Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren van mRNA-expressiepatronen in weefsels van het onderste urogenitaalstelsel van een foetus van een muis in ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst een met digoxygenine gelabelde riboprobe te synthetiseren vanuit een via PCR gegenereerde template. De tweede stap van de procedure is het maken van dikke coupes met behulp van een vibraatome.

De derde stap is het uitvoeren van een in situ hybridisatie in secties van het lagere urogenitale stelsel die zich in op maat gemaakte mandjes bevinden. De mRNA's worden gevisualiseerd via immunohistochemische detectie van gebonden ribo-probes met behulp van BM purple neerslaand alkalisch fosfatase substraat. Uiteindelijk kan microscopie de ruimtelijke en temporele lokalisatie van mRNA-transcripten met een lage en hoge abundantie in het lagere urogenitale stelsel van de foetale muis aantonen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunohistochemie is dat riboprobes eenvoudig te genereren zijn en zodanig kunnen worden gemaakt dat ze de meeste mRNA's in het gehele muisgenoom herkennen. Hoewel deze methode inzicht biedt in mRNA-expressiepatronen tijdens de foetale ontwikkeling van het urogenitale systeem bij de muis, kan zij ook worden toegepast op andere organsystemen, soorten en ontwikkelingsstadia. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het inbedden van het weefsel in agar moeilijk te leren kan zijn en omdat kleine variaties in de oriëntatie tot inconsistente resultaten kunnen leiden. Verwijder en gooi ten minste één dag voor de weefselbereiding het membraan van een celkweekplaat met een diameter van 12 millimeter weg; de overgebleven ring dient als mal. Week de ringen een nacht in een RNase-remmende oplossing.

Ontleed op de dag van het protocol het onderste urogenitale stelsel van een muis dat is gehydrateerd met gegradeerde methanol. Verwijder met PBS-tween wassingen ongeveer twee derde van de blaas en bewaar het resterende weefsel van het onderste urogenitale stelsel in PBS-tween. Plaats vervolgens een behandelde ringvormige mal op een glazen objectglas, vul deze met een 4% low-melt agarose-oplossing bij 62 °C en laat deze ongeveer twee minuten afkoelen.

Droog nu het weefsel van het lagere urogenitale stelsel door middel van blotten en dompel het onder in de agarose-oplossing. Gebruik een pincet om het weefsel zodanig te oriënteren dat het halverwege de boven- en onderkant van de ring is opgehangen. Incubeer de mal bij vier graden Celsius tot de agarose is gestold.

Voordat het weefsel wordt gesneden, wordt een aangepast Wilkinson-mes voorbereid door het te spoelen met oplosmiddelen, gevolgd door water. Scheid het dubbele mes in de lengte in twee enkele messen. Steun vervolgens het Wilkinson-mes met een microtoommes.

Om dit te doen, knip eerst het microtoommes op de lengte van het Wilkinson-mes. Lijm vervolgens het microtoommes met een Lock Tite-lijm aan het Wilkinson-mes, waarbij een afstand van ongeveer drie tot vier millimeter vanaf de snijkant wordt aangehouden. Monteer nu het versterkte mes in de vibratiemicrotoom en stel de meshoek in op 35 graden.

Bereid het deluxe specimenbad voor door het bad te vullen met PBS en het te omringen met nat ijs. Voordat het in de plug ingebedde weefsel wordt gemonteerd, dient het uit de ringmal te worden gehaald en de onderzijde droog te worden geblokt. Lijm vervolgens het gedroogde oppervlak met Loctite-lijm aan de montage schijf.

Plaats de schijf in de vibratoom en stel de sectiedikte in op 50 microns, de snelheid op twee en de amplitude van het mes op vier. Gebruik bij het snijden van weefselsecties stompe pincetten om elke sectie over te brengen naar een 24-well kweekplaat gevuld met een halve milliliter ijskoud PBS tween. Verwijder na het snijden het grootste deel van de aros rond elke weefselsectie met veerschaaren voordat de INI-hybridisatie wordt gestart; de secties kunnen tot 48 uur worden bewaard bij vier graden Celsius in PBS tween bevatten twee millimolar natriumazide.

Maak eerst aangepaste monstermandjes door de bodem van een microcentrifugebuisje af te snijden bij de markering van 100 microliter. Verhit de snede van de buis in een vlam tot het plastic zacht is. Druk het zachte plastic vervolgens stevig op een vierkant gaasje.

