Name: Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer een high-throughput in situ hybridisatiemethode om mRNA-expressiepatronen te visualiseren in het foetale muis onderste urogenitale stelsel. Deze techniek maakt ruimtelijke en temporele lokalisatie van transcripten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen dr. Lan Yi, Cancer Institute van de New Jersey, bedanken voor technische bijstand bij de voorbereiding van weefsel manden. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Subsidies DK083425 en DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met behulp van de hier beschreven methode, is het mogelijk om mRNA te detecteren in alle belangrijke soorten cellen en weefsels compartimenten van de foetale mannelijke en vrouwelijke muizen LUT&#39;s mogelijk is inclusief de mesenchymale pads, urotheel, glad spierweefsel, prostaat knoppen, ejaculatie kanaal, en de vagina. De 50μm secties die in dit protocol hebben het voordeel dat ze dik genoeg zijn om weefsel architectuur (zoals de bloedvaten) op te lossen, maar zijn dun genoeg om te probe vangen, dat is een methodolo...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Anti-digoxigenine antilichaam, Fab-fragmenten </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Het blokkeren van reagens </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Purple AP substraat, precipiterende </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumine </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Celcultuur plaat, 24 goed </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenine 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Tweesnijdend scheermesje </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klassieke Model </td></tr><tr><td> Eliminase RNase remover </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamide </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gelextractiekit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaaraldehyde, 25% oplossing in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparine, natriumzout </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Waterstofperoxide, 30% oplossing in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 snelle installatie Snellijm </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnesiumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleïnezuur </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Reactievaatjes, 1,5 ml </td><td> Biologix Research Company </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell cultuur plaat te voegen </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Moleculaire slijpen hars </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, 4% oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, zonder Ca &amp; Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Kleine onderdelen Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K oplossing, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Columns </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q-oplossing </td><td> Qiagen </td><td> Voorzien van Taq DNA-polymerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase-remmer </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase-vrij DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque low-melt agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Schapen serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfon, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Natriumazide, korrelige </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X oplossing </td><td> Research Products International </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> SuperScript III eerste streng synthese systeem </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA-polymerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA-polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrerende microtoom met een luxe exemplaar bad </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Gist tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

een high throughput in situ hybridisatie methode om mrna expressie patronen karakteriseren in de fetal mouse lagere urogenitale tractus

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

De ontwikkeling van het lagere urogenitale tractus (LUT) is een ingewikkeld proces. Deze complexiteit blijkt tijdens de vorming van de prostaat van de foetus mannelijk urethra, die zich baseert op androgene signalen en epitheliale-mesenchymale interacties 1,2. Inzicht in de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de prostaat ontwikkeling kan uitwijzen groei mechanismen die ten onrechte zijn later in hun leven opnieuw tot leven gewekt om aanleiding te geven tot prostaat ziekten zoals benigne prostaathyperplasie en prostaatkanker. De ontwikkelingslanden LUT is anatomisch complex. Tegen de tijd dat de prostaat ontluikende begint op 16,5 dagen na de conceptie (DPC), een groot aantal celtypen aanwezig zijn. Vaatstelsel, de zenuwen en het gladde spierweefsel verblijven binnen de mesenchymale stroma 3. Dit stroma omringt een meerlagig epitheel en geeft aanleiding tot de foetale prostaat via androgeenreceptor-afhankelijk paracriene signalen 4. De identiteit van de stromale androgeenreceptor-responsieve genen die nodig zijn voor de prostaat ontwikkeling en het mechanisme waarmee de prostaat ductaal epitheel vormen in reactie op deze genen niet volledig begrepen. De mogelijkheid om nauwkeurig te identificeren en te lokaliseren soorten cellen de expressie van specifieke factoren in hen is noodzakelijk om verder te begrijpen prostaat ontwikkeling. In situ hybridisatie (ISH) zorgt voor lokalisatie van mRNA&#39;s in een tissue. Zo kan deze methode worden gebruikt voor het patroon en de timing van expressie van signaalmoleculen en hun receptoren te identificeren, waardoor het ophelderen van de potentiële prostaat ontwikkeling toezichthouders. We beschrijven hier een hoge doorvoersnelheid ISH techniek om mRNA expressie patronen te identificeren in de foetale muis LUT met behulp van trillende microtoom gesneden secties. Deze methode biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere ISH protocollen. Het uitvoeren van ISH op dunne secties gehandeld op grond van een dia is technisch moeilijk, vriescoupes hebben vaak een slechte structurele kwaliteit, terwijl zowel de vriescoupes en paraffinecoupes resulteren vaak in een zwak signaal resolutie. Het uitvoeren van ISH op hele berg weefsel kan resulteren in een probe vangen. In tegenstelling tot onze high throughput techniek maakt gebruik van dik gesneden secties die gedetailleerde weefsel architectuur zichtbaar te maken. Gewijzigd microfugebuizen buizen een gemakkelijke bediening mogelijk van onderdelen tijdens de ISH procedure. Er kunnen maximaal 4 mRNA transcripten kan worden afgeschermd van een enkele 17.5dpc LUT met maximaal 24 mRNA transcripten gedetecteerd in een enkele run, waardoor de kosten en het maximaliseren van efficiency. Met deze methode kunnen meerdere behandelingsgroepen tot identiek en als een geheel worden verwerkt, zodat er geen voorkeur voor het interpreteren van data. De meeste pertinent voor prostaatkanker onderzoekers, deze methode zorgt voor een ruimtelijke en temporele locatie van de lage en hoge overvloed mRNA transcripten in de foetale muis urinebuis die aanleiding geeft tot de prostaat ductaal netwerk.

