Name: Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Leer microïontoforese en micromanipulatie voor intravitaal fluorescentiebeeldvorming van de microcirculatie. Deze methode maakt gerichte aflevering van acetylcholine mogelijk om endothelium-afhankelijke vasodilatatie en calciumsignalering in arteriolen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek in de auteurs &#39;laboratorium wordt ondersteund door de National Institutes of Health beurzen R37-HL041026, R01-R01-HL086483 en HL056786 (SSS) en door F32-HL097463 en T32-AR048523 (PB) van de Verenigde Staten Public Health Service.

1. Dierverzorging en gebruik Na de beoordeling en goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite, worden mannelijke muizen ten minste 12 weken oud gebruikt. Een muis is verdoofd met pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneale (ip) injectie. Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen, wordt verdoving onderhouden door supplementen (10-20% van de eerste injectie, ip) als nodig is (elke 30-60 minuten, aangeduid met terugtrekking reactie op teen of staart knijpen). Na voltooiing van de experimentele procedure de muis is een overdosis aan pentobarbital (ip) en gedood door cervicale dislocatie. 2. Micropipetten en Microiontophoresis <ol><li> Microiontophoresis micropipetten (interne tip diameter, ~ 1 micrometer) worden bereid uit borosilicaatglas capillaire buizen met behulp van een horizontale pipet trekker. Wij kiezen voor een ~ 5 mm conus voor stijfheid; langere versmalt zijn flexibeler. </li><li> Micropipetten zijn opgevuld met 1M ACh (Figure1A-C) opgelost in 18,2 MΩ water. Voor opvullen, is een microcapillaire buis is aangesloten op 0,2 um filter gekoppeld aan een spuit met de agonist van belang (Figuur 1). Deze kunnen gemakkelijk worden vervaardigd (zie hieronder) of gekocht bij commerciële leveranciers. De microcapillaire buis wordt ingebracht in de achterkant van de micropipet en ACh oplossing wordt geleverd in het lumen, terwijl het intrekken van de microcapillaire buis als de micropipet vult. Houd de micropipet met de punt naar beneden, zijn luchtbellen verwijderd worden door voorzichtig flicking de micropipet. </li><li> De micropipet is vastgezet in een houder gemonteerd in een micromanipulator (figuur 2). De houder heeft een zilveren draad aansluiten van de ACh oplossing binnen de micropipet aan een externe pin, die op zijn beurt verbonden is met de positieve pool van een microiontophoresis programmeur. Een tweede zilveren draad vastgezet aan de rand van het weefsel voorbereiding is aangesloten op de negatieve pool om het circuit te voltooien als het topje van de micropipet is gevorderd in de fysiologische zoutoplossing over de voorbereiding. </li><li> Een behoud van de huidige wordt toegepast op vasodilatatie voorkomen (of TL-respons) wanneer de micropipet tip is gepositioneerd naast de arteriolaire muur. Behoud van de huidige zal variëren met de grootte van de micropipet tip (inwendige diameter = 1 micrometer) en agonist concentratie, maar is zeer reproduceerbare voor bepaalde parameters (we gebruiken ~ 200 nA voor 1M ACh, een urn tip). Het behoud van de huidige houdt samenvalt met de levering van de huidige uitwerpen via het elektronische trigger (aanvullende figuur 1) gesynchroniseerd met het begin van het beeld acquisitie. </li></ol> 3. Micromanipulatie <ol><li> Een aangepaste platform voor een XY-microscoop stadium werd vervaardigd uit ferromagnetische roestvrij staal. Platform afmetingen (1 / 8 "X 12" X 13 ") in staat stellen voldoende ruimte om positie micromanipulators rond de experimentele voorbereiding naar wens (figuur 2A). Micromanipulators bevestigd aan magnetische voeten (Figuur 2B) in staat stellen positionering als gedicteerd door de bereiding. Dit zijn direct geplaatst op de gefabriceerde platform rond de voorbereiding voor het positioneren micropipetten op plaatsen van belang (figuur 2C). </li></ol> 4. Representatieve resultaten <ol><li> Met de micropipet tip