Name: Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer een 3D in vitro assaysysteem om tumorceldormantie en de overgang naar metastatische groei te modelleren. Deze methode maakt real-time, high-throughput analyse van agenten die dormantie of proliferatie beïnvloeden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede ondersteund door de intramurale Research Program van het National Cancer Institute.

1. Celcultuur het onderhoud van de slapende en uitgezaaide tumor cellijnen <ol><li> Grow slapende (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) en metastatische tumorcellen (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) in 10 cm cultuur platen met Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) hoog glucose en 10% foetaal runderserum ( FBS) en antibiotica. Zodra de cellen te bereiken 70-80% confluentie, ga dan naar de volgende testen. </li></ol> 2. Celproliferatie assay van slapende (rust) en metastatische (prolifererende) tumor cellen gekweekt in een 3D-systeem BME Het kweken van slapende / gemetastaseerde cellen in het 3D-systeem <ol><li> Dooi Cultrex groeifactor-gereduceerde Basement Membrane Extract (BME) in 4 ° C koelkast een nacht voor het uitvoeren van de test. Let op de BME moeten worden behandeld op ijs te allen tijde. </li><li> Op de volgende dag, plaatst u een 96 wells plaat op een dienblad van ijs in een laminaire kap. Vacht elke well met een 50-100μl van ijskoude BME met behulp van een dispenser met een spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd in de putten. Plaats de 96 wells-plaat bekleed met BME in een vochtige incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> In de tussentijd aspireer de media uit de slapende en of metastatische tumorcellen (opgesteld in hoofdstuk 1). Spoel kweekplaten met 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS). Zuig het PBS en voeg 2 ml trypsine voorverwarmd bij 37 ° C, aan de cultuur platen. Incubeer de platen in een bevochtigde 5% CO 2 bij 37 ° C, gedurende 5 minuten. </li><li> Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis met 5 ml DMEM hoge glucose aangevuld met 10% FCS en antibiotica en tel de cellen. </li><li> Spin down het totale aantal cellen worden gekweekt in een weefselkweek centrifuge met een snelheid van 1500g, bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. In onze analyses maken we 2x10 3 cellen / putje voor elke cellijn of tijd te worden onderzocht. Dit kan echter variëren, afhankelijk van de gebruikte cellijnen. </li><li> Voorzichtig het supernatans aspireren. Let op, in de meeste gevallen de pellet niet zichtbaar is. Daarom laten sommige media achter. Tik op de bodem van de 15 ml conische buis met uw vingers om ervoor te zorgen dat een schorsing van enkele cellen wordt verkregen. De pellet opnieuw te schorten DMEM lage glucose met antibiotica aangevuld met 2% FCS + 2% BME (assay media). 100 ul van de test media moeten worden toegevoegd voor elke 2x10 3 cellen. Vermaal de cellen vele malen met een 5 ml pipet om ervoor te zorgen dat een enkele celsuspensie wordt gehandhaafd. </li><li> Plaat een 100μl van de cel mengsel per goed op de top van de 96 goed BME gecoate plaat. Voor achtergrondinformatie evaluatie (in paragraaf 2.8) plaat in aanvulling 100μl per putje van alleen de test media op de top van de 96 goed BME gecoate plaat. Incubeer de gekweekte platen met 96 putjes in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. De cellen moeten opnieuw worden gevoerd om de 4 dagen met de assay media. </li></ol> Proliferatie assay: <ol start="8"><li> Proliferatie assay van de cellen: toe te voegen aan de putten op de gewenste tijdstippen 20 ul van de celtiter 96 Waterige Een Oplossing celproliferatie assay kit. Incubeer in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C voor 2 uur. Met behulp van een Elisa Plate Reader opnemen van de absorptie bij 490nm. Voor achtergrondinformatie evaluatie en aftrekken, voeg 20μl van de celtiter 96 Waterige Een Oplossing celproliferatie assay kit om putten vooraf gecoat met BME en alleen bedekt met assay media. Met behulp van een Elisa Plate Reader nemen de absorptie bij 490 nm. </li></ol> 3. Immunofluorescentie kleuring voor cell signaalmoleculen in slapende (latente) tumorcellen en / of gemetastaseerde (prolifererende) tumorcellen Het kweken van slapende / gemetastaseerde cellen in het 3D-systeem voor immunfluorescence vlekken * De volgende protocol is een wijziging van een 3D-cultuur protocol gepubliceerd door Debnath J et al. 18. <ol><li> Bereid BME zoals beschreven in paragraaf 2.1. De volgende dag: plaats een 8-kamer glazen schuif systeem op een tray van ijs in een laminaire kap. Coat elk goed met 50ul van ijskoude BME met behulp van een 200μl Pipetman. Zorg ervoor dat BME is gelijkmatig verdeeld en er geen luchtbellen worden gevormd in de putten. Plaats de 8 kamer glaasje gecoat met BME in een bevochtigde 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Oogst en slapende of metastatische cellen van sectie 1 en voor te bereiden op de cultuur zoals beschreven in paragraaf +2,3-+2,4. Verzamel het totale aantal cellen worden gekweekt in een 15 ml conische buis. We bereiden 5 x10 3 cellen / putje voor elke cellijn en tijdstip worden onderzocht. Spin down van de cellen in een weefselkweek centrifuge met een snelheid van 1500g, bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zorgvuldig aspireren de supernate. Merk op dat de pellet niet zichtbaar is, daarom achter te laten sommige media. Tik op de bodem van de 15 ml conische buis met uw vingers om ervoor te zorgen dat een enkele cel suspensie is verkregen.Resuspendeer de pellet met voedingsbodem media. 400μl van de test media moeten worden toegevoegd voor elke 5x10 3 cellen. Vermaal de cellen vele malen met 5 ml pipet. Deze stap is zeer belangrijk ervoor te zorgen dat de enkele celsuspensie wordt gehandhaafd. </li><li> Plaat 400μl van de cel mengsel per goed op de top van elk van de acht kamers voorzien van BME. Incubeer de gekweekte 8 kamers glaasje systeem in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. De cellen moeten opnieuw worden gevoerd om de 4 dagen met de assay media. </li></ol> Immunofluorescentiekleuring: <ol start="4"><li> Op het gewenste tijdstip punten, zuigen de bovenste laag van de media en voeg 200μl van het fixeermiddel met 4% paraformaldehyde (PFA), 5% sucrose en 0,1% Triton X-100 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Aspireren het fixatief en voeg 200μl van 4% PFA met 5% sucrose en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten. </li><li> Zuig het fixeermiddel en voeg 400 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan elk putje. