-mm dik x 50 mm diameter wegwerp petrischaal. De Sylgard blok wordt gesneden om de gewenste vorm met een scheermesje (zie figuur 1C.). Een dunne laag van duidelijke waterdichte silicone lijm wordt gebruikt om de Sylgard te blokkeren om de muis raad van bestuur veilig te stellen. Handige tips: Na het gieten van de Sylgard in de petrischaal, ontgassing in een vacuüm kamer voor een uur verwijdert luchtbellen en verbetert de helderheid. Na ontgassing, uithardingstijd voor Sylgard wordt verkort door het plaatsen van de schotel in een laboratorium oven op 50 ° C gedurende enkele uren. </li><li> Lichaam wig en verwarming platform: A wig (2 "x 4" x 15 °) geplaatst onder de muis en tegen het voetstuk kantelt het lichaam naar voren dat vergemakkelijkt de uitbreiding van de cremaster spier boven de sokkel van zijn oorsprong. Het opnemen van een aluminium platform op het oppervlak zorgt voor geleidende warmte. Het platform wordt verwarmd door weerstanden aangesloten op een DC-voeding (figuur 1A). Kalibreren van het platform temperatuur tot ~ 40 ° C houdt slokdarmkanker temperatuur op ~ 37 ° C. Anders wordt stralingswarmte van een lamp wordt gebruikt. </li><li> Pins. Om te zorgen voor de cremaster spier op het voetstuk, zijn de pinnen bereid uit 0,15 mm insect pinnen die zijn gebogen in een "L" vorm. </li><li> Fysiologische zoutoplossing (PSS). De voorbereidingen zijn superfused (geïrrigeerd) continu met bicarbonaat-gebufferde PSS bereid in ultrapuur (18,2 MΩ) H 2 O. Stock oplossingen worden voorbereid op 20X uiteindelijke werk concentratie en gesteriliseerd door een 0,2 um filter. Stamoplossingen nog goed voor enkele weken indien bewaard bij 4 ° C. Voorbereiden zouten los van de bicarbonaat en mengen ze met verdunning op de dag van het experiment voorkomt dat de neerslag van calcium bicarbonaat. De voorraad zout-oplossing bestaat uit (in mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23,4 CaCl 2. De voorraad bicarbonaat is 360 NaHCO 3. Op de dag van een experiment worden respectievelijke oplossingen gebracht tot een uiteindelijk volume (normaal 2 L voor een bepaalde experiment) in een maatkolf en geplaatst in een waterbad van ~ 37 ° C. Equilibreren de PSS met 5% CO 2 / 95% N 2 voor ~ 15 minuten met behulp van een gas dispergeerinrichting past de pH tot ~ 7,4 en voorkomt neerslag. De PSS is voortdurend borrelen met 5% CO 2 / 95% N 2 in de hele experimenten. De uiteindelijke samenstelling van werkende oplossing (in mmol / L) is: 132 NaCl, KCl 4,7, 1,2 MgS0 4, 2 CaCl2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. Anesthesie en de voorbereiding voor de operatie <ol><li> Na goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite, worden mannelijke muizen ten minste 12 weken oud gebruikt. De muis is verdoofd met pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) injectie. Een straatverbod buis blijkt nuttig voor het vastzetten van de muis tijdens de eerste injectie. Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen, wordt verdoving onderhouden door supplementen (10-20% van de eerste injectie, ip) als nodig is (elke 30-60 minuten, aangeduid met terugtrekking reactie op teen of staart knijpen). Tip: Verdunnen de pentobarbital 10 mg / ml in steriele zoutoplossing voor injectie vermindert de mogelijkheid van een overdosis. </li><li> Anesthesie compromissen temperatuurregeling, zodat de muis moet warm gehouden worden direct na de eerste injectie. Het plaatsen van de muis in een metalen drager (geventileerd aluminium mand) op de top van een verwarmingsplaat (gekalibreerd tot ~ 37 ° C) werkt goed. Als alternatief kan een warmte-lamp worden gebruikt en zorg ervoor dat positie op een gepaste afstand van de muis. De muis moet worden gecontroleerd elke 5-10 minuten, totdat het geschikte niveau van de anesthesie wordt bereikt (het ontbreken van terugtrekking tot teen of staart knijpen). Een aanvullende dosis kan nodig zijn na 15-20 minuten. Het is het beste om geduldig te zijn en met de nodige voorzichtigheid te gaan om overdosering te vermijden, vooral met overgewicht of oude dieren. </li><li> Het haar wordt verwijderd uit de onderbuik, onderrug, scrotum en benen door het zorgvuldig scheren respectieve regio's. Bijzondere aandacht moet worden genomen om trauma te voorkomen het scrotum en de testikels, die anders zal verwonden cremaster spier. Verwijder de losse haren met een nieuw alcoholdoekje. </li><li> Als de blaas vol is zal het voelen als een kleine druif door de buikwand. Leeg de blaas met behulp van zachte druk om