gepositioneerd naast een arteriole, is er fluorescentie respons op ACh (behoud van de huidige dan aangepast aan ACh lekkage te voorkomen). Onder een drempel stimulans was er geen effect. Echter, als stimulans intensiteit toenam, endotheliale cellen calcium fluorescentie toegenomen steeds grotere afstanden langs de arteriole, net als de intensiteit van de fluorescentie op de plaats van stimulatie (figuur 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Methode voor Opvullen Microiontophoresis pipetten. A) Een microcapillaire buis (groene pijl) is vastgezet in een knelkoppeling (blauwe pijl) bevestigd aan een 0,2 um filter (paarse pijl), die vervolgens is bevestigd aan een injectiespuit gevuld met 1M ACh. B) De microcapillaire buis wordt ingevoerd in de microiontophoresis pipet via de back-end en de oplossing is verplaatst naar het lumen van de micropipet. C invullen) Als de pipet gevuld is, de punt naar beneden te houden en voorzichtig flick boven de taper te bellen (zwarte pijl) te verwijderen. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Op maat Platform voor micromanipulator Placement. .. A) een ferromagnetisch roestvrij stalen platform werd geplaatst op een aangepaste MVX10 microscoop databank met een XY-translationele fase B) Circulaire magnetische voeten aan de onderkant van de compacte 3-assige micromanipulators C) Micromanipulators gepositioneerd rond de experimentele opstelling (Zie begeleidend protocol: Jove ID # 2874) aan specifieke sites van belang te bestuderen. Deir compacte afmetingen en de veelzijdigheid kunnen meerdere micropipetten gelijktijdig gebruikt worden. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Calcium Fluorescentie in arteriolen. Calcium fluorescentie van de endotheliale cellen aan de binnenkant van de muur arteriolaire verhoogd met stimulus intensiteit. De eerste drie panelen beelden te zien van de fluorescentie reacties op A) 250 nA, B) 500 nA en C) 1000 nA uitwerpen van de huidige (alle 500 ms pulsduur). De afstand waarover endotheelcellen calcium fluorescentie verhoogd wordt aangegeven door haakjes in AC (~ 130, 270 en 400 um, respectievelijk). De referentie-lijn over de arteriole in elk paneel geeft aan waar fluorescentie reacties (F / Fo) om ACh werden opgenomen op de plaats van stimulatie. D) Opnamen van F / Fo versus tijd voor het verhogen van ACh stimuli. Als uitwerpen huidige toegenomen, F / Fo toegenomen in amplitude en duur. Merk op dat 100 nA stimulus was onder de drempel en had geen effect. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Aanvullende Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Aanvullende Figuur 1"> Aanvullende Figuur 1. Schakelschema voor elektronische trigger. Deze schakeling is gekoppeld met een parallelle poort van een personal computer. Wanneer geactiveerd zal het een constante TTL puls van 5V biedt. De 7805 chip is een 5V spanningsregelaar aangesloten op een 9-12V DC voeding (een accu van de juiste voltage is prima). Uitvoer van de 7805 levert stroom aan de Quad Bilaterale Switch en de uitgang van het circuit. Input over de 1K weerstand is van de computer.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+%28Rat+Cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li>
<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li>
<li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li>
<li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp, S. egal, S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li>
<li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li>
<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
<li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+importance+of+the+endothelial+K%2B+channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li>
<li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li>
<li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagated+endothelial+Ca2%2B+waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo%3A+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