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het PBS en voeg 400 μ PBS met 0,05% Tween 20 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Blokkeer het vaste cellen bij kamertemperatuur met 200μl van hetzij 10% ezel serum of met 3% BSA voor een uur (het blokkeren van oplossing te gebruiken moet empirisch worden bepaald voor elke primaire antilichaam). </li><li> Aspireren de blockingbuffer en voeg 200μl van het primaire antilichaam (verdunning moet empirisch worden bepaald voor elke primaire antilichaam moet worden gebruikt). Verdun het primaire antilichaam in 10% ezel serum als 10% ezel serum werd gebruikt voor het blokkeren of verdunde primaire antilichaam in 3% BSA als 3% BSA blockingbuffer werd gebruikt. 'S nachts Incubeer met de primaire antistof bij 4 ° C. </li><li> Aspireren het antilichaam, Was de putjes met 400μl PBS gedurende 15 minuten en tweemaal herhalen. Zuig het PBS en voeg 200μl van de ezel anti-respectieve-IgG geconjugeerd aan rhodamine rood (verdunning moet empirisch worden bepaald), hebben betrekking op de 8 kamer dia met aluminium folie en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was de putjes met 400μl PBS (3x15 minuten per wasbeurt). Aspireren PBS. Gemonteerd met VECTASHIELD montage medium met DAPI. Droge dia's voor 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Dia's kunnen worden bewaard voor 1 week bij 4 ° C. Bewaar de dia's in het donker. Image dia's door confocale microscopie. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van een proliferatie analyse van de slapende D2.0R en metastatische D2A1 tumorcellen in de 3D-cultuur is weergegeven in figuur 1A. D2.0R cellen zijn slapende (rust) door het gehele experimentele periode van 14 dagen cultuur terwijl de zeer uitgezaaide D2A1 cellen die slapend blijven slechts voor vier tot zes dagen, waarna ze beginnen te woekeren. Tijdens de eerste fase van slapende, vele cellen nog steeds eenzaam in de 3-D cultuur (Figuur 1B, dag 4), terwijl andere niet-prolifererende cellen vormen multi-cellulaire sferoïden. De overgang van D2A1 cellen van een slapende naar proliferatieve state in 3-D-cultuur (Figuur 1B; dag 12) wordt in verband gebracht met dramatische veranderingen in de morfologie van de cel. Daarom kan deze test gebruikt worden om welke factor test / s kunnen leiden tot slapende D2.0R cellen te komen uit hun slapende toestand en wat factor / s kan D2A1 cellen te voorkomen dat de overgang van hun slapende toestand. Figuur 2 is een voorbeeld van een agent het voorkomen van D2A1 cellen om de overgang van latente naar een proliferatieve toestand. Zoals geïllustreerd in figuur 2, behandelingen van D2A1 cellen met een specifieke remmer van myosine lichte keten kinase (ML-7) D2A1 cellen aangehouden in een slapende toestand. Cell signaling in de slapende en prolifererende tumorcellen gekweekt in het 3D-systeem kan worden bestudeerd door immunofluorescentiekleuring voor mobiele signaalmoleculen. Zoals geïllustreerd in figuur 3 een aanzienlijke stijging van de myosine lichte keten fosforylatie in D2A1 cellen (rode vlekken), gevolgd door de reorganisatie van de F-actine filamenten vormen van stress-actine vezels (groene vlekken) treedt op tijdens de overgang van slaap (1-4 dagen) naar proliferatie (dag 7). Echter, het blokkeren van myosine lichte keten kinase-activiteit in D2A1 cellen door shRNA of specifieke drug (ML-7) behoudt D2A1 cellen in een slapende toestand en de resultaten in een inhibitie van myosine lichte keten fosforylatie en F-actine stress-fiber organisatie (figuur 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. In vitro model om solitaire tumorcellen latentie en de overstap naar metastatische groei te bestuderen. A) Proliferatie van de slapende D2.0R en metastatische D2A1 in 3-D Cultrex BME, n = 8 (gemiddelde ± SE). Representatieve resultaten van drie experimenten (* p ≤ 0,05). B) Lichtmicroscopie beelden van D2.0R en D2A1 cellen gekweekt in 3-D Cultrex BME vergroting x20.Figuur aangepast van Barkan et al. 17. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorkomen dat de schakelaar van D2A1 cellen van slaap (rust) om de proliferatie in het 3D-cultuur systeem door remming van de myosine lichte keten kinase (MLCK). Tijdsverloop van D2A1 celproliferatie gekweekt in 3-D Cultrex BME, n = 8 (gemiddelde ± SE). Cellen werden behandeld (controle), of behandeld met een specifieke remmer van MLCK (ML-7, 5 uM) voor 48 uur begint op de cultuur dag 5. Figuur aangepast van Barkan et al. 17. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Myosine lichte keten fosforylering gevolgd door een F-actine reorganisatie bij de schakelaar van D2A1 cellen van latentie naar proliferatieve groei. D2A1 cellen werden gekweekt in 3-D Cultrex BME op 8 kamer glasplaatje. Cellen werden gefixeerd en gekleurd met DAPI (blauw) voor nucleaire lokalisatie, phalloidin (groen) voor f-actine en met een antilichaam tegen de gefosforyleerde vorm van myosine lichte keten (MLC-p) (rood), zoals aangegeven op verschillende tijdstippen. Samenvoegen van de f-actine, en de MLC-p verkleuring (geel). Expressie van MLC-p werd verhoogd tijdens de overgang van D2A1 cellen van latentie (dagen1-4) van proliferatieve groei (7 dagen), gevolgd door actine stress-fiber vorming (pijlen). Confocale microscopie, vergroting X63. Witte balk is gelijk aan 20 micron. Figuur aangepast van Barkan et al. 17. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. . Remming van myosine lichte keten kinase (MLCK) gemedieerde f-actine stress-fiber-vorming in D2A1 cellen D2A1 Cellen werden niet behandeld (controle), of behandeld met remmer voor MLCK (ML-7, 5 uM), voor 48 uur begint op de cultuur dag 5, of behandeld met roerei of MLCK shRNA en gekleurd voor de gefosforyleerde vorm van myosine lichte keten (MLC-p) (rood), F-actine (groen), en de kernen (blauw). Samenvoegen van de f-actine, en de MLC-p verkleuring (geel). Confocale microscopie, vergroting X63. Witte balk is gelijk aan 20 micron.

