Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study

Het algemene doel van het volgende experiment is om in real-time en op een high-throughput manier het effect van potentiële stoffen op tumorceldormantie en/of het ontsnappen uit tumordormantie te observeren, gebruikmakend van de volgende in vitro assay om tumordormantie of de overgang naar metastatische groei te modelleren. Dit wordt bereikt door eerst dormante en/of metastatische tumorcellen te kweken in een driedimensionaal cultuursysteem van basaalmembraanextract, of BME-systeem, aangepast aan een 96-wellplaatplatform. Wanneer ze in het 3D-systeem worden gekweekt, treden metastatische cellen in een tijdelijke, dormante of quiescente fase.

In tegenstelling hiermee treden tumorcellen die in vivo latent zijn, in een verlengde staat van quiescentie. In het 3D-culturesysteem kunnen metastatische cellen vervolgens worden behandeld met kandidaat-middelen om hun overgang van quiescentie naar proliferatie te voorkomen. Daarentegen kunnen latente tumorcellen worden behandeld met kandidaat-middelen die hun overgang van quiescentie naar proliferatie kunnen induceren.

Het proliferatiegedrag van de dormante en metastatische cellen als gevolg van de behandeling zal worden bepaald door de cell titer 96 aqueous one solution cell proliferation assay kit toe te voegen op de gewenste tijdstippen voor analyse met een ELISA-plaatlezer. De resultaten tonen het effect van de behandeling op de celproliferatie van zowel dormante als metastatische tumorcellen op basis van een celproliferatie-assay in het 3D-systeem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van metastase, zoals welke factoren en cellulaire mechanismen gedissemineerde tumorcellen in een dormante staat houden en welke factoren en cellulaire mechanismen de overgang van tumordormantie naar klinische metastase induceren.

Incubeer de groeifactor-gereduceerde BME van Qualtrics gedurende één nacht in een koelkast bij 4 °C op de dag voordat de proliferatie-assay wordt uitgevoerd. Selecteer vervolgens op de dag van de assay een dormante of metastatische tumorcelcultuur voor het experiment. Plaats daarna een 96-wells plaat op een plateau met ijs in een laminaire flowkast.

Gebruik vervolgens een dispenser met een spuit om elke put van de plaat te coaten met 50 µL van de ontdooide, ijskoude BME. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de putten ontstaan; plaats de met BME gecoate 96-wells plaat in een bevochtigde incubator met 5% carbon dioxide bij 37 °C gedurende 30 minuten. Plaats vervolgens een flesje trypsin bij 37 °C om op te warmen terwijl de met BME gecoate plaat incubeert.

Zuig het medium van de tumorcellen af. Spoel de kweekplaten met 10 milliliters PBS. Zuig vervolgens de PBS af en voeg twee milliliters voorverwarmd trypsine toe aan de kweekplaten.

Incubeer de platen gedurende vijf minuten. Voeg vijf milliliter DMEM high glucose, aangevuld met 10% FCS en antibiotica, toe aan een conische buis van 15 milliliter. Gedurende deze tijd.

Breng na de incubatie de losgekoppelde cellen over naar de 15 milliliter buis en tel de cellen. Centrifugeer vervolgens het totale aantal te kweken cellen in een weefselkweekcentrifuge gedurende vijf minuten bij 1500 G bij kamertemperatuur. Aspireer het supernatant voorzichtig.

Laat wat medium achter, aangezien de pellet in de meeste gevallen niet zichtbaar is. Tik vervolgens tegen de onderkant van de buis om er zeker van te zijn dat een enkelcel-suspensie wordt verkregen. Resuspendeer de pellet daarna met 100 µL assay-medium voor elke 2 × 10³ cellen.

Tritureer de cellen meerdere keren met een pipet van 5 mL om te waarborgen dat een enkelcellige suspensie behouden blijft. Verdeel 100 µL celstuspensie per putje in de met BME gecoate 96-wells plaat voor de controle. Voeg voor de achtergrond-devaluatieplaat nog eens 100 µL assaymedium per putje toe aan slechts enkele putjes van de met BME gecoate 96-wells plaat. Incubeer vervolgens de platen, aspireer het oude medium en voed de cellen elke vier dagen met nieuw assaymedium.

Voeg voor het evalueren van de celproliferatie per put 20 µL van de cell titer 96 aqueous one solution uit een celproliferatie-assaykit toe aan elke 96-well plaat die op het gewenste experimentele tijdstip wordt geanalyseerd. Incubeer de platen gedurende twee uur. Registreer vervolgens met een ELISA-plaatlezer de absorbantie van zowel de experimentele als de achtergrondputsen bij 490 nm ter voorbereiding op de immunofluorescentie.