Alle procedures en protocollen betreffende dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Missouri en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en gebruik van proefdieren. Productie van dit artikel werd gesponsord door Stanford Photonics.

Het protocol hier beschreven toont werkwijzen voor het bereiden en implementeren van Micropipetten microiontophoresis. De levering van acetylcholine wordt gebruikt om calcium signalering ten grondslag liggen aan endotheel-afhankelijke vasodilatatie illustreren in arteriolen van de verdoofde muis. Onze resultaten illustreren dat de afstand waarover ACh endotheelcellen calcium fluorescentie neemt toe met de intensiteit van het uitwerpen stroom van de microiontophoresis micropipet (figuur 3). Het ontbreken van fluorescentie te verhogen onder rusttoestand geeft te verwaarlozen lekkage van ACh uit de micropipet. Het gebrek aan respons op 100 nA stimulus intensiteit (figuur 3, legenda) laat zien dat een drempel intensiteit van de stimulatie is nodig voor endotheliale cellen calcium te verhogen. Deze technieken kunnen eenvoudig worden aangepast aan andere vasoactieve stoffen en weefsel preparaten. Praktische overwegingen: In het werken met microiontophoresis tot arteriolen reactiviteit studie, een aantal dingen moeten worden erkend. Hoewel het moeilijk gebleken om de werkelijke concentratie van de geleverde agonist te bepalen, stimulus-respons curves zijn reproduceerbaar binnen en tussen de voorbereidingen. Deze kunnen worden uitgevoerd door houden pulsduur constante (bijvoorbeeld 500 ms) en het variëren van de ejectie stroom (bijvoorbeeld, 250, 500 en 1000 nA; Figuur 3). Als alternatief kan uitwerpen stroom worden constant gehouden (bijvoorbeeld 500 nA) en pulsduur gevarieerd (bijvoorbeeld, 250, 500 en 1000 ms). Voor een verwijzing naar de acties van een bepaalde concentratie agonist, kan de bereiding worden superfused met de juiste oplossing 5. Omdat de drijvende kracht voor opgeloste stof uitworp is elektrische lading beweging, moet de agent te leveren dragen een netto lading worden verplaatst van de micropipet. Om ervoor te zorgen dat de agent van belang is de primaire ladingdrager, is het opgelost bij hoge concentratie (bijvoorbeeld een M voor ACh) tot electro-osmose te minimaliseren. Wanneer dit vereist het manipuleren van de pH van de micropipet vulling oplossing, zijn voertuig controles verplicht om niet-specifieke effecten vast te stellen. Passende controles moeten ook worden uitgevoerd voor de doorgang van de stroom alleen (bijvoorbeeld met behulp van micropipetten gevuld met isotone zoutoplossing). De effectieve afstand voor verspreiding van de agent van zijn plaats van lozing dient te worden vastgesteld en is het gemakkelijkst empirisch bepaald door het verdwijnen van een fysiologische respons (bijvoorbeeld, vasodilatatie of een stijging in de intracellulaire calcium na het uitwerpen van ACh) als de micropipet is gepositioneerd op gedefinieerde afstand van het doel site. In de praktijk is de effectieve diffusie afstand sterk beïnvloed door de manier waarop de top van de micropipet is gepositioneerd in het weefsel, bijvoorbeeld als het puntje ingedrukt in het weefsel en de tip is afgesloten, dan uitwerpen verminderd is. Overmatige bindweefsel is bijzonder lastig en moeten worden verwijderd uit het weefsel oppervlak tijdens chirurgische voorbereiding. Er moet ook aandacht worden besteed aan de mogelijkheid van uitputting van de punt van de aangewezen agent. Dit wordt geminimaliseerd door gebruik te maken relatief korte pulsen (bijv. ≤ 1 s). Met aanhoudende stromen (bijvoorbeeld enkele seconden), kan de agonist worden verdreven uit het puntje sneller dan het kan worden vervangen door diffusie vanuit de bulk invullen oplossing in de micropipet. Omdat verwaarloosbaar volume wordt verplaatst met microiontophoresis, als men probeert om de lokale ionische milieu te veranderen (bijvoorbeeld om een depolariserende K te leveren + stimulus), kan dit niet effectief worden bereikt met microiontophoresis, maar is gemakkelijk bereikt met de druk uitwerpen van bulk vloeistof met de gewenste samenstelling. Voor lokale stimulatie van een arteriole, micropipet tips met een binnendiameter van 2-3 um werken goed met schietstoelsystemen Pressure 4-5 psi (28-35 kPa) en de pulsduur (bijv. 1 seconde) bediend met een magneetventiel 10. Waar duurzame levering van een agent van een micropipet op een microvessel nodig is, wordt de druk uitworp bij voorkeur met behulp van micropipetten van adequate interne tip diameter (bijvoorbeeld ~ 10 urn) 11,12. Een hydrostatische kolom met een bekende hoogte met een kraan klep zorgt voor een goedkope, goed gedefinieerde on / off constante druk hoofd. Debieten worden bepaald door de binnendiameter van de pipetpunt en de rij-druk. Zoals altijd, het voertuig controles zijn essentieel voor niet-specifieke acties van de druk uitwerpen uit te sluiten.

