Name: Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer een verbeterde methode voor de extractie van hoog moleculair gewicht DNA uit hypersaline microbiële matten. Deze techniek scheidt cellen van de matmatrix voor optimale DNA-kwaliteit en concentratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation Environmental Program Genomics (Grant No EF-0723707).

1. Microbiële cel Extractie: <ol><li> Homogeniseren microbiële matten met een steriele malen stamper door het mengen grondig. Plaats ongeveer alle 30 g (nat gewicht) van gehomogeniseerd mat materiaal in steriele verpakking van de Waring blender, voeg ongeveer 100 ml 1 M NaCl (of een concentratie die specifiek zijn voor monster in gebruik) en mix drie keer op de middelste stand gedurende 1 minuut met intermitterende koeling in een -20 ° C vriezer voor 1 minuut. Breng de slurry in een 250 ml centrifuge fles en vul de resterende lege ruimte met 1 M NaCl. Bereid NaCl-oplossing in geautoclaveerd DI-water en filter steriliseren het. </li><li> Verder los van de microbiële cellen van de matrix door schudden (150 rpm) met behulp van een vortexer (Vortex-Genie R 2) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij lage snelheid (500x g) gedurende 15 min bij 4 ° C. Voorzichtig overdracht het supernatant in een kolf met minimale verstoring van het sediment. </li><li> Met behulp van het ingehulde sediment, herhaalt mengen en de stappen 1.2 en 1.3 nog vier maal met de toevoeging van verse NaCl aan elke sediment pellet aan het einde van stap 1.3. Het supernatant van elke NaCl extractie wordt overgebracht in een verse fles. </li><li> Combineer de supernatanten van de 5 cel extracties en centrifuge in porties van 200 ml met hoge snelheid (25000 xg) gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant, elke cel pellet opnieuw in suspensie in 10 ml van 2% natriumhexametafosfaat, combineren pellets en maken het volume tot 200 ml met 2% natriumhexametafosfaat. Was cellen door te schudden (150 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aan het eind van deze stap moet u slechts een tube van cellen om door te gaan naar de volgende stap. </li><li> Centrifugeer op hoge snelheid (25.000 xg) gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, hersuspenderen celpellet in 200 ml van TE (50 mM EDTA), en was cellen door te schudden (150 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer op hoge snelheid (25.000 xg) gedurende 15 min bij 4 ° C, het supernatant, hersuspenderen in 15 ml TE (10 mM EDTA) weggooien, en op te slaan 200-pi monsters bij -80 ° C totdat ze nodig zijn voor DNA-extracties. </li></ol> 2. DNA-extractie en zuivering: <ol><li> Voeg 200 ul 5 M NaCl, 200 pi 10% SDS, en 100 ul 14,3 M β-mercapto-ethanol aan de 200-pi microbiële cel aliquot deel. Meng voorzichtig door het omkeren van 4-6 keer. </li><li> Onder voorbehoud van het mengsel op drie rondes van vries-dooi door onderdompeling in vloeibare stikstof gedurende 2 minuten, gevolgd door ontdooien in een 65 ° C waterbad gedurende 5 minuten. Uit te breiden laatste ontdooien tot 10 minuten. </li><li> Voeg 200 ul 5 M kaliumacetaat (pH 5,5) en de plaats op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het supernatant naar een nieuwe buis met behulp van een breed boring pipetpunt. Voeg 3 ul van RNase A en incubeer bij 37 ° C voor 1 uur. </li><li> Voeg gelijk volume van chloroform, kort schudden door inversie, en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. </li><li> Breng voorzichtig de bovenste laag van het supernatant in een nieuwe buis met behulp van een breed boring pipetpunt. Vermijd pipetteren de witte interface laag gelegen tussen de bovenste en onderste lagen. Herhaal de chloroform-extractie procedure. </li><li> Voeg een gelijk volume van de gekoelde (bij -20 ° C) isopropanol aan het supernatant en incubeer op ijs gedurende 30 minuten voor het neerslaan van DNA. </li><li> Centrifugeer bij max. snelheid (20800 xg) gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet DNA. </li><li> Verwijder het supernatant en wassen DNA pellet met 1 ml gekoeld (bij -20 ° C) 70% ethanol. </li><li> Centrifugeer bij max. snelheid (20800 xg) gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi het supernatant, herhaal dan 70% ethanol wassen en drogen DNA pellet gedurende 10 minuten. Herhaal dit 70% ethanol te wassen. </li><li> Resuspendeer DNA in 25 ul TE (10 mM EDTA), warm bij 65 ° C gedurende 5 minuten, te combineren in een buis als er meerdere buizen zijn gebruikt, en volume-up aan te brengen in 500 pi met TE. </li><li> Voeg 500 ul ijskoud (of bij 4 ° C) 20% polyethyleenglycol (PEG) (opgesteld in 1,2 M NaCl). Meng voorzichtig door de inversie, incubeer op ijs gedurende 10 minuten en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet DNA. Verwijder de bovenstaande vloeistof