<ol><li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models%2C+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li>
<li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Regul+Homeost+Agents%22%5BJournal%5D)">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li>
<li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li>
<li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li>
<li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site%3A+a+possible+contributor+to+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li>
<li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormancy+of+solitary+metastatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li>
<li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li>
<li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+dormancy%3A+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li>
<li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li>
<li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li>
<li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+human+tumor+dormancy%3A+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li>
<li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li>
<li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li>
<li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li>
<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De onderliggende mechanismen die tumorcellen behouden verspreid in een slapende toestand of resulteren in hun overgang naar metastatische groei blijven grotendeels onbekend. Dit fenomeen is zeer moeilijk om te studeren in menselijke patiënten 4,12 en weinig preklinische modellen werden ontwikkeld om dit probleem op te lossen. Toch hebben in vivo en ex-vivo model voor tumor rusttoestand gekenmerkt (beoordeeld in 1,12). Echter, de in vivo modellen voor tumor rusttoestand in...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> DMEM hoge glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM lage glucose- </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal bovine serum (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Groeifactor-gereduceerde 3-D Cultrex Basement Membrane Extract </td><td> Trevigen Inc </td><td></td><td> Eiwitconcentratie tussen 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R en D2A1 cellijnen </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 en K7M2AS1.46 cellen </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 en MDA-MB-231 cellen van borstkanker </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Een 8 kamer glazen schuif-systeem </td><td> (Lab-TEK, Thermo wetenschappelijke) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Celtiter 96 Waterige Een Oplossing celproliferatie assay kit </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELD montage medium met DAPI </td><td> Vector Laboratories Inc </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normaal ezel serum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Elisa Plate Reader </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> Record 490nm </td></tr><tr><td> Confocale microscoop </td><td> Zeiss-LSM-510 </td><td></td><td> Vergroting X63 </td></tr></tbody></table>