de muis te voorkomen dat urineren op de cremaster voorbereiding tijdens de experimenten. Een Kimwipe is een effect spons om collectievet de urine. </li><li> Plaats de muis op zijn rug, liggend op de wig met zijn benen aan weerszijden van het voetstuk. Een zijden hechtdraad (4-0 of 5-0) vastgebonden aan elke voet zorgt voor een ketting voor het beveiligen van de muis met zijn kruis tegen de sokkel. Een stuk van de tape losjes geplaatst over de borst en bevestigd aan de wig houdt algemene lichaamshouding. Chirurgische ingrepen worden uitgevoerd terwijl u door middel van een stereomicroscoop met microdissectie schaar en pincet schuin. </li></ol> 3. Chirurgische de voorbereiding van de open cremaster spier <ol><li> Een pin is geplaatst via de apex van de scrotum sac (de linker-of rechterkant) en vastgezet in het voetstuk om de spanning op de huid plaats. Superfusie met PSS (34-35 ° C) wordt gestart over de chirurgische veld en gedurende de gehele dissectie om de blootgestelde weefsel warm en vochtig. Een lont (gemaakt van Kimwipe) geplaatst met een uiteinde naast het scrotum sac en de andere naast een vacuüm lijn verwijdert het effluent PSS. Een kraal van siliconenkit gehandeld op grond van het plexiglas bord en volledig rondom de wig en het voetstuk dient als "gracht" aan een PSS dat niet is opgezogen verzamelen, die als een effectieve voorzorgsmaatregelen om PSS lekkage te voorkomen op de microscoop. </li><li> Wordt een incisie gemaakt langs het ventrale oppervlak van de scrotum sac. Als de testikel is ingetrokken door de cremaster spier in de buikholte, zachte druk op de onderbuik leidt de testikel in de zak. Het oppervlak van de cremaster spier bovenliggende de testikel moeten worden geïdentificeerd op dit moment. Bindweefsel tussen het scrotum huid en de cremaster spier is zorgvuldig verwijderd om de cremaster spier vrij te zijn van het omringende weefsel. </li><li> Het scrotum huid is zacht teruggetrokken achter de proximale rand van de sokkel en vastgezet aan beide zijden met een speld. Het buitenoppervlak van de cremaster spier oppervlak wordt dan vrijgegeven van bindweefsel. Continu superfusie tijdens dissectie hydrateert het bindweefsel, het vergemakkelijken van zichtbaarheid en verwijdering. </li><li> Een pen door de apex van de cremaster spier wordt gebruikt om het te plaatsen onder longitudinale spanning. Een longitudinale incisie wordt gemaakt door de ventrale oppervlak van de spier met grote zorg genomen om verstoring van de bloedtoevoer te minimaliseren. Bloedstroom dynamiek in de buurt van de periferie van het preparaat worden gewijzigd door dit weefselschade 14. Dan ook, te minimaliseren om deze effecten op het verzamelen van gegevens, de bloedvaten dicht bij het centrum van de voorbereiding worden gebruikt voor de beeldvorming en fysiologische studies. </li><li> De cremaster spier is verbonden door een dunne ligament aan de bijbal onder de testikel. Als gevolg van de testikel aan de ene kant blootstelt dit ligament, die zorgvuldig is gescheiden van de bijbal. De buurt van de top van de cremaster spier kleine slagader en ader aan te sluiten op de bijbal. Afsluitende deze schepen tussen de tang en trek ze uit elkaar minimaliseert bloeden. De teelbal, bijbal, testiculaire slagader en ader zijn proximaal afgebonden (4-0 of 5-0 zijden hechtdraad), afgehakte en weggegooid (orchidectomie) samen met de bijbehorende inguinale vet pad. Als alternatief kan de testikel terug te voorzichtig worden geduwd in de buikholte en behouden met een stukje katoen of Kimwipe. De orchidectomie dient om mogelijke trauma's te vermijden om het weefsel bij het duwen van de testes terug in de buikholte. We hebben niet gevonden opvallende verschillen in de kwaliteit van de cremaster microcirculatie voorbereiding (zie paragraaf 3.8) met behulp van de procedure 7,15. </li><li> De buitenkant van de cremaster spier verwijdering van de resterende bindweefsel en vervolgens verspreid radiaal op het oppervlak van de sokkel. De randen zijn vastgezet met pennen (zie paragraaf 1.4) in 5-6 plaatsen om een ​​vlakke plaat van de dwarsgestreepte spier met intacte microcirculatie te creëren. </li><li> Het ingevulde voorbereiding is overgebracht naar het stadium van een intravitale microscoop, superfused continu (3-5 ml / min, 34 ° C) en in evenwicht gedurende 30 minuten. </li><li> De integriteit van de cremaster voorbereiding is de hand van verschillende criteria. Spontane vasomotorische toon met een minimale chirurgisch trauma wordt aangegeven door