en was het ingehulde DNA met een ml gekoelde 70% ethanol, drogen aan de lucht gedurende 10 min, en resuspendeer in 30-50 ul TE of moleculair-biologische kwaliteit water. Vergemakkelijken resuspensie van DNA door opwarming op 65 ° C gedurende 5 minuten en Store DNA bij -80 ° C. </li></ol> 3. DNA zuiverheid, concentratie en grootte bepalen: <ol><li> Bepaal DNA-kwaliteit door het meten van de A en A 260/280 260/230 ratio's met behulp van een Nanodrop 1000 spectrofotometer of andere geschikte instrumenten. </li><li> Bepaal met behulp van DNA-concentratie Quant-iT dsDNA Assay kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Bepaal DNA grootte met behulp van pulse field gel elektroforese. Bereid 1% agarose gel met 0.5X TBE en gebruik de volgende parameters op de CHEF Mapper XA System; de eerste schakelaar tijd van 0,35 s, een laatste schakel tijd van 7,67 s en 120 ° ingesloten hoek voor een helling van 6,0 V / cm bij een lineaire ramping factor. Vlek gel met 1 x SYBR Green I gedurende 30 minuten. Belasting tussen 700-1000 ng totaal DNA op gel. Zie Fig. 3 voor een verkorte vorm van het volledige protocol. </li></ol> Representatieve resultaten: Cel-extractie: Sequentiële microbiële cel extracten (supernatant) hebben aangetoond dat de troebelheid van extracten neemt af naarmate het aantal extracties te verhogen. Dit suggereert een vermindering van het aantal cellen na elke opeenvolgende cel extractie. Belangrijk om hier op te merken is dat als elke extra cel extractie stap biedt de mogelijkheid om verontreiniging introductie, het aantal van de cel extracties moet worden geminimaliseerd zodat de uiteindelijke celpellet is representatief voor de algehele microbiële gemeenschap. Andere bronnen van verontreiniging werden gecontroleerd door het aannemen van een adequate laboratorium steriele technieken. Zo werden de oplossingen bereid in geautoclaveerd DI-water en het filter gesteriliseerd. Containers werden gesteriliseerd met alcohol, autoclaaf, en behandelde onder UV-licht en ultraviolet crosslinker. DNA-concentratie en kwaliteit bepalen: Het protocol leverde ongeveer 2 pg van HMW DNA (35-50 kb) (afb. 4) per gram van de mat monster met een A 260/280 verhouding van 1,6, en een A 260/230 verhouding van 0,7 (Tabel 1). Hoewel de A 260/230 verhouding bleek te laag, geen remming van downstream moleculair-gebaseerde toepassing, zoals PCR-amplificatie van het 16S rRNA genen werd waargenomen in een aparte studie 7. Het is belangrijk op te merken dat DNA van hypersaline matten heeft twee belangrijke bronnen van verontreiniging, EPS en zouten. Het is dus mogelijk dat sporen van deze verontreinigingen kan de A 260/230 ratio's kunnen beïnvloeden, ondanks de enorme inspanningen om hun effecten op de downstream-toepassingen te verminderen. DNA-size bepaling: Pulse field gel elektroforese maakt gebruik van een pulserende stroom met intermitterende directionele switches wat resulteert in een DNA-uitstrijkje zoals weergegeven in figuur 3. Ons protocol leverde een HMW DNA van ongeveer 35 tot 50 kb. Terwijl sommige DNA grootte kleiner kan zijn dan 30 kb, is het belangrijk om een ​​deel van het uitstrijkje boven de 35 kb gezien het feit dat fosmid klonen ~ 40 kb DNA inserts vereist en een grotere DNA-fragmenten zorgen voor een grotere toegang tot intact biosynthesewegen. In onze studies werd de DNA-uitstrijkje boven de 35 kb uitgesneden en gezuiverd voor grote-insert vector klonen en andere moleculaire toepassingen. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Hypersaline microbiële mat bemonstering site (Big Pond) op Eleuthera, de Bahama's. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een dwarsdoorsnede van de extreem zoute microbiële mat gebruikt in deze studie. De microbiële mat werd verkregen uit een extreem zoute vijver gelegen aan Eleuthera, de Bahama's. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Schematische weergave van de procedures die betrokken zijn bij microbiële cel extractie, cellysis, extractie en zuivering van metagenomic DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Moleculair gewicht karakterisatie van geëxtraheerde DNA met behulp van pulse field gel elektroforese. Lane M is een HMW marker, en lanen 1 en 2 zijn herhalingen van metagenomic DNA geëxtraheerd uit de Eleuthera hypersaline mat met behulp van de bovenstaande protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Extractiemethode </td><td></td><td> Concentratie ng / g </td><td> Een 260/280 </td><td> Een 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Rep 1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> Rep 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Meting van de concentratie en de kwaliteit van het DNA geëxtraheerd uit microbiële hypersaline mat.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