een in vitro systeem om tumor latentie en de overstap naar metastatische groei study

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recidief van borstkanker volgt vaak een lange latente periode waarin er geen tekenen zijn van kanker, en metastasen kunnen niet klinisch zichtbaar worden pas vele jaren na het verwijderen van de primaire tumor en adjuvante therapie. Een waarschijnlijke verklaring van dit fenomeen is dat tumorcellen hebben metastasen gezaaid, zijn resistent tegen conventionele therapieën, en die slapend blijven voor lange tijd 1-4. Het bestaan ​​van slapende kankercellen op secundaire sites is eerder beschreven als latente eenzame cellen die prolifereren noch noch ondergaan apoptose 5-7. Bovendien heeft deze eenzame cellen is aangetoond dat vanuit de primaire tumor te verspreiden in een vroeg stadium van de ziekte progressie 8-10 en groei gearresteerd in de patiënt beenmerg, bloed en de lymfeklieren 1,4,11 wonen. Daarom, begrijpen mechanismen die slaaptoestand of de overstap naar een proliferatieve toestand te reguleren is van cruciaal belang voor het ontdekken van nieuwe targets en interventies om terugkeer van de ziekte te voorkomen. Echter, het ontrafelen van de mechanismen tot regeling van de overgang van tumor slaap tot metastatische groei werd belemmerd door het gebrek aan beschikbare modelsystemen. in vivo en ex vivo model systemen om metastatische progressie van de tumor cellen te bestuderen zijn eerder 1,12-14 beschreven. Maar deze model-systemen die niet in real time en in een high throughput manier mechanistische inzichten in wat leidt tot de opkomst van eenzame slapende tumorcellen te prolifereren als gemetastaseerde ziekte. We hebben recentelijk ontwikkelde een 3D in vitro systeem voor het model van de in vivo groei eigenschappen van cellen die ofwel sluimerend (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) of proliferatieve (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatische gedrag vertonen in vivo. Wij hebben aangetoond dat tumorcellen die ruststadia vertonen in vivo in een gemetastaseerd locatie rust blijven wanneer gekweekt in een drie-dimensionale (3D) basaal membraan extract (BME), terwijl de cellen zeer uitgezaaide in vivo gemakkelijk vermenigvuldigen in de 3D-cultuur na variabel, maar relatief kort periodes van rust. Belangrijk is dat door gebruik te maken van de 3D ​​in vitro model systeem hebben we laten zien voor de eerste keer dat de ECM samenstelling een belangrijke rol in het reguleren van de vraag of slapende tumorcellen zal overschakelen naar een proliferatieve staat en hebben dit bevestigd in in vivo studies 15-17 speelt. Vandaar dat het model systeem beschreven in dit rapport geeft een in vitro methode om het model tumor latentie en de studie van de overgang naar proliferatieve groei veroorzaakt door de micro-omgeving.