fikse stroming in arteriolen en een gebrek van het aanklevende leukocyten in venulen. De meest gevoelige index van een responsieve preparaat is vernauwing van de arteriolen aan het verhogen van de superfusie oplossing zuurstofgehalte gedurende 5-10 minuten. Dit wordt gedaan door equilibreren met 21% O 2 (tegenover 5% O 2; zie paragraaf 1.5, alle met 5% CO 2, balans N 2). De aanwezigheid van leukocyten in arteriolen, de afwezigheid van rode bloedcellen die via capillairen, en / of leukocyten zich ophopen in venulen en het omliggende weefsel zijn tekenen van weefselbeschadiging en ontsteking. </li></ol> 4. Intravitale beeldvorming van de cremaster spier microcirculatie <ol><li> Intravitale beeldvorming wordt uitgevoerd op een aangepaste microscoop op basis van een Olympus MVX10 Stereo Zoom platform. De MVX10 microscoop lichaamis gemonteerd op een MVX10 hybride stand uitgerust met transilluminatie (halogeen lamp) voor helderveld (Köhler) beeldvorming en met epi-verlichting (kwiklamp) voor fluorescentie beeldvorming. Met behulp van epi-verlichting, is GCaMP2 enthousiast op 472/30 nm met emissie verzameld op 520/35 nm. Beelden worden verkregen door middel van een MV PLAPO 2XC lens (numerieke apertuur = 0,50; Olympus) met behulp van een XR/Mega-10 geïntensiveerd digitale camera (Stanford Fotonica, Inc, SPI) via Piper Control Software (SPI) op een personal computer. Met dit systeem kan de waargenomen gezichtsveld (FOV) worden gevarieerd van 553 micrometer X 442 micrometer tot 22 mm X 18 mm. </li><li> Na voltooiing van intravitale imaging experimenten, is het onder narcose muis inslapen met een overdosis pentobarbital, gevolgd door cervicale dislocatie. </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Mouse bord voor intravitale beeldvorming van de muis cremaster voorbereiding. A) Body wig met aluminium platform (geïsoleerd met gele plastic) gezien vanaf de onderkant. Verwarmingsweerstanden bevestigd aan de onderkant van het platform uitgevoerd warmte. B) De verwarming platform rust op een kunststof wig. C) Het lichaam wig wordt geplaatst op een plexiglas bord voor de operatie en de daaropvolgende overdracht naar het stadium van de intravitale microscoop. Sylgard voetstuk wordt aangegeven met rode pijl. Een kraal van waterdichte silicone omringt de gehele voorbereiding aan een oplossing die kan lekken tijdens de intravitale procedure, te voorkomen dat het druppelen op de microscoop bevatten. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Custom MacroZoom microscoop voor groothoek beeldvorming. A) MVX10 microscoop body (Olympus) met XR/Mega-10 ICCD camera (Stanford Photonics) gemonteerd op trinoculaire poort. B) Close-up van de microscoop lichaam. (A) zoomfunctie (0,63 tot 6.3X), (b) filter wiel; (c) beeld verdubbelaar (NA = 0,50 met 25x optische vergroting). C) substadium condensor voor helderveld (Köhler) verlichting (condensor NA = 0.55, werkafstand = 27 mm). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voltooide muis cremaster voorbereiding. Verdoofde muis in rugligging op warme geplastificeerd aluminium platform (geel). Lichaamshouding is beveiligd met tape. De cremaster spier is radiaal verspreid over de transparante silastic rubberen voetstuk en vastgepind aan de randen. Superfusie oplossing is geïntroduceerd op de proximale uiteinde door middel van een plastic druppelaar (witte pijl). Een vacuüm lijn (witte pijlpunt) verwijdert de oplossing via een Kimwipe lont. Twee micropipetten getoond gepositioneerd met hun tips in het weefsel. Een referentie-elektrode (zilver draad) is bevestigd aan de onderste rand van de cremaster spier. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Illustratie van de vergroting bereik voor het visualiseren van netwerken arteriolaire uiten GCaMP2 in endotheel. A) TL en B) helderveld foto genomen op een optische vergroting van 3,2 x voor een totale vergroting = 42X op de video-monitor. [Field of view (FOV) = 4375 x 3470 um]. Schaalbalk = 500 pm. Werken bij deze vergroting vergemakkelijkt het plaatsen van micropipetten op de gewenste locaties. C) TL-en D) helderveld foto genomen op optische vergroting van 6.4X voor een totale vergroting = 83X (FOV = 2200 x 1759 um). Schaalbalk = 200 micrometer. E) TL-en F) helderveld foto genomen op optische vergroting van 12.6X voor een totale vergroting = 165X (FOV = 1100 x 885 um). Schaalbalk = 100 micrometer. G) Met afbeelding doubler, optische vergroting = 25.2X. Schaalbalk = 50 pm.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

