De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van een 3D-reconstructie van menselijke huid voor studies naar de biologie van melanocyten, melanomen en huidstamcellen. Dit wordt bereikt door eerst een insert van weefselkweekplaten te coaten met geneutraliseerd rundercollageen. De tweede stap is het maken van het cellulaire dermale compartiment uit fibroblasten en collageen.

Maak vervolgens het epidermale compartiment van keratinocyten gemengd met melanocyten of melanoomcellen. De laatste stap van de procedure is het oogsten van een huidreconstruct op dag 18 en het transplanteren van een huidreconstruct op een muis. Uiteindelijk tonen immunohistochemische en immunofluorescente analyses van het transplantaat de architectuur van normale huid met melanocyten, de migratie en differentiatie van normale stamcellen en stadiumspecifieke melanoomfenotypen.

We hebben 20 jaar geleden het huidreconstructiemodel ontwikkeld omdat we vroeg in ons onderzoek ontdekten dat normale melanocyten of melanomcellen die in een kweekschaal worden gecultiveerd, heel anders reageren dan cellen in een weefselcontext. Daarom is het huidreconstructiemodel voor ons ideaal om te observeren hoe cellen zich van het ene compartiment in de huid naar een andere plek bewegen. Bereid het eerder voorbereide acellulaire laagcollageenmengsel op ijs en voeg vervolgens één milliliter van de stroolgele oplossing toe aan elke insert van een zes.

Incubeer de weidjes met weefselkweekplaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de gel te laten stollen. Gedurende deze tijd moet de oplossing van kleur veranderen van geel naar roze terwijl de gel stolt. Los human fibroblasten uit hun kweekfles met 0,25% trypsin EDTA; trypsiniseer gedurende vijf minuten. Voeg DMEM met 10% FBS toe om het trypsinisatieproces te neutraliseren.

Verzamel de losgekoppelde cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 200 G bij kamertemperatuur, en resuspendeer de cellen vervolgens op 4,5 × 10⁵ cellen per 1,5 milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS. Vul vervolgens een buis van 50 milliliter met het eerder bereide mengsel van collageen voor de cellaag en plaats de buis op ijs.

Voeg 1,5 milliliters van de fibroblastsuspensie toe aan de buis en meng goed. Voeg drie milliliters van de strogeelgekleurde cellulaire laagoplossing toe aan elke met een acellulaire laag gecoate insert. Incubeer vervolgens het weefkweekplateau gedurende 45 minuten bij 37 degrees Celsius in een weefkweekincubator met 5% carbon dioxide tijdens de incubatieperiode.

De kleur van de oplossing van de cellulaire laag moet ook veranderen van geel naar roze. Nadat de bovenste gellagen is gestold, voegt u twee milliliters DMEM met 10%FBS toe aan de binnenkant van de insert in de weefselkweekplaat, en 10 milliliters aan de buitenkant van de insert. Incubeer de weefselkweekplaten gedurende vier dagen.

Controleer op de vierde dag of de gel is gekrompen; aspireer op deze vierde incubatiedag het medium van zowel de binnen- als de buitenkant van elke insert. Voeg twee milliliters wasmedium toe aan de binnenkant en 10 milliliters aan de buitenkant van de inserts om het reguliere serum weg te wassen. Incubeer de trays vervolgens gedurende één uur bij 37 °C voor de vorming van de epidermis.

Trypsiniseer eerst de humane keratinocyten. Gebruik na vijf minuten een soja-trypsine-inhibitor om de trypsine te neutraliseren, nadat de losgekoppelde cellen vijf minuten lang zijn gecentrifugeerd bij 200 G. Resuspendeer het celpellet vervolgens in medium tot een concentratie van 4,17 × 10⁶ cellen per milliliter.

Reconstitueer medium één nadat de keratinocyten zijn geoogst. Behandel de humane melanocyten één tot twee minuten met trypsine op ijs. Neutraliseer vervolgens de trypsine met soja-trypsine-inhibitor.

