Name: High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Leer een kosteneffectieve high-throughput methode om endoglucanase-activiteit te screenen in Escherichia coli met visuele aflezing via Congo Red. Deze aanpak elimineert enzymzuivering en versnelt het screenen van uitgebreide enzymvariantbibliotheken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Gordon en Betty Moore Foundation, en door de UNCF / Merck Science Initiative.

1. Screening plaat voorbereiding <ol><li> Voeg 25g LB groeimedium, 15 g agar, en 1,5 g carboxymethylcellulose (CMC) substraat aan 1L gedestilleerd water, en de autoclaaf te steriliseren. </li><li> Na de autoclaaf, laat medium laten afkoelen en voeg de juiste antibiotica, en IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 100 urn. </li><li> Iedere gieting 200mL medium in vijf grote vierkante petrischaaltjes / bioassay trays (240 x 240 x 20mm of groter). Laat platen volledig drogen. </li></ol> 2. Endoglucanase bibliotheek generatie en het scherm <ol><li> Genereer een bibliotheek van endoglucanase katalytische domein (en). Dit kan worden bereikt op vele manieren (bijvoorbeeld plaats-gerichte of willekeurige mutagenese, recombinatie, etc.) en wordt bepaald door de onderzoeker. </li><li> Kloon van de bibliotheek in een vector zodanig dat zij onder de controle van de T7-promotor met het lac operator, en bevatten een pelB signaalsequentie voor het richten van de periplasma. Een voorbeeld van een geschikte vector is pET22b (+) van Novagen. </li><li> Transformeren de endoglucanase bibliotheek in E. coli-stam BL21 (DE3) en de plaat voor enkele kolonies. </li><li> &#39;S nachts Incubeer transformatie bij 37 ° C. </li><li> Met behulp van steriele tandenstokers, enten klonen in 96 goed deep-well platen die 400μL LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht met schudden bij 250 rpm. </li><li> Voeg steriele glycerol aan 96 goed &#39;s nachts culturen tot een uiteindelijke concentratie van 10% voor de lange termijn opslag bij -80 ° C. Dit zal de meester plaat worden. </li><li> Met behulp van een 96-pin stempel, repliceren plaat &#39;s nachts culturen op de screening platen met IPTG en CMC. Tot 5 sets van &#39;s nachts culturen kan worden afgestempeld op elke screening plaat. </li><li> Label de screening platen, zodat de identiteit en de oriëntatie van elk 96 wells plaat is bekend. </li><li> Incubeer de gestempelde bibliotheken bij kamertemperatuur (17-25 ° C) &#39;s nachts of tot de zichtbare kolonies hebben gevormd. </li><li> Spoel plaat met gedestilleerd water totdat alle sporen van de kolonies worden verwijderd. </li><li> Pour Congo Rood (CR; 0,5% in water) op gewassen plaat. Zorg ervoor dat u net genoeg CR toe te voegen aan de plaat te dekken. </li><li> Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Niet meer dan 15 minuten voor CR incubatie. Langere incubatietijden zal resulteren in minder duidelijk halo&#39;s. </li><li> Giet CR en voeg een flinke hoeveelheid (meer dan genoeg om de plaat te dekken) van 1M NaCl. </li><li> Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Giet NaCl aan CMC degradatie halo&#39;s zichtbaar te maken. Voor een betere resolutie van de halo&#39;s, kan het langer incubatietijden met NaCl of meerdere NaCl wasbeurten nodig zijn. </li><li> Met behulp van een steriele tandenstoker, pick actieve enzymen klonen van de master-plaat voor verdere karakterisering. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van de uitlezing voor deze high throughput scherm wordt weergegeven in figuur 3. Klonen kunnen worden geïdentificeerd als inactief, zwak actief, en zeer actieve basis van de grootte van de degradatie zone. Dit is vooral handig als een enzym van bekende activiteit is opgenomen in de bibliotheek als een referentie. Zoals hier weergegeven, is de identificatie van actieve enzymen is robuust en reproduceerbaar. Maar, wees ervan bewust dat een adequate etikettering van de screening platen is uiterst belangrijk. De onderzoeker moet in staat zijn om actief varianten te identificeren na het wassen van de kolonies weg, om ze te kiezen uit de master plaat opgeslagen bij -80 ° C voor verdere karakterisering. Tot slot is het moeilijk in te schatten a priori de relatie tussen de activiteiten op het kunstmatige versus natuurlijke substraten. Daarom moet de onderzoeker test alle positieve klonen op industrieel relevante materiaal om eiwit conditie te bepalen. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Schematisch overzicht van de screening procedure. Cellen worden getransformeerd met een endoglucanase bibliotheek en selectief plated voor enkele kolonies. Klonen geplukt en gegroeid &#39;s nachts in 96 goed diep en platen voor (1) opslag bij -80 ° C en (2) replica plating op borden met CMC en IPTG aan endoglucanase expressie induceren. Actief klonen worden geplukt van de master plaat bewaard bij -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Klonering en expressie van schimmels katalytische domeinen in E. coli. (A) endoglucanase expressievector. Genen werden gekloneerd in pET22b (+) (Novagen) onder controle van de T7-promotor. (B) Rechts panel: endoglucanase-expressie BL21 (DE3) kolonies. Linker paneel: CMC degradatie halo&#39;s na het wassen en ontwikkeling met Congo Red. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Voorbeeld resultaten van CMC / Congo Red scherm. Foto&#39;s genomen van de screening platen na het wassen en Congo Red ontwikkeling. Alle kolonies op screening platen waren van vergelijkbare grootte.

