De driedimensionale menselijke huid Reconstrueer model: een instrument om de normale huid en melanoomprogressie Study

Het algemene doel van deze procedure is om een 3D reconstructie van menselijke huid te genereren voor onderzoek naar melanocyten, melanoom en huidstamcellen. Dit wordt bereikt door eerst een insert van weefselkweekschalen te coaten met geneutraliseerd bovien collageen. De tweede stap is om het cellulaire dermale compartiment te maken van fibroblasten en collageen.

Vervolgens maakt u het epidermale compartiment van keratinocyten gemengd met melanocyten of melanoomcellen. De laatste stap van de procedure is om een huidreconstructie op dag 18 te oogsten en een huidreconstructie op een muis te enten. Uiteindelijk laten immunohistochemische en immunofluorescente analyses van het entingsgebied de architectuur van normale huid zien met melanocyten, de migratie en differentiatie van normale stamcellen en stadia-specifieke melanoomfenotypes.

We ontwikkelden het huidreconstructiemodel 20 jaar geleden omdat we al vroeg in onze studies ontdekten dat normale melanocyten of melanoomcellen die op een schaal worden gekweekt zich heel anders gedragen dan cellen die zich in een weefselcontext bevinden. Dus het huidreconstructiemodel is ideaal voor ons om te zien hoe cellen van het ene compartiment in de huid naar een ander plaats bewegen. De eerder bereide acellulaire laag collageenmix op ijs en voeg vervolgens een milliliter van de strogele oplossing toe aan elke insert van een zes.

Wel tissuekweekschaal incubeer de schaal gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om het gel te laten stollen. Gedurende deze tijd zou de oplossing van kleur moeten veranderen van geel naar roze terwijl het gel stolt, probeer ogen, menselijke fibroblasten uit hun kweekfles te halen met 0,25% tripsine EDTA na vijf minuten. Voeg DMEM met 10%FBS toe om het neutralisatieproces te neutraliseren.

Verzamel de losgelaten cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 200 G bij kamertemperatuur en suspendeer vervolgens de cellen opnieuw bij 4,5 keer 10 tot de vijfde cellen per 1,5 milliliter. DMEM aangevuld met 10%FBS. Vul vervolgens een 50 milliliter buis met het eerder bereide cellulaire laag collageenmengsel en plaats de buis op ijs.

Voeg 1,5 milliliter van de fibroblastensuspensie toe aan de buis en meng. Wel. Voeg drie milliliter van de strogele cellulaire laag oplossing toe aan elke acellulaire laag gecoate insert. Bewaar vervolgens de tissuekweekschaal gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide tissuekweekincubator tijdens de incubatieperiode.

De kleur van de cellulaire laagoplossing moet ook veranderen van geel naar roze. Nadat de bovenste laag gel is gestold, voegt u twee milliliter DMEM met 10%FBS toe aan de binnenkant van de insert in de tissuekweekschaal en 10 milliliter aan de buitenkant van de insert. Bewaar de tissuekweekschalen gedurende vier dagen.

Controleer op de vierde dag dat het gel op de vierde dag van incubatie samentrekt. Zuig het medium uit beide binnen- en buitenkant van elke insert. Voeg twee milliliter wasmedium toe aan de binnenkant en 10 milliliter aan de buitenkant van de inserts om het normale serum weg te spoelen. Bewaar vervolgens de schalen gedurende één uur bij 37 graden Celsius voor het genereren van de epidermis.

Eerst trypsine is menselijke keratinocyten. Gebruik vervolgens na vijf minuten sojabonen trypsine-remmer om de trypsine te neutraliseren na het draaien van de losgelaten cellen bij 200 G gedurende vijf minuten. Hersuspensie het cellenpellet bij 4,17 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in huid.

Reconstrueer medium een na het oogsten van de keratinocyten. Trypsine ijs menselijke melanocytes gedurende één tot twee minuten. Neutraliseer opnieuw de trypsine met sojabonen trypsine-remmer.

Vervolgens, na het draaien van de cellen onder dezelfde omstandigheden als voorheen, suspendeer het melanocytenpellet opnieuw bij 8,3 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter in huid. Reconstrueer medium een ook. Vervolgens verwijdert u het wasmedium van zowel de binnen- als buitenkant van elke insert van een dermale laag bereide tissuekweekschaal.

Vervang het wasmedium door 1,5 milliliter huid toe te voegen, reconstrueer medium een aan de binnenkant en 10 milliliter aan de buitenkant van elke insert. Meng vervolgens 600 microliters van de keratinocytcellensuspensie met 600 microliters van de melanocytensuspensie. Verdeel 200 microliters van de gemengde cellensuspensie.

Druppel voor druppel naar de binnenkant van elke insert. Bewaar de tissuekweekschaal gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius. Na het incuberen van de cellen, zuigt u het huid, reconstrueer medium een uit zowel de binnen- als buitenkant van elke insert en voeg vervolgens twee milliliter huid, reconstrueer medium, twee toe aan de binnenkant en 10 milliliter aan de buitenkant van de insert.

Bewaar vervolgens de reconstructies gedurende nog eens twee dagen bij 37 graden Celsius. Na de tweede twee dagen incubatie, zuigt u het huid, reconstrueer medium twee uit de binnen- en buitenkant van elke insert. Voeg nu 7,5 milliliter van het huid, reconstrueer medium drie toe aan alleen de buitenkant van de inserts.

Plaats de reconstructies terug in de incubator en verander het huid. Reconstrueer medium drie om de andere dag tot dag 18. Op dag 18 van de incubatie, zuigt u de media uit de binnen- en buitenkant van de inserts van een huidreconstruct geladen tissuekweekschaal.

Verwijder de inserts uit de schaal met pincetten. Snijd het construct uit, inclusief de polycarbonaatfilter door een cirkel te trekken dicht bij de rand met een scalpelblad. Plaats vervolgens de reconstructie in de filter op een hard oppervlak en snijd ze doormidden met het blad.

Plaats de helft van de reconstructie op een zwart TBS biopsiepapier en plaats vervolgens het papier in een histologie cassette. Week de gehele cassette in 10%formaline voor meer dan vier uur. Plaats vervolgens de cassette in 70%ethanol en bewaar het bij vier graden Celsius tot u klaar bent om de reconstructie te verwerken voor paraffine-inbedding.

Plaats de andere helft van de reconstruct