We beschrijven hier een efficiënte high throughput<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (ISH) methode voor het visualiseren van patronen van mRNA-expressie in de ontwikkeling van de foetus muis prostaatweefsel secties. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan de mRNA expressie patronen visualiseren in andere muis weefsels of in de weefsels van andere diersoorten.

Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus

De ontwikkeling van de lagere urinogene tractus (LUT) is een complex proces. Deze complexiteit wordt duidelijk tijdens de vorming van de prostaat uit de foetale mannelijke ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van mRNA-expressiepatronen in weefsels van het onderste urogenitaalstelsel van een foetus van een muis in ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst een met digoxygenine gelabelde riboprobe te synthetiseren vanuit een via PCR gegenereerde template. De tweede stap van de procedure is het maken van dikke coupes met behulp van een vibraatome.De derde stap is het uitvoeren van een in situ hybridisatie in secties van het lagere urogenitale stelsel die zich in op maat gemaakte mandjes bevinden. De mRNA's worden gevisualiseerd via immunohistochemische detectie van gebonden ribo-probes met behulp van BM purple neerslaand alkalisch fosfatase substraat. Uiteindelijk kan microscopie de ruimtelijke en temporele lokalisatie van mRNA-transcripten met een lage en hoge abundantie in het lagere urogenitale stelsel van de foetale muis aantonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunohistochemie is dat riboprobes eenvoudig te genereren zijn en zodanig kunnen worden gemaakt dat ze de meeste mRNA's in het gehele muisgenoom herkennen. Hoewel deze methode inzicht biedt in mRNA-expressiepatronen t

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo&#39;s

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Foetale en perinatale sterfte is een gemeenschappelijk kenmerk bij het bestuderen van genetische veranderingen die van invloed cardiale ontwikkeling. Hoogfrequente echografie is verbeterd 2-D resolutie en kan uitstekende informatie te verstrekken over de vroege ontwikkeling van het hart en is een ideale methode om de impact op cardiale structuur en functie te detecteren voorafgaand aan het overlijden.

Murine Foetale echocardiografie

Ultra-hoge frequentie echografie is een krachtige live-imaging tool om cardiale afwijkingen in kleine proefdieren. Zijn noninvasiveness maakt het handhaven van de fysiologische toestand van de embryo's. Hierin tonen we het gebruik van M-mode echo om de hartslag van embryo meten E18.5 in de baarmoeder.

In utero Meting van de hartslag in de Muis door invasieve M-mode echocardiografie

Muizen worden veel gebruikt om te studeren zwangerschapsduur biologie. Beëindiging van de zwangerschap is echter vereist voor dergelijke studies die zich verzet tegen longitudinale onderzoek en vereist het gebruik van grote aantallen dieren. Daarom beschrijven we een niet-invasieve techniek van hoge-frequentie Ultrasonografie voor de vroegtijdige opsporing en het toezicht na implantatie gebeurtenissen in de zwangere muis.

Een roman gebruik van driedimensionale hoogfrequente Ultrasonografie voor vroege zwangerschap karakterisering in de muis

Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte en zeer homologe RNA-sequenties, post-transcriptional regulatoren van messenger RNAs (mRNAs) bijeenkomen. Huidige miRNA detectiemethoden verschillen in gevoeligheid en specificiteit. We beschrijven een protocol dat in situ hybridisatie en immunokleuring voor gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties combineert.

Weefsel-specifieke miRNA expressie profilering in muis hart secties gebruiken In Situ hybridisatie

Reproducibly het om getallen te tellen van mRNAs in individuele eicellen, enkel molecuul RNA fluorescentie in situ is hybridisatie (RNA-vis) geoptimaliseerd voor niet-aanhanger cellen. Eicellen werden verzameld, gekruist met het transcript specifieke sondes en gekwantificeerd aan de hand van een afbeelding kwantificering software.

Gebruik van één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (SM-vis) om Quantify en lokaliseer mRNAs in lymfkliertest eicellen

Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.

Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis

We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Deze video toont twee-kleuren ganse berg in situ hybridisatie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressie patroon van twee verschillende genen kunnen worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham en David Ish-Horowicz.

Dubbele Hele Mount in situ hybridisatie van het vroege embryo&#39;s Chick

Leer een high-throughput in situ hybridisatiemethode om mRNA-expressiepatronen te visualiseren in het foetale muis onderste urogenitale stelsel. Deze techniek maakt ruimtelijke en temporele lokalisatie van transcripten mogelijk.

Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus (Video) | JoVE Journal

Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus

Meer video's verkennen