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het protocol hier beschreven staat stelt snel en high throughput identificatie van actieve enzymen, met een minimum aan manipulatie. Activiteit detectie is vrij gevoelig, en kwalitatief weerspiegelt de hoeveelheid activiteit in de cel. Het gebruiksgemak maakt deze methode geschikt voor een breed scala van enzym bibliotheken, slechts beperkt door de functionele expressie in E. coli. Bovendien is de activiteit van dit soort screening niet beperkt tot schimmel cellulasen, maar kan worden aangepast voor elke endogl...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Product nummer </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Congo Red </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carboxymethylcellulose </td><td> Sigma </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Bioassay platen </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

high throughput screening van fungal endoglucanase activiteit in escherichia coli</em

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymen (endoglucanasen, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase) hydrolyseren cellulose in de component suikers, die op zijn beurt kan worden omgezet in brandstof alcoholen 1. Het potentieel voor enzymatische hydrolyse van cellulosehoudende biomassa om duurzame energie te bieden heeft op meer inspanningen om cellulasen engineer voor een economische productie van brandstoffen 2. Van bijzonder belang zijn schimmel cellulasen 3-8, die al industrieel gebruikt voor voedingsmiddelen en textiel verwerken. Het identificeren van actieve varianten onder een bibliotheek van mutant cellulasen is cruciaal voor het engineeringproces, actief mutanten kan verder worden getest op verbeterde eigenschappen en / of onderworpen aan extra mutagenese. Efficiënte engineering van schimmel cellulasen werd belemmerd door een gebrek aan genetische tools voor inheemse organismen en door de moeilijkheden in de uiting van de enzymen in heterologe gastheer. Onlangs Morikawa en collega&#39;s ontwikkelden een methode voor het uitdrukken in E. coli de katalytische domeinen van endoglucanasen uit H. jecorina 3,9, een belangrijke industriële schimmel met de capaciteit om cellulasen in grote hoeveelheden afscheiden. Functionele E. coli expressie is ook gemeld voor cellulasen van andere schimmels, waaronder Macrophomina phaseolina 10 en Phanerochaete Chrysosporium 11-12. We presenteren een methode voor high throughput screening van schimmels endoglucanase activiteit in E. coli. (Fig 1) Deze methode maakt gebruik van de gemeenschappelijke microbiële kleurstof Congo rood (CR) te visualiseren enzymatische afbraak van carboxymethylcellulose (CMC) door de cellen kweken op vast medium. De activiteit test vereist goedkoop reagentia, minimale manipulatie, en geeft eenduidige resultaten zones van afbraak (&#39