<table><tbody><tr><td> Gebruikt materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Borosilicaatglas Capillaire Buizen </td><td> Warner Instruments </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Horizontale Pipetteer Puller </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> model P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Acetylcholine Chloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> adapter voor Luer hub </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Om microcapillaire slang beveiligen </td></tr><tr><td> 0,2 micrometer Nylon Titan filter </td><td> Zon Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Lage retentietijd om het verlies te minimaliseren </td></tr><tr><td> 5 ml spuit </td><td> Becton Dickinson-Co </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet Holder </td><td> Warner Instruments </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Zilverdraad </td><td> Warner Instruments </td><td> AG10W </td><td> 0,25 mm diameter </td></tr><tr><td> 3-assige micromanipulator </td><td> Siskiyou Ontwerp Instrumenten </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Componenten voor manipulator zoals </td></tr><tr><td> microiontophoresis huidige programmeur </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> Model 260 </td><td></td></tr><tr><td> trekker-apparaat </td><td> Gewoonte </td><td> gewoonte </td><td> circuit voorzien in Suppl. Figuur 1 </td></tr><tr><td> roestvrij stalen plaat </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> Volgens het ontwerp </td></tr><tr><td> Geïntensiveerd Digitale Camera </td><td> Stanford Fotonica Inc </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Geïntegreerd met Piper Control-software </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis en micromanipulatie voor intravitale fluorescentie imaging van de microcirculatie

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis betekent doorgang van stroom door een micropipet tip om een ​​opgeloste stof te leveren op een aangewezen locatie binnen een experimentele voorbereiding. Microiontophoresis kan simuleren synaptische transmissie een door het leveren van neurotransmitters en neuropeptiden op neuronen reproduceerbaar 2. Verwaarloosbare volume (vloeistof) verplaatsing vermijdt mechanische verstoring van de experimentele voorbereiding. Aanpassing van deze technieken om de microcirculatie 3 heeft het mogelijk gemaakt mechanismen van vasodilatatie en vasoconstrictie te bestuderen op microscopisch niveau in vivo 4,5. Een belangrijk voordeel van een dergelijke gelokaliseerde levering is mogelijk vasomotorische reacties te bestuderen op bepaalde plaatsen binnen een netwerk zonder microvasculaire roepen systemische of reflexieve veranderingen in de bloeddruk en weefsel doorbloeding, waardoor onthullen de intrinsieke eigenschappen van haarvaten. Een beperking van microiontophoresis is dat de precieze concentratie van het middel geleverd aan de plaats van belang is moeilijk vast te stellen 6. Toch, de release van de micropipet tip is evenredig met de intensiteit en de duur van de huidige 2,7 uitwerpen, zodanig dat reproduceerbaar stimulus-respons relaties eenvoudig worden bepaald onder gedefinieerde experimentele omstandigheden (zie hieronder). Bijkomende factoren die van invloed microiontophoretic aflevering onder meer opgeloste concentratie en de ionisatie in oplossing. De inwendige diameter van de micropipet tip moet worden ~ 1 micrometer of minder tot diffusie &#39;lekken&#39;, die kan worden tegengegaan met een behoud van de huidige minimaliseren. Zo een naar buiten (positieve) stroom wordt gebruikt om een ​​kation en een negatieve stroom wordt gebruikt om het te behouden binnen de micropipet uit te werpen. Fabricage van micropipetten wordt vergemakkelijkt met geavanceerde elektronische trekkers 8. Micropipetten worden getrokken uit glazen capillaire buisjes met daarin een gloeidraad die &#39;wieken&#39; oplossing in de punt van de micropipet toen gevuld vanuit de back-end (&quot;opgevuld&quot;). Dit wordt gedaan door het invoegen van een microcapillaire buis verbonden met een spuit met de oplossing van de rente en het uitwerpen van de oplossing in het lumen van de micropipet. Micromanipulators in staat stellen de gewenste plaatsing van micropipetten binnen de experimentele voorbereiding. Micromanipulators gemonteerd op een beweegbare bodem kan worden gepositioneerd rond het preparaat volgens de topografie van microvasculaire netwerken (hieronder uitgewerkt). Het huidige protocol toont microiontophoresis van acetylcholine (ACh + Cl -) op een arteriole van de muis cremaster spier voorbereiding (zie bijbehorende protocol: Jove ID # 2874) aan endotheel-afhankelijke vasodilatatie te produceren. Stimulus levering is gesynchroniseerd met gedigitaliseerde beeld acquisitie met behulp van een elektronische trigger. Het gebruik van Cx40 BAC-GCaMP2 transgene muizen 9 maakt visualisatie van intracellulaire calcium reacties onderliggende vasodilatatie in arteriolaire endotheelcellen in de woonkamer microcirculatie.