Centrifuge de cellen vervolgens onder dezelfde omstandigheden als voorheen en resuspendeer het melanocytpellet in skin-medium tot een concentratie van 8,3 × 10⁵ cellen per milliliter. Reconstitueer ook medium één. Verwijder daarna het wasmedium van zowel de binnen- als de buitenkant van elke insert van een weefselkweekplaat met een geprepareerde dermale laag.

Vervang het wasmedium door 1,5 milliliters huidreconstructiemedium aan de binnenzijde en 10 milliliters aan de buitenzijde van elk insert toe te voegen. Meng vervolgens 600 microliters van de keratinocytencelsuspensie met 600 microliters van de melanocytsuspensie. Doseer 200 microliters van de gemengde celsuspensie.

Voeg het druppelgewijs toe aan de binnenzijde van elk insert. Incubeer de weefselkweekplaat gedurende twee dagen bij 37 °C. Aspireer na incubatie van de cellen het skin reconstruct medium 1 van zowel de binnenzijde als de buitenzijde van elk insert, en voeg vervolgens twee milliliter skin reconstruct medium 2 toe aan de binnenzijde en 10 milliliter aan de buitenzijde van het insert.

Incubeer de reconstructen vervolgens nog twee dagen bij 37 °C. Aspireer na de tweede incubatieperiode van twee dagen het huidreconstructiemedium 2 van zowel de binnen- als de buitenkant van elk inzetstuk. Voeg nu 7,5 ml huidreconstructiemedium 3 toe aan alleen de buitenkant van de inzetstukken.

Plaats de reconstructen terug in de incubator en ververs het medium. Vervang het reconstructiemedium om de dag tot dag 18. Aspireer op dag 18 van de incubatie het medium van de binnen- en buitenkant van de inserts uit een kweekplaat met geladen huidreconstructen.

Verwijder de inzetten met een pincet uit het tray. Snijd het construct, inclusief het polycarbonaatfilter, uit door met een scalpelmes een cirkel vlak langs de rand te trekken. Plaats het reconstruct in het filter vervolgens op een hard oppervlak en snijd deze met het mes doormidden.

Plaats één helft van de reconstructie op een zwart TBS-biopsiepapier en plaats het papier vervolgens in een histologiecassette. Week de gehele cassette gedurende meer dan vier uur in 10% formaline. Plaats de cassette daarna in 70% ethanol en bewaar deze bij vier graden Celsius totdat u klaar bent om de reconstructie te verwerken voor paraffine-inbedding.

Plaats de andere helft van het recontructx in 50% sucrose bij vier graden Celsius gedurende één tot twee uur. Vervang vervolgens de sucrose door twee molar sucrose en bewaar dit nogmaals één tot twee uur bij vier graden Celsius. Vul een basisvorm voor de helft met optimal cutting temperature, vriesmedium of OCT.

Voorkom de vorming van luchtbellen. Pak de rand van het reconstruct met een pincet vast en haal het reconstruct uit de sucrose. Plaats het op Kim wipes totdat de sucrose is geabsorbeerd.

Breng het reconstruct met een pincet en een spatel over in het bootje bovenop de OCT. Bedek de bovenkant van het reconstruct met meer OCT totdat het bootje volledig vol is. Vermijd hierbij opnieuw de vorming van luchtbellen.

Plaats het bootje gelijkmatig op verbrijzeld droogijs om de OCT volledig te laten bevriezen. Wikkel vervolgens de basisvorm en het folie in en bewaar dit bij -70 °C tot u klaar bent om het met een cryostaat te snijden. Ter voorbereiding op het transplanteren van een huidreconstructie bij een muis, vult u een container met vloeibare stikstof en voegt u 5 mL DMEM toe aan een buis van 50 mL.

Vul een bekerglas met 600 milliliters kraanwater en plaats het bekerglas op een warmteplaat om het te verwarmen. Selecteer vervolgens een vrouwelijke skid hairless outbred muis van ongeveer zes weken oud. Anestheseer de muis vervolgens met isofluorine.