Alle procedures en protocollen met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Missouri en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en gebruik van proefdieren. De productie van deze video-artikel is gesponsord door Stanford Photonics.

Hier beschrijven we de open cremaster spier voorbereiding op de muis voor het observeren van de microcirculatie in vivo. Deze procedure is gemodelleerd naar de &quot;open&quot; cremaster voorbereiding voor het eerst beschreven in de rat 4. De praktijk van de gehele chirurgische procedure kan worden afgerond in minder dan een uur. De veelzijdigheid van dit preparaat zorgt voor een verscheidenheid van experimentele manipulaties en gemakkelijk aangepast aan de hamsters en ratten, waardoor een groot aantal experimentele modellen bestudeerd worden op dezelfde manier. Het preparaat is beperkt tot de mannelijke dieren en metingen moeten worden gemaakt naar het midden van het weefsel, het vermijden van beschadigde gebieden aan de randen van de spier 14. Er moet ook worden erkend dat, hoewel de druk en flow distributies zijn gewijzigd wanneer onderling verbonden schepen van de cremaster spier zijn 16 gesneden, microvaten blijven reageren en geschikt voor reproduceerbare het verzamelen van gegevens. De belangrijkste beperking bij het visualiseren van de microcirculatie in de cremaster spier is de opbouw van bindweefsel als dieren volwassen en in omvang toenemen, met name bij ratten, maar ook bij hamsters. Verder, als dieren vet te krijgen, wordt het moeilijker om de anesthesie te controleren, omdat pentobarbital is lipofiel en kan worden opgenomen in het vetweefsel. De beste manier om verder te gaan wordt door geduld, terwijl ervoor te zorgen dat het dier ° s lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd op ~ 37 ° C, terwijl blootgesteld weefsel wordt continu bevloeid met PSS.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens of het apparaat </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Natrium Chloride </td><td> Visser </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> Kalium Chloride </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesium Sulfaat </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium Chloride </td><td> Sigma </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Visser </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> Nembutal Natrium Solution </td><td> Lundbeck </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> Ook wel aangeduid als natriumpentobarbital </td></tr><tr><td> Temperatuurregelaar </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td> Alternate: regelbaar 12V DC voeding </td></tr><tr><td> Series 20 platform heater kit RH-2 </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0274 </td><td> Vereist custom-built aluminium plaat </td></tr><tr><td> Mega-10 Camera </td><td> Stanford Photonics </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC lens </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 hybride stand </td><td> Leeds </td><td> LBX-Hybride </td><td></td></tr><tr><td> Piper Control Software </td><td> Stanford Photonics </td><td></td><td> Programma voor Mega-10 camera </td></tr><tr><td> Stereo Microscope </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> Waterdichte Silicone Sealant (Clear) </td><td> General Electric </td><td> 47,970 tot 72643-LW5000 </td><td> Andere duidelijke siliconen werken ook </td></tr><tr><td> 60 x 15mm Petri Dish </td><td> Visser </td><td> 08 tot 757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Microdissectie Schaar </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont Forceps </td><td> Fijn Science Tools </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore Express PLUS Membrane </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens Insect Pins </td><td> Austerlitz </td><td> M maat 0,15 mm </td><td></td></tr><tr><td> Compact Pet Trimmer </td><td> Wahl Clipper Corp </td><td> Model 9966 </td><td> Reinig na elk gebruik </td></tr></tbody></table>