Microiontophoresis betekent verplaatsing van ionen uit een micropipet in reactie op een verschil in elektrische potentiaal tussen de binnen-en buitenkant van de micropipet. Biologisch actieve moleculen worden daarbij geleverd in verhouding tot elektrische stroom. We illustreren acetylcholine microiontophoresis in combinatie met micromanipulatie tot endotheel-afhankelijke vasodilatatie studie in de microcirculatie.

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Microiontoforese houdt in dat er stroom door de punt van een micropipet wordt geleid om een opgeloste stof af te leveren op een aangewezen plaats binnen een experimentele preparaat. ...

Het algemene doel van deze procedure is om een geladen stof, zoals de positief geladen neurotransmitter acetylcholine, af te leveren op een specifieke locatie binnen de experimentele preparatie. Dit wordt bereikt door micropipetten te vervaardigen uit glazen capillairbuizen met behulp van een horizontale micropipetten-trekker, de micropipetten vervolgens te vullen met acetylcholine en de micropipet te bevestigen in een micromanipulator. De tip van de micropipet wordt vervolgens gepositioneerd naast de locatie van interesse.Terwijl een negatieve retentiestroom wordt ingesteld om lekkage van choline te voorkomen, wordt een kleine hoeveelheid choline uit de micropipet gestoten door een positieve stroom van een gedefinieerde intensiteit en duur toe te passen, terwijl de fluorescentie- en diameterrespons in de microcirculatie worden geregistreerd; de signalen meten de calciumfluorescentie die ten grondslag ligt aan de endotheelafhankelijke vasodilatatie van arteriolen die de weefseldoorbloeding regelen. Ik ben Dr. Steve Siegel. Deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de cellulaire signaleringsprocessen die ten grondslag liggen aan de controle van de bloedstroom en de arteriolen.Het kan ook worden toegepast in de neurofysiologie om synaptische transmissie en de activering van ionkanalen te bestuderen. Ik ben Dr. Pune Badger. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn aan deze techniek moeite hebben, omdat het oefening vergt om te leren hoe effectieve micropipetten worden geprepareerd voor micromanipulatie en hoe de retentie- en injectiestromen moeten worden aangepast om de toediening van het medicijn vanuit de micropipet te beheersen.Begin met het voorbereiden van micropipetten voor micro-iontoforese met een pipettentrekker, gebruikmakend van borosilicaatglazen capillaire buizen met een intern glasfilament. Een taps toelopend uiteinde van vijf millimeter heeft de voorkeur voor een betere stijfheid, terwijl langere taps toelopende uiteinden flexibeler zijn. Bevestig vervolgens een vullingsnaald, verbonden met een 0,2 micrometer filter, aan een spuit die één molair acetylcholinechloride bevat, opgelost in 18,2 mega ohm water.Plaats nu de vulnaald in het achterste uiteinde van de micropipet en schuif deze tot aan de punt. Injecteer de acetylcholine in de micropipet terwijl de vulnaald wordt teruggetrokken terwijl de micropipet wordt gevuld. Om eventuele luchtbellen te verwijderen, houdt u de micropipet met de punt naar beneden gericht en tikt u er voorzichtig tegenaan.Zet vervolgens de micropipet vast in een micropipethouder. Bevestig daarna de micropipethouder in een drie-assige micromanipulator, zoals een compact model gemonteerd op een magnetische basis. Sluit zowel de positieve als de negatieve draden aan op de micro-iontoforese-programmeur. Met behulp van draden met een krokodillenklem aan het uiteinde wordt een zilverdraad aan de rand van het preparaat bevestigd om als referentie-elektrode te dienen.Verbind met de krokodillenclip de negatieve draad van de micro-iontforese-programmeur met de referentie-elektrode. Verbind vervolgens de positieve draad van de micro-iontforese-programmeur met de externe pen van de micropipethouder. Met de tweede krokodillenclip wordt het circuit voltooid wanneer de punt van de micropipet in de fysiologische zoutoplossing wordt gebracht.Voor de preparatie is deze microscoop uitgerust met een aangepast platform om het oppervlak van de XY-tafel te vergroten. Het platform is vervaardigd uit ferromagnetisch roestvrij staal en biedt voldoende ruimte om de micromanipulator naar wens rond de experimentele preparatie te positioneren. Plaats de experimentele preparatie op het platform.In dit voorbeeld is spierweefsel geprepareerd met behulp van het protocol voor de preperatie van de cream master spier uit een bijbehorende video. Positioneer nu de micromanipulator ten opzichte van het preparaat, zodat de tip van de micropipet zich boven de locatie van interesse bevindt. Pas nu, om dilatatie van de arteriolen te voorkomen, een retentiestroom toe met behulp van de microferese-programmeur.De retentiestroom varieert afhankelijk van de grootte van de micropipetpunt en de agonistconcentratie, maar is zeer reproduceerbaar voor gedefinieerde parameters. Positioneer vervolgens, met behulp van de bedieningselementen van de micromanipulator en terwijl u door de microscoop kijkt, de punt van de micropipet voorzichtig naast een arteriolenwand. Met oefening kan dit worden bereikt zonder de punt te breken of het weefsel te beschadigen.Om een subtiele choline-trigger vrij te geven, wordt de micro-iontforese-programmeur aangestuurd met een TTL-puls van ten minste vijf volt. Met behulp van commerciële software kan een elektronische trigger naar de computer worden gestuurd, die gelijktijdig de TTL-puls verzendt en de opname van digitale beelden van de camera start. De duur van de stimuluspuls wordt door de software geregeld.De microforese-programmeur regelt de ejectiestroom. Wanneer deze de TTL-puls ontvangt, wordt de retentiestroom ingetrokken en wordt de ejectiestroom afgegeven. Deze arterie van een muis bevat endotheelcellen die calciumgevoelig GFP tot expressie brengen, dat fluoresceert proportioneel aan stijgingen van intracellulair calcium boven een drempelwaarde; een subtiele choline-getriggerde fluorescentierespons trad op naarmate de duur van de acetylcholine-stimulus toenam.De calciumfluorescentie van endotheelcellen in de arterie nam ook toe. De fluorescentie-intensiteit nam toe op de plaats van stimulatie en de fluorescentie verspreidde zich over steeds grotere afstanden langs de arterie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de effectiviteit van microporese wordt bepaald door de interne diameter van de tip, de concentratie van de agonist in de micropipet, en de intensiteit en duur van de uitstootstroom.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe microferese kan worden gebruikt om een geladen molecuul vanuit een micropipet op een aangewezen locatie af te leveren. In de experimentele voorbereiding.