Laat het uitharden en trim het overtollige gaas. Maak de mandjes compleet door met een verhitte naald van 18 gauge twee gaatjes in elk buisdeksel te prikken. Maak een plateau om de monstermandjes in te plaatsen door 24 gelijkmatig verdeelde gaten van 12 millimeter in het deksel van een 24-wells plaat te boren.

Elk gat moet direct boven een well worden geplaatst voordat u begint met het voorverwarmen van een afgedekte hybridisatiekamer, gevuld met ongeveer 1,3 cm kraanwater, tot 60,5 °C. Start de in situ hybridisatie door 2 mL PBS-tween aan elke well van de 24-wells cultuurplaat toe te voegen. Dek deze plaat af met het voorbereide deksel waarin de mandjes zijn geplaatst.

Breng nu de weefselsneden bij kamertemperatuur over naar de mandjes en incubeer de sneden onder schudconditionele omstandigheden in 6% waterstofperoxide met PBS-tween, gevolgd door een reeks wasstappen met PBS-tween, een incubatie met proteïnase K, een volgende fixatie en verdere wasstappen. Voeg ter voltooiing van de monstervoorbereiding twee milliliters van de vooraf verwarmde prehybridisatiebuffer toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende ten minste één uur in de verwarmde hybridisatiekamer. Start de hybridisatie door 0,5 microgram gelabelde RIBA-probe aan elke put toe te voegen.

Zet de incubatie vervolgens voort gedurende de nacht in de verwarmde hybridisatiekamer. Was de weefsels de volgende dag met oplossing één, waarbij geleidelijk wordt overgegaan op oplossing twee, en behandel ze daarna met RNA's. Was vervolgens in oplossing drie, gevolgd door wasbeurten in TBS tween en weefselblokkeringsbuffer, terwijl de weefsels incuberen in de weefselblokkeringsbuffer.

Start een incubatie van minimaal twee uur van het anti-dig antilichaam in antilichaamabsorptiebuffer bij vier graden Celsius na de incubatieperiode. Centrifugeer de antilichaamoplossing gedurende één minuut op 10.000 RPM. Voeg, om onoplosbare stoffen te verwijderen, de Senna toe aan twee milliliters antilichaamoplossingsbuffer.

Verwijder nu het weefsel uit de blokkeringsbuffer en incubeer deze in de bereide antilichaamoplossing. Bewaar deze gedurende de nacht bij 4 °C in een hybridisatiekamer op de derde dag van de procedure. Was de weefsels meerdere keren in TBST met de ole.

Breng vervolgens met een glazen Pasteurpipet de weefsels voorzichtig over naar schone microcentrifugebuisjes. Was de weefsels gedurende 10 minuten met 1 mL NTM-buffer.

Vervang vervolgens de oplossing door TMT met lava sole MBM purple. Plaats de buisjes in het donker en monitor gedurende de volgende dagen de kleurontwikkeling en ververs de oplossing indien nodig. Na volledige kleurontwikkeling worden de weefsels kort gewassen met TMT met lava so en vervolgens een nacht geïncubeerd bij vier graden Celsius in PBS met paraformaldehyde.

Bleek en was de weefsels de volgende dag. De secties zijn nu gereed voor beeldvorming. Het weefsel van het onderste urogenitale stelsel werd ingebed in agar, zodanig dat de urethrale middellijn parallel liep aan het vlakke oppervlak van de aros-plug.

Deze oriëntatie leverde sagittale coupes op. Op maat gemaakte monstermandjes beschermden de delicate weefselcoupes tegen stof en particulate materie. Tijdens de meerdaagse in situ hybridisatieprocedure.

Ze voorkomen daarnaast het verlies van coupes. Het is een uitdaging om achtergrondkleuring te beperken tijdens de lange incubaties die nodig zijn om mRNAs met een lage abundantie te detecteren. De toevoeging van natriumazide en de daaropvolgende filtratie lijken echter de achtergrondkleuring te hebben beperkt.

Bovendien waren er geen zichtbare verschillen in achtergrondkleuring wanneer monsters gedurende langere tijd werden geïncubeerd in de kleurontwikkelingsoplossing. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in zes dagen worden voltooid mits correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunohistochemie, worden toegepast om te bepalen of het expressiepatroon van de mRNA's correleert met het expressiepatroon van de eiwitten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u mRNA-expressiepatronen kunt visualiseren in het ontwikkelende lagere genetale stelsel van de muis.