de muis cremaster muscle voorbereiding voor intravitale imaging van de microcirculatie

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Door het hele lichaam, het onderhoud van homeostase vereist de constante toevoer van zuurstof en voedingsstoffen in samenhang met de verwijdering van metabolische bijproducten. Dit evenwicht wordt bereikt door de beweging van bloed door de microcirculatie, waardoor de kleinste vertakkingen van de vasculaire aanbod in alle weefsels en organen omvat. Arteriolen tak van de slagaders naar netwerken die de distributie en de omvang van zuurstofrijk bloed stroomt in de veelheid van haarvaten nauw verbonden met parenchymcellen controle te vormen. Haarvaten zorgen voor een groot oppervlak voor diffusie-uitwisseling tussen weefsel cellen en de bloedtoevoer. Venulen verzamelen capillaire afvalwater en convergeren als ze terugkeren zuurstofarme bloed naar het hart. Te observeren deze processen in real-time vereist een experimentele aanpak voor het visualiseren en manipuleren van de levende microcirculatie. De cremaster spier van ratten werd voor het eerst gebruikt als een model voor het bestuderen van ontsteking met behulp van histologie en elektronenmicroscopie post mortem 1,2. De eerste in-vivo-verslag van de blootgestelde intacte rat cremaster spier onderzocht microvasculaire reacties op vasoactieve geneesmiddelen met behulp van gereflecteerd licht 3. Maar kromming van de spier en het gebrek aan gerichte verlichting beperkt het nut van deze voorbereiding. De grote doorbraak gepaard opening van de spier, losgemaakt van de zaadbal en de verspreiding van het radiaal als een vlakke plaat voor transilluminatie onder een samengestelde microscoop 4. Terwijl aangetoond dat het een waardevolle voorbereiding op de fysiologie van de microcirculatie in ratten en hamsters 5 6 studiepunten worden, heeft de cremaster spier in muizen 7 bewezen bijzonder nuttig in het ontleden van cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij het ​​reguleren van microvasculaire functie 8-11 en real-time beeldvorming van intercellulaire signalering 12. De cremaster spier is afgeleid van de interne schuin en dwars abdominus spieren als de testes afdalen via de lies kanaal 13. Het dient ter ondersteuning van (Grieks: cremaster = suspender) en de temperatuur van de testikels te behouden. Zoals hier beschreven, is de cremaster spier bereid als een dunne vlakke plaat voor een uitstekende optische resolutie. Met de muis op een stabiel lichaamstemperatuur en vlak van anesthesie, chirurgische voorbereiding impliceert het bevrijden van het spierweefsel van de omringende weefsel en de testes, het verspreiden van het op transparante sokkel van silastic rubber en het veiligstellen van de randen met insect pinnen, terwijl het voortdurend irrigeren met fysiologische zoutoplossing . Het huidige protocol maakt gebruik van transgene muizen die GCaMP2 in arteriolaire endotheelcellen. GCaMP2 is een genetisch gecodeerd fluorescentie calcium indicator molecule 12. Groothoek beeldvorming en een intensievere charge-coupled device camera in staat stellen in vivo studie van calcium signalering in het arteriolaire endotheel.

Een weefsel voorbereiding is beschreven voor visualisatie en experimentele manipulatie van de levende microcirculatie. In verdoofde mannelijke muizen, is de dunne, zeer goed doorbloede cremaster spier voorbereid intravitale microscopie tot microvasculaire netwerken, inclusief arteriolen, capillairen en venulen studie. Dit preparaat wordt gemakkelijk aangepast voor ratten en hamsters.