Gezien het feit dat de totale cel verwijdering uit complex en zeer diverse microbiële mat monsters niet praktisch is, de primaire zorg is hoe goed de uitgepakte de cellen van het totale microbiële mat gemeenschap te vertegenwoordigen. In een eerdere studie, PCR-DGGE analyse van microbiële 16S rRNA genen toonde aan dat de vijf cel verwijderen van de stappen in dit protocol gebruikte cellen die representatief zijn voor de totale microbiële mat gemeenschap 7 extracten. Het werkelijke aantal cel-extractie stappen...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethyleen glycol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% in 1,2 M NaCl </td></tr><tr><td> Kaliumacetaat </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT dsDNA Assay kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentrum </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium Chloride </td><td> BDH Chemicals </td><td> BDH8014 </td><td> Geschikte conc. </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% in water </td></tr><tr><td> natriumhexametafosfaat </td><td> Merck Chemicals </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% in water </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA-systeem </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 spectrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Wetenschappelijke Industries Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraviolet Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring blender </td><td> Waring laboratorium </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extractie met een hoog molecuulgewicht dna van microbiële matten

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Succesvolle en nauwkeurige analyse en interpretatie van metagenomic gegevens is afhankelijk van de efficiënte afzuiging van hoge kwaliteit, hoge moleculair gewicht (HMW) gemeenschap DNA. Echter, het milieu mat monsters nogal eens voor problemen op het verkrijgen van grote concentraties van hoge kwaliteit, HMW DNA. Hypersaline microbiële matten bevatten grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS), een en zouten die kan remmen afgeleide toepassingen van de geëxtraheerde DNA. Direct en harde methoden worden vaak gebruikt in de DNA-extractie van vuurvaste monsters. Deze methoden worden vaak gebruikt omdat de winst per aandeel in matten, een klevende matrix, bindt DNA 2,3 in de directe lysis. Als gevolg van de hardere extractiemethoden, DNA gefragmenteerd raakt in kleine maten 4,5,6. Het DNA wordt dus niet geschikt voor grote-insert vector klonen. Om deze beperkingen te omzeilen, hebben we een verslag van een verbeterde methodologie voor HMW DNA van goede kwaliteit en kwantiteit van hypersaline microbiële matten extract. We gebruikten een indirecte methode waarbij de scheiding van microbiële cellen van de achtergrond mat matrix door middel van het mengen en het differentieel centrifugeren. Een combinatie van mechanische en chemische procedures werd gebruikt om DNA extraheren en te zuiveren van de uitgepakte microbiële cellen. Ons protocol levert ongeveer 2 ug van HMW DNA (35-50 kb) per gram monster mat, met een A 260/280 ratio van 1,6. Bovendien is versterking van de 16S rRNA genen 7 suggereert dat het protocol in staat is te minimaliseren of te elimineren remmende effecten van verontreinigingen. Onze resultaten geven een geschikte methode voor de extractie van HMW DNA van microbiële matten voor functionele metagenomic studies en van toepassing kunnen zijn op andere milieu-monsters waaruit DNA-extractie is een uitdaging.

Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

Een succesvolle en nauwkeurige analyse en interpretatie van metagenomische gegevens is afhankelijk van de efficiënte extractie van hoogwaardig, hoogmoleculair ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA met een hoog moleculair gewicht te extraheren uit hypersaline microbiële matten. Dit wordt bereikt door eerst microbiële cellen uit de microbiële mat te homogeniseren en te extraheren. De microbiële cellen worden vervolgens gelyseerd met behulp van vries-dooi- en chemische methodologie.Vervolgens worden celresten en RNA verwijderd met behulp van organische extracties en RNases, gevolgd door DNA-extractie. De laatste stap van de procedure is de DNA-precipitatie en -zuivering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die DNA van hoge moleculaire gewichtskwaliteit en concentratie laten zien.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals directe en agressieve DNA-extractiemethoden, is dat deze DNA met een hoog moleculair gewicht uit een complex milieu-monster gebruikt voor functionele metagenomische studies. Het microbiële mat dat in deze studie werd gebruikt, is verkregen uit een hypersaliene vijver in Eleuthera, Bahama's. Om microbiële cellen uit de achtergrondmatrix van de mat te extraheren, mengt men eerst ongeveer 30 gram mat grondig, zonder te malen, met een steriele maalstamper. De mat is volledig gehomogeniseerd wanneer er geen klonten meer in het mengsel zichtbaar zijn.Plaats vervolgens het gehomogeniseerde mattemateriaal in een blender en voeg ongeveer 100 milliliters natriumchloride toe. Blend gedurende één minuut op gemiddelde snelheid, gevolgd door koeling gedurende één minuut bij minus 20 degrees Celsius. Herhaal dit blenden en koelen nog twee keer. Wanneer het blenden is voltooid, brengt u de slurry over in een centrifugefles van 250 milliliter en vult u het resterende lege volume aan met één molar natriumchloride.Schud 30 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer daarna het mengsel 15 minuten op lage snelheid bij vier graden celsius. Draag vervolgens het supernatant voorzichtig over naar een kolf, waarbij het sediment zo min mogelijk wordt verstoord. Voeg vers natriumchloride toe aan het gepelletteerde sediment.Meng opnieuw en schud gedurende 30 minuten. Centrifugeer vervolgens zoals voorheen en breng het supernatant over in een nieuwe kolf. Herhaal het toevoegen van vers natriumchloride, het mengen, het centrifugeren en het verwijderen van het supernatant nog drie keer.Combineer de supernatten van de vijf cel-extracties en centrifugeer aliquots van 200 milliliters op hoge snelheid gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder de supernatant en resuspendeer elk celpellet in 10 milliliters natriumhexametafosfaat. Combineer de celsuspensies uit alle vier de buizen en voeg natriumhexametafosfaat toe om het volume aan te vullen tot 200 milliliters.Was de cellen door deze 30 minuten bij kamertemperatuur te schudden. Centrifugeer de cellen na het schudden 15 minuten op hoge snelheid bij vier graden Celsius, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 200 milliliters om de cellen opnieuw te wassen door ze 10 minuten bij kamertemperatuur te schudden. Centrifugeer tot slot opnieuw 15 minuten op hoge snelheid bij vier graden Celsius.Nadat het Resus-supernatans is weggegooid, wordt de celpellet gesuspendeerd in 15 milliliter om aliquots van 200 microliter microbiële cellen voor te bereiden. Microbiële cellen kunnen bewaard worden bij min 80 graden Celsius tot ze nodig zijn voor DNA-extracties. Om de procedure voor het extraheren en zuiveren van DNA uit de microbiële cellen te starten, wordt natriumchloride SDS en beamr capto ethanol toegevoegd aan elk van de 200 microliter microbiële cellen.Verdeel het mengsel over in totaal acht buisjes. Meng voorzichtig door vier tot zes keer te keren, dompel het mengsel gedurende twee minuten onder in vloeibare stikstof, gevolgd door ontdooien bij 65 °C gedurende vijf minuten; herhaal het onderdompelen in vloeibare stikstof en het ontdooien bij 65 °C nog twee keer.Verleng de laatste ontdooiing naar 10 minuten. Voeg na de derde vries-dooi cyclus 200 µL kaliumacetaat toe aan elke buis en plaats deze 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens 10 minuten bij 10.000 ×g bij vier °C.Gebruik vervolgens een pipetpunt met een wijde opening om het supernatant over te brengen naar een nieuwe buis. Voeg drie µL RNAs A toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C. Voeg na de incubatie van één uur een gelijk volume chloroform toe.Schud kort door omkering en centrifugeer 10 minuten bij 15, 000 Gs. Breng bij kamertemperatuur de bovenste laag supernatant over naar een nieuwe buis. Herhaal de chloroformextractieprocedure.Breng opnieuw de bovenste laag supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg een gelijk volume gekoelde isopropanol toe aan het supernatant en incubeer dit 30 minuten op ijs. Centrifugeer op maximale snelheid om het DNA te neerslaan, verwijder het supernatant en was elke DNA-pellet met één milliliter gekoelde 70% ethanol.Herhaal de wasstap met 70% ethanol en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant. Herhaal de wasstap met 70% ethanol en laat de DNA-pellet 10 minuten aan de lucht drogen.Resuspendeer elk DNA-pellet in ongeveer 25 µL TE. Warm dit vijf minuten lang op bij 65 °C, combineer alles vervolgens in één buis en vul het volume aan tot 500 µL met TE. Voeg polyethyleenglycol toe, meng voorzichtig door inversie en incubeer 10 minuten op ijs.Centrifugeer om het DNA te pelletteren. Verwijder en gooi vervolgens het supernatant weg nadat het DNA is gewassen met gekoelde 70% ethanol. Laat het 10 minuten aan de lucht drogen, resuspendeer in 30 tot 50 µL TE of water van moleculaire graad en warm 5 minuten op bij 65 °C.Bewaar het DNA bij -80 °C. Deze tabel toont de resultaten van de meting van de concentratie en kwaliteit van DNA geëxtraheerd uit de microbiële hypersaline mat. Het protocol leverde ongeveer 2 µg DNA op per gram mat-monster met een A₂₆₀/A₂₈₀-ratio van 1,6 en een A₂₆₀/A₂₃₀-ratio van 0,7.Hoewel de A260/A230-ratio laag leek, werd in een aparte studie geen inhibitie van downstream moleculaire toepassingen, zoals PCR-amplificatie van de 16s ribosomaal RNA-genen, waargenomen; wanneer de DNA-grootte werd bepaald met pulsed-field gelelektroforese, wezen de resultaten op hoogmoleculair DNA (HMW-DNA) van ongeveer 35 tot 50 kilobases. Hier is baan M een HMW-marker en zijn banen 1 en 2 replica's van metagenomisch DNA geëxtraheerd uit de eleuthra hypersaline mat. De DNA-smear boven de 35 kilobases kan worden uitgesneden en gezuiverd voor klonering in vectoren met grote inserten of andere geschikte moleculaire toepassingen.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals P-C-R-D-G-G-E klonering of DNA-sequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de functionele diversiteit is van de onderzochte microbiële gemeenschap.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.

Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples

Hier wordt een methode beschreven voor de extractie, zuivering en kwaliteitscontrole van genomisch DNA van de obligate biotrofe schimmelpathogeen, echte meeldauw, voor gebruik in genoomsequencing met lange reads.

Zuivering van hoog molecuulgewicht Genomic DNA van echte meeldauw voor Long-Read Sequencing

We presenteren het proces van het isoleren, verspreiden en karakteriseren van koolwaterstofafbrekende bacteriën uit aquatische habitats. Het protocol schetst bacteriële isolatie, identificatie door de 16S-rRNA-methode en het testen van hun koolwaterstofafbrekend potentieel. Dit artikel zou onderzoekers helpen bij het karakteriseren van microbiële biodiversiteit in milieumonsters, en specifiek screenen op microben met bioremediatiepotentieel.

Isolatie, vermeerdering en identificatie van bacteriële soorten met koolwaterstof metaboliserende eigenschappen uit aquatische habitats

Dit artikel beschrijft een protocol voor diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.

Extractie van diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Dit protocol beschrijft de CTAB-methode om hoogwaardige DNA uit mycobacteriën te extraheren, waarbij de uitdagingen van hun harde, mycolinezuurrijke celwanden worden overwonnen. Het proces omvat enzymatische vertering, cellysie met CTAB en DNA-zuivering door organische extractie en ethanolprecipitatie. Deze methode produceert DNA dat geschikt is voor moleculaire studies en is betrouwbaar voor mycobacterieel onderzoek.

Extractie van het volledige genoom van deoxyribonucleïnezuur uit Mycobacterium-soorten via de Cetyltrimethylammoniumbromide-techniek

Biologie van microbiële gemeenschappen - Interview

Leer een verbeterde methode voor de extractie van hoog moleculair gewicht DNA uit hypersaline microbiële matten. Deze techniek scheidt cellen van de matmatrix voor optimale DNA-kwaliteit en concentratie.

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

Meer video's verkennen