Een aangepaste 3-D in vitro systeem wordt gepresenteerd waarin de groei-eigenschappen van verschillende tumor cellijnen in gereconstitueerde basaalmembraan correleren met de slapende of proliferatieve het gedrag van de tumorcellen in een gemetastaseerd tweede locatie<em&gt; In vivo</em&gt;.

Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study

Recidive van borstkanker volgt vaak na een lange latente periode waarin er geen tekenen van kanker zijn, en metastasen mogelijk klinisch niet waarneembaar zijn ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om in real-time en op een high-throughput manier het effect van potentiële stoffen op tumorceldormantie en/of het ontsnappen uit tumordormantie te observeren, gebruikmakend van de volgende in vitro assay om tumordormantie of de overgang naar metastatische groei te modelleren. Dit wordt bereikt door eerst dormante en/of metastatische tumorcellen te kweken in een driedimensionaal cultuursysteem van basaalmembraanextract, of BME-systeem, aangepast aan een 96-wellplaatplatform. Wanneer ze in het 3D-systeem worden gekweekt, treden metastatische cellen in een tijdelijke, dormante of quiescente fase.In tegenstelling hiermee treden tumorcellen die in vivo latent zijn, in een verlengde staat van quiescentie. In het 3D-culturesysteem kunnen metastatische cellen vervolgens worden behandeld met kandidaat-middelen om hun overgang van quiescentie naar proliferatie te voorkomen. Daarentegen kunnen latente tumorcellen worden behandeld met kandidaat-middelen die hun overgang van quiescentie naar proliferatie kunnen induceren.Het proliferatiegedrag van de dormante en metastatische cellen als gevolg van de behandeling zal worden bepaald door de cell titer 96 aqueous one solution cell proliferation assay kit toe te voegen op de gewenste tijdstippen voor analyse met een ELISA-plaatlezer. De resultaten tonen het effect van de behandeling op de celproliferatie van zowel dormante als metastatische tumorcellen op basis van een celproliferatie-assay in het 3D-systeem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van metastase, zoals welke factoren en cellulaire mechanismen gedissemineerde tumorcellen in een dormante staat houden en welke factoren en cellulaire mechanismen de overgang van tumordormantie naar klinische metastase induceren.Incubeer de groeifactor-gereduceerde BME van Qualtrics gedurende één nacht in een koelkast bij 4 °C op de dag voordat de proliferatie-assay wordt uitgevoerd. Selecteer vervolgens op de dag van de assay een dormante of metastatische tumorcelcultuur voor het experiment. Plaats daarna een 96-wells plaat op een plateau met ijs in een laminaire flowkast.Gebruik vervolgens een dispenser met een spuit om elke put van de plaat te coaten met 50 µL van de ontdooide, ijskoude BME. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de putten ontstaan; plaats de met BME gecoate 96-wells plaat in een bevochtigde incubator met 5% carbon dioxide bij 37 °C gedurende 30 minuten. Plaats vervolgens een flesje trypsin bij 37 °C om op te warmen terwijl de met BME gecoate plaat incubeert.Zuig het medium van de tumorcellen af. Spoel de kweekplaten met 10 milliliters PBS. Zuig vervolgens de PBS af en voeg twee milliliters voorverwarmd trypsine toe aan de kweekplaten.Incubeer de platen gedurende vijf minuten. Voeg vijf milliliter DMEM high glucose, aangevuld met 10% FCS en antibiotica, toe aan een conische buis van 15 milliliter. Gedurende deze tijd.Breng na de incubatie de losgekoppelde cellen over naar de 15 milliliter buis en tel de cellen. Centrifugeer vervolgens het totale aantal te kweken cellen in een weefselkweekcentrifuge gedurende vijf minuten bij 1500 G bij kamertemperatuur. Aspireer het supernatant voorzichtig.Laat wat medium achter, aangezien de pellet in de meeste gevallen niet zichtbaar is. Tik vervolgens tegen de onderkant van de buis om er zeker van te zijn dat een enkelcel-suspensie wordt verkregen. Resuspendeer de pellet daarna met 100 µL assay-medium voor elke 2 × 10³ cellen.Tritureer de cellen meerdere keren met een pipet van 5 mL om te waarborgen dat een enkelcellige suspensie behouden blijft. Verdeel 100 µL celstuspensie per putje in de met BME gecoate 96-wells plaat voor de controle. Voeg voor de achtergrond-devaluatieplaat nog eens 100 µL assaymedium per putje toe aan slechts enkele putjes van de met BME gecoate 96-wells plaat. Incubeer vervolgens de platen, aspireer het oude medium en voed de cellen elke vier dagen met nieuw assaymedium.Voeg voor het evalueren van de celproliferatie per put 20 µL van de cell titer 96 aqueous one solution uit een celproliferatie-assaykit toe aan elke 96-well plaat die op het gewenste experimentele tijdstip wordt geanalyseerd. Incubeer de platen gedurende twee uur. Registreer vervolgens met een ELISA-plaatlezer de absorbantie van zowel de experimentele als de achtergrondputsen bij 490 nm ter voorbereiding op de immunofluorescentie.Kleuring