De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

In het hele lichaam vereist het behoud van homeostase een constante toevoer van zuurstof en voedingsstoffen, gelijktijdig met de verwijdering van metabole...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van de musculus cremaster om de levende microcirculatie van een geanestheseerde mannelijke muis te bestuderen. Deze chirurgische ingreep begint met een incisie op het ventrale oppervlak van het scrotum. Nadat het gebied is geschoren, is de volgende stap het vrijmaken en scheiden van de musculus cremaster van het omringende weefsel.Vervolgens wordt een orchiectomie uitgevoerd en wordt het weefsel radiaal verspreid over het oppervlak van een transparante voet. Deze preparaat kan via microscopie worden bekeken om de microcirculatie binnen de m. cremaster in beeld te brengen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen hoe de bloedstroom en zuurstoftoevoer feitelijk worden gereguleerd in levende systemen tijdens gezonde toestanden en ziekte modellen, en als reactie op experimentele manipulaties.Deze methode kan worden gebruikt om basisvragen in cardiovasculair medisch onderzoek te beantwoorden, met een nadruk op de microcirculatie. In het bijzonder hoe de bloedstroom en zuurstoftoevoer op cellulair niveau in het intacte systeem kunnen worden gereguleerd. Deze methode kan inzicht bieden in de in vivo functie van de microcirculatie bij de muis.Het kan ook worden toegepast op andere knaagdiermodellen, zoals hamsters en ratten. Om de muis onder de microscoop te stabiliseren, moet er wat nieuwe apparatuur worden klaargezet. Begin met het maken van een transparante, rechthoekige plexiglasplaat die op de objecttafel van de microscoop past.Bouw vervolgens een transparant voetstuk van Sylgard 180, gegoten in een Petri-schaal. Om de 15 millimeter aan te passen, wordt de gegoten Sylgard gedegasseerd in een vacuümkamer gedurende een uur. Om luchtbellen te verwijderen en de helderheid te verbeteren, wordt de gedegasseerde Sylgard gedurende ongeveer vier uur uitgehard in een oven van 50 °C.Zodra het is uitgehard, snijdt u de voet in de vorm van een pentagon met een afgeronde bovenkant. Bevestig vervolgens het voetblok aan de rechthoekige plexiglasplaat met een dunne laag transparante waterdichte siliconenkit en laat de siliconen een nacht uitharden. Bouw daarna een wigvormig platform om de muis tegen de voet te positioneren.Het wigplatform kan worden gemaakt van acrylplastic, en een warmtelamp kan worden gebruikt om het preparaat warm te houden. Als alternatief kan aluminium op een plastic wig worden gemonteerd. Het aluminium wordt verwarmd met behulp van resistieve verwarmingselementen die zijn aangesloten op een DC-stroombron.Ten slotte wordt op de dag van het experiment de carbonaatgebufferde PSS bereid in ultrapuur water. Door de zouten op de dag van het experiment te mengen, wordt neerslag van bicarbonaten voorkomen. Bewaar de PSS in een waterbad bij 37 °C en breng de PSS gedurende 15 minuten in evenwicht met 5% koolstofdioxidegas in stikstofgas met behulp van een gasdiffuseur.Dit stelt de pH in op ongeveer 7.4 en voorkomt verdere neerslag van zouten. Nadat een volwassen muis is gebenestheseerd, scheert u voorzichtig het haar van de onderbuik, de onderrug, het scrotum en de poten. Wees extra voorzichtig rond het scrotum en de teelballen om beschadiging van de onderliggende m. cremaster te voorkomen.Verwijder losse haren met een nieuw alcoholswabje. Controleer of de blaas vol is. Als de blaas vol is, voelt deze door de buikwand aan als een kleine druif; maak deze in dat geval leeg.Oefen lichte druk uit en houd de punt van een kim wipe naast de penis om de urine op te vangen. Plaats de muis nu op de rug, liggend op het wigplatform met de poten over de steunvoet heen, en zet de muis vervolgens vast met de kruis tegen de steunvoet. Om de positie te behouden, brengt u een stuk tape losjes aan over de borst en bevestigt u dit aan het platform.Begin de operatie door een pin door de apex van de scrotale zak en in het voetstuk te bevestigen, zodat er spanning op de scrotale huid komt te staan. Start nu een superfusie van PSS over het operatieveld en handhaaf deze gedurende de gehele dissectie. Om het uitstromende PSS te verwijderen, wordt een Kim wipe geplaatst met één uiteinde naast de scrotale zak en het andere uiteinde naast een vacuümlinie.Maak met een microdissectieschaar, terwijl u de huid met een gebogen pincet vasthoudt, een verticale incisie langs het ventrale oppervlak van de scrotumzak indien de teelbal door de m. cremaster in de buikholte is teruggetrokken. Door zachte druk uit te oefenen op de onderbuik wordt de teelbal naar de zak geleid. Identificeer nu het oppervlak van de m. cremaster, die over de teelbal ligt, en verwijder voorzichtig het bindweefsel tussen deze spier en de scrotumhuid.Om de musculus cremaster bloot te leggen, wordt de scrotumhuid voorzichtig achter de proximale rand van de standaard teruggetrokken en aan weerszijden vastgezet. Maak vervolgens met de pincet het buitenoppervlak van de spier vrij van bindweefsel. Plaats een speld door de apex van de musculus cremaster om spanning aan te brengen en maak zeer voorzichtig een longitudinale incisie door het ventrale oppervlak; probeer hierbij verstoring van de vasculaire voorziening tot een minimum te beperken.De m. cremaster is via een dun ligament verbonden met de EPI's. Buig de testis onder de testis naar één zijde. Om dit ligament bloot te leggen, wordt het voorzichtig van de EPI's gescheiden.Nabij de apex van de cremasterspier bevindt zich een kleine gepaarde slagader en ader die verbonden zijn met de epididymis. Klem deze vaten tussen pincetten en trek ze uit elkaar om bloedingen te minimaliseren. Voer nu een orchiectomie uit, inclusief het proximale inguinale vetkussen, en ligeer de testikel, de epididymis en de testiculaire arterie en vene.Snijd ze vervolgens door en gooi ze weg. Verwijder het resterende bindweefsel van de musculus cremaster en spreid deze vervolgens radiaal uit over het oppervlak van het plateau. Zet de randen vast met vijf tot zes pinnen om een plat vel gestreept spierweefsel met een intacte microcirculatie te verkrijgen.Breng de voltooide preparatie over naar de tafel van een intravitale microscoop, continu gefuseerd op 34 °C en laat deze 30 minuten equilibreren. Voorafgaand aan de experimentele manipulatie of gegevensverzameling werden, met behulp van een aangepaste microscoop met veldverlichting en epi-verlichting, digitale beelden van de cremaster-preparatie verkregen onder veldverlichting. De spier werd gevisualiseerd bij vergrotingen van 42x, 83x en 165x onder fluorescentie. Na de ontwikkeling werd de spier gevisualiseerd bij vergrotingen van 42x, 83x, 165x en 330x.Deze techniek maakte het voor onderzoekers in de microcirculatie mogelijk om de mechanismen achter de regulatie van weefsel, bloedstroom, zuurstoftoevoer en ontsteking te bestuderen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het weefsel uiterst voorzichtig te behandelen om ervoor te zorgen dat de microvasculaire reactiviteit intact blijft.