Kleuring van cel-signaleringsmoleculen en tumorcellen. Ontdooi BME gedurende de nacht in een koelkast van vier graden Celsius op de dag vóór de kleuring. Plaats op de dag van de kleuring een acht-kamer glazen objectglassysteem op een ijsbak in een zuurkast. Gebruik vervolgens een 200 microliter pipet om elke put van het glazen objectglassysteem te coaten met 50 microliters ijskoud BME.

Zorg ervoor dat de BME gelijkmatig is verspreid en dat er geen luchtbellen in de wells ontstaan. Incubeer de gecoate slides gedurende 20 minuten. Selecteer een dormante of metastatische tumorcellijn.

Oogst de cellen met trypsine zoals eerder beschreven. Voeg vervolgens het totale aantal te kweken cellen samen in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer nu de cellen en aspireer opnieuw voorzichtig het supernatant, waarbij een kleine hoeveelheid medium wordt achtergelaten.

Tik tegen de bodem van de conische buis van 15 milliliter om de pellet te resuspenderen tot een enkelcel-suspensie. Resuspendeer de pellet met 400 µL assaymedium per 5 × 10³ cellen. Pipetteer de cellen meerdere keren met een pipette van 5 milliliter om te garanderen dat de enkelcel-suspensie behouden blijft. Pipetteer per putje 400 µL van de celoplossing in elk van de acht BME-gecoate kamers.

Incubeer vervolgens het glazen objectglassysteem, aspireer het oude medium en voed de cellen elke vier dagen met nieuw assay-medium op de gewenste experimentele tijdstippen. Aspireer de bovenste laag van het medium en voeg 200 µL fixatief aan aangevuld met tritton toe en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het triton-aanvullende fixatief en voeg 200 µL enkel fixatief toe en incubeer nog eens 25 minuten bij kamertemperatuur.

Zuig het fixatief opnieuw af en voeg nu 400 µL PBS toe aan elke put. Incubeer de plaat nog 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de PBS af en voeg 400 µL PBS toe met 0,05% tussen 20 en incubeer dit nogmaals 10 minuten.

Ook bij kamertemperatuur. Blok nu de gefixeerde cellen met 200 µL blokkeringsoplossing. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur, aspireer na de incubatie de blokkeringsoplossing en voeg aan elk monster 200 µL van het primaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing.

Incubeer de slides overnacht bij vier graden Celsius met het primaire antilichaam. Aspireer de volgende dag het antilichaam en was de wells drie keer door telkens 400 µL PBS toe te voegen voor 15 minuten, om de oplossing daarna telkens weer te aspireren. Voeg na het aspireren van de PBS bij de laatste wasbeurt 200 µL toe van een secundair antilichaam geconjugeerd met rhodamine rood.

Dek vervolgens het systeem met acht kamers op het objectglas af met aluminiumfolie en laat dit één uur incuberen bij kamertemperatuur. Was daarna de putjes drie keer met PBS, zoals eerder beschreven. Monteer na de derde wasbeurt de objectglazen in beta shield monteermedium met dpi.

Droog de coupes tot slot 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Hier wordt een voorbeeld getoond van een proliferatieanalyse van de dormante D 2.0 R- en metastatische D two A one-tumorcellen in de 3D-cultuur. D 2.0 R-cellen blijven latent gedurende de gehele experimentele cultuurperiode van 14 dagen, terwijl de sterk metastatische D two A one-cellen slechts vier tot zes cultuurdagen latent blijven, waarna ze tijdens de initiële dormante fase beginnen te prolifereren.

Veel cellen blijven solitair in de 3D-kweek, zoals hier te zien is op een representatieve foto van een kweek op dag vier, terwijl andere niet-prolifererende cellen multicellulaire sferoïden vormen. De overgang van D2A1-cellen van een rusttoestand naar een proliferatieve toestand in 3D-kweek wordt hier getoond op deze foto van een kweek op dag 12. Dit gaat gepaard met dramatische veranderingen in de celmorfologie in deze figuur.

Een voorbeeld van een middel dat voorkomt dat D two A one-cellen overgaan van een slapende naar een proliferatieve toestand, wordt getoond door de behandeling van de D two A one-cellen met een specifieke remmer tegen myosin light chain kinase. Houd de D two A one-cellen in een slapende toestand zoals geïllustreerd in deze figuur. Een significante toename van myosin light chain-fosforylering in D two A one-cellen in het rood, gevolgd door reorganisatie van de F actin-filamenten die actin-stressvezels vormen in het groen, vindt plaats tijdens hun overgang van dormantie (dagen 1 tot 4) naar proliferatie.

Dag zeven. Echter, het blokkeren van de myosin light chain kinase-activiteit in D2A1-cellen door SHRA of door het geneesmiddel ML-7 houdt D2A1-cellen in een rusttoestand en resulteert in de inhibitie van myosin light chain-fosforylering, F-actine en de organisatie van stressfibers, zoals hier te zien is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het in vitro-modelsysteem opzet om tumor dormantie en de overgang naar metastatische groei te bestuderen.