microiontophoresis-micromanipulation-for-intravital-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een nieuwe veelzijdige methode voor het observeren van de microcirculatie wordt gepresenteerd. Het wordt beschouwd als geschikt voor waarneming op lange termijn, en voor de combinatie met pharmacophysiological of moleculaire biologische interventies.

In vivo micro-circulatie meting in de skeletspier door Intra-vitale Microscopie

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Intravitale microscopie kan bij dieren worden gebruikt om retinale vaatdiameters, bloedstroomsnelheden en totale retinale bloedstroom te visualiseren en te meten.

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

We presenteren een geoptimaliseerde lokale ejectieprocedure met behulp van een glazen micro-pipet en een snelle twee-fotonen hyperstack-beeldvormings methode, die nauwkeurige meting van veranderingen in de capillaire diameter mogelijk maakt en het onderzoek van de verordening in drie dimensies.

In vivo drie-dimensionale twee-Fotonmicroscopie om uitgevoerde vasculaire responsen te bestuderen door lokale ATP-ejectie met behulp van een glazen micro pipet

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Om de microvasculaire stroom te kwantificeren uit hoge snelheid capillaire flow beeld sequenties, ontwikkelden we medewerkers (ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow) software. In het volledige afbeeldingsveld en na verloop van tijd evalueert het personeel stroomsnelheden en genereert het een reeks ruimtelijke kaarten met kleurcodering voor visualisatie en tabellaire uitvoer voor kwantitatieve analyses.

Ruimtelijke temporele analyse van Fieldwise flow in Microvasculatuur

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

We presenteren een protocol voor het implementeren van interferentie-reflectiemicroscopie en totaal-interne-reflectie-fluorescentiemicroscopie voor de gelijktijdige beeldvorming van dynamische microtubuli en fluorescerend gelabelde microtubuli-geassocieerde eiwitten.

Gelijktijdige interferentiereflectie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming van dynamische microtubuli en bijbehorende eiwitten

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Leer microïontoforese en micromanipulatie voor intravitaal fluorescentiebeeldvorming van de microcirculatie. Deze methode maakt gerichte aflevering van acetylcholine mogelijk om endothelium-afhankelijke vasodilatatie en calciumsignalering in arteriolen te bestuderen.

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Meer video's verkennen