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Microiontophoresis betekent verplaatsing van ionen uit een micropipet in reactie op een verschil in elektrische potentiaal tussen de binnen-en buitenkant van de micropipet. Biologisch actieve moleculen worden daarbij geleverd in verhouding tot elektrische stroom. We illustreren acetylcholine microiontophoresis in combinatie met micromanipulatie tot endotheel-afhankelijke vasodilatatie studie in de microcirculatie.

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

Digitale intravitale epifluorescentie microscopie van postcapillaire venulen in de cremasteric microcirculatie is een handige methode om inzicht te krijgen in leukocyten-endotheliale...

Real-time Digital Imaging van leukocyt-endotheliale Interactie in ischemie-reperfusie schade (IRI) van de Rat cremasterspier

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Deze studie toont de chirurgische voorbereiding van de rat cremaster spier voor de visualisatie van de in vivo cel-vrije laag. Aanzienlijke factoren die de nauwkeurigheid van de meting van de breedte van de cel-vrije laag beïnvloeden, worden in deze studie besproken.

Visualisatie en kwantificering van de Cell-vrij laag in van de rat cremasterspier

Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.

Leukocyten infiltratie van Cremaster Spier in muizen beoordeeld door Intravital Microscopie

Leer de cremaster-spierpreparatie voor intravitale microscopie bij muizen. Deze methode maakt visualisatie van microcirculatie en bloedstroomregulatie mogelijk voor cardiovasculair onderzoek.

De muis Cremaster Muscle Voorbereiding voor intravitale Imaging van de microcirculatie

Meer video's verkennen