van cel-signaleringsmoleculen en tumorcellen. Ontdooi BME gedurende de nacht in een koelkast van vier graden Celsius op de dag vóór de kleuring. Plaats op de dag van de kleuring een acht-kamer glazen objectglassysteem op een ijsbak in een zuurkast. Gebruik vervolgens een 200 microliter pipet om elke put van het glazen objectglassysteem te coaten met 50 microliters ijskoud BME.Zorg ervoor dat de BME gelijkmatig is verspreid en dat er geen luchtbellen in de wells ontstaan. Incubeer de gecoate slides gedurende 20 minuten. Selecteer een dormante of metastatische tumorcellijn.Oogst de cellen met trypsine zoals eerder beschreven. Voeg vervolgens het totale aantal te kweken cellen samen in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer nu de cellen en aspireer opnieuw voorzichtig het supernatant, waarbij een kleine hoeveelheid medium wordt achtergelaten.Tik tegen de bodem van de conische buis van 15 milliliter om de pellet te resuspenderen tot een enkelcel-suspensie. Resuspendeer de pellet met 400 µL assaymedium per 5 × 10³ cellen. Pipetteer de cellen meerdere keren met een pipette van 5 milliliter om te garanderen dat de enkelcel-suspensie behouden blijft. Pipetteer per putje 400 µL van de celoplossing in elk van de acht BME-gecoate kamers.Incubeer vervolgens het glazen objectglassysteem, aspireer het oude medium en voed de cellen elke vier dagen met nieuw assay-medium op de gewenste experimentele tijdstippen. Aspireer de bovenste laag van het medium en voeg 200 µL fixatief aan aangevuld met tritton toe en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens het triton-aanvullende fixatief en voeg 200 µL enkel fixatief toe en incubeer nog eens 25 minuten bij kamertemperatuur.Zuig het fixatief opnieuw af en voeg nu 400 µL PBS toe aan elke put. Incubeer de plaat nog 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de PBS af en voeg 400 µL PBS toe met 0,05% tussen 20 en incubeer dit nogmaals 10 minuten.Ook bij kamertemperatuur. Blok nu de gefixeerde cellen met 200 µL blokkeringsoplossing. Incubeer de cellen vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur, aspireer na de incubatie de blokkeringsoplossing en voeg aan elk monster 200 µL van het primaire antilichaam toe, verdund in blokkeringsoplossing.Incubeer de slides overnacht bij vier graden Celsius met het primaire antilichaam. Aspireer de volgende dag het antilichaam en was de wells drie keer door telkens 400 µL PBS toe te voegen voor 15 minuten, om de oplossing daarna telkens weer te aspireren. Voeg na het aspireren van de PBS bij de laatste wasbeurt 200 µL toe van een secundair antilichaam geconjugeerd met rhodamine rood.Dek vervolgens het systeem met acht kamers op het objectglas af met aluminiumfolie en laat dit één uur incuberen bij kamertemperatuur. Was daarna de putjes drie keer met PBS, zoals eerder beschreven. Monteer na de derde wasbeurt de objectglazen in beta shield monteermedium met dpi.Droog de coupes tot slot 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Hier wordt een voorbeeld getoond van een proliferatieanalyse van de dormante D 2.0 R- en metastatische D two A one-tumorcellen in de 3D-cultuur. D 2.0 R-cellen blijven latent gedurende de gehele experimentele cultuurperiode van 14 dagen, terwijl de sterk metastatische D two A one-cellen slechts vier tot zes cultuurdagen latent blijven, waarna ze tijdens de initiële dormante fase beginnen te prolifereren.Veel cellen blijven solitair in de 3D-kweek, zoals hier te zien is op een representatieve foto van een kweek op dag vier, terwijl andere niet-prolifererende cellen multicellulaire sferoïden vormen. De overgang van D2A1-cellen van een rusttoestand naar een proliferatieve toestand in 3D-kweek wordt hier getoond op deze foto van een kweek op dag 12. Dit gaat gepaard met dramatische veranderingen in de celmorfologie in deze figuur.Een voorbeeld van een middel dat voorkomt dat D two A one-cellen overgaan van een slapende naar een proliferatieve toestand, wordt getoond door de behandeling van de D two A one-cellen met een specifieke remmer tegen myosin light chain kinase. Houd de D two A one-cellen in een slapende toestand zoals geïllustreerd in deze figuur. Een significante toename van myosin light chain-fosforylering in D two A one-cellen in het rood, gevolgd door reorganisatie van de F actin-filamenten die actin-stressvezels vormen in het groen, vindt plaats tijdens hun overgang van dormantie (dagen 1 tot 4) naar proliferatie.Dag zeven. Echter, het blokkeren van de myosin light chain kinase-activiteit in D2A1-cellen door SHRA of door het geneesmiddel ML-7 houdt D2A1-cellen in een rusttoestand en resulteert in de inhibitie van myosin light chain-fosforylering, F-actine en de organisatie van stressfibers, zoals hier te zien is. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het in vitro-modelsysteem opzet om tumor dormantie en de overgang naar metastatische groei te bestuderen.