Gebruik een neuskegel om de anesthesie gedurende de gehele procedure in stand te houden. Breng steriel oogsmeermiddel aan en zorg voor warmteondersteuning om hypothermie te voorkomen. Reinig vervolgens de huid van de muis met een samengestelde benzoin-tinctuur en alcoholprep-gaasjes.

Markeer een lijn op de rug van de muis om dezelfde positie aan te houden voor de latere hechting. Maak met irisschaar en pincet een rond wondbed op de rug van de muis en bedek het wondbed vervolgens met steriele gazen sponsjes. Plaats de ronde huid van de muis in de 50 milliliter tube met DMEM.

Dompel de buis onder in een container met vloeibare stikstof totdat het medium en het weefsel volledig bevroren zijn. Ontdooi de buis vervolgens in een bekerglas met warm water totdat deze volledig is ontdooid. Herhaal deze vries-dooi-procedure drie keer.

Gebruik een chirurgisch scalpel om een huidreconstructie van een insert te scheiden. Verwijder het membraan zeer voorzichtig en breng de huidreconstructie vervolgens over naar de bovenkant van het wondbed van de muis. Plaats nu de muishuid bovenop de huidreconstructie.

Zorg ervoor dat de eerste hechting bovenop de eerder gemarkeerde markering staat en de tweede aan de onderkant. Gebruik vervolgens twee extra hechtingen aan de zijkanten van de huidreconstructie om de muidenhuid te fixeren. Reinig de muidenhuid na het transplanteren en plaats de muis vervolgens in een nieuwe kooi.

Op dag 18 bestaat de epidermis van de huidreconstructen uit gestratificeerde keratinocytenlagen, waarbij de ongedifferentieerde basale laag en de opeenvolgend gedifferentieerde lagen verticaal georiënteerd zijn. De doorsnede van de reconstructen wordt gekleurd met de melanocytaire marker.

S 100, zoals aangegeven door de zwarte pijlen, laat zien dat melanocyten zijn uitgelijnd in de basale laag van de epidermis en communiceren met meerdere keratinocyten via dendritische uitlopers. Het dermale compartiment bevat fibroblasten ingebed in een matrix van collageen type one; afgezet collageen four geeft het basaalmembraan aan, dat de epidermis scheidt van de dermis. De volgende figuren illustreren hoe meerdere lagen keratinocyten in de epidermis zich ontwikkelen.

Wanneer dermale stamcellen die zijn gelabeld met een GFP-lentivirale vector samen met fibroblasten worden ingebed in een collageen type I-matrix, migreren zij naar de epidermis en differentiëren zij op dag vijf tot melanocyten. Na het uitzaaien van keratinocyten beginnen individuele cellen uit de sferen te migreren.

Let op dat de epidermis nog steeds uit een enkele laag bestaat. Op dag acht bereiken enkele cellen de interface tussen de epidermis en de dermis.

Op dag 10 zijn GFP-positieve cellen strak uitgelijnd op de positie van het basaalmembraan, zoals hier te zien is. Gemigreerde GFP-positieve cellen in de epidermis brengen de melanocytaire marker HMB 45 tot expressie. Wanneer verschillende stadia van melanoomcellijnen worden opgenomen in huidreconstructen, weerspiegelt het gedrag van de cellen hun in vivo kenmerken.

In deze figuur zijn normale melanocyten en melanomcellen te zien die zijn gekweekt in 2D-culturen. De locatie en de groeisnelheid van normale melanocyten worden in huidreconstructen strikt gecontroleerd zoals hier te zien is; in de radiale groeifase prolifereren primaire melanomen hoofdzakelijk in de epidermis, terwijl melanomen in de verticale groeifase invasief groeien in de dermis, zoals in deze figuur wordt getoond. Tot slot is hier de manier te zien waarop metastatische melanomen agressief diep in de dermis invallen.

Onze studies naar normale huid vormen de basis voor een betere kennis van de ontwikkeling en progressie van melanomen.