an-vitro-system-to-study-tumor-dormancy-switch-to-metastatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Tumor-initiërende cellen (TIC's) kunnen een haalbaar therapeutisch doelwit zijn voor de behandeling van eierstokkanker, een zeer terugkerende en dodelijke ziekte. We presenteren een protocol voor kweekcondities die deze zeer tumorigene populatie cellen verrijken.

In vitro Verrijking van eierstokkanker tumor-initiërende cellen

We ontwikkelden een in vitro model van dormantie in het beenmerg voor oestrogengevoelige borstkankercellen. Het doel van dit protocol is om het gebruik van het model aan te tonen voor de studie van de moleculaire en cellulaire biologie van dormantie en voor het genereren van hypothesen voor verder testen in vivo.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Kiemrust Model van oestrogeen-gevoelige Borstkanker in het beenmerg: A Tool for Molecular Mechanism Studies en Hypothese Generation

We presenteren een driedimensionaal (3D) longkankermodel gebaseerd op een biologisch collageenscaffold om gevoeligheid voor op non-kleincellige-longkanker-(NSCLC)-gerichte therapieën te bestuderen. We demonstreren verschillende meettechnieken om de proliferatie-index, apoptose en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) status te bepalen. Verzamelde gegevens worden geïntegreerd in een in silico model voor voorspelling van drugsgevoeligheid.

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op metastase en het ontcijferen van de werkingsmechanismen mogelijk maakt. Hoewel de hier beschreven experimenten zich richten op Ewing-sarcoom, kan een vergelijkbare aanpak worden toegepast op andere tumortypen.

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

De in vitro Cell Invasion assay wordt gebruikt om het potentieel van kanker metastasen te meten door het cellulaire potentieel voor invasie en migratie te kwantificeren met behulp van celkweek inserts met eiwit matrix. Cellen worden uitgedaagd om te migreren door de eiwit matrix en een poreus membraan, naar een chemoaantretant, en vervolgens gekwantificeerd door lichte microscopie.

Het gebruik van muizen-borstkanker tumor cellen in een in vitro invasie assay als een maat voor oncogene Celgedrag

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer een 3D in vitro assaysysteem om tumorceldormantie en de overgang naar metastatische groei te modelleren. Deze methode maakt real-time, high-throughput analyse van agenten die dormantie of proliferatie beïnvloeden mogelijk.

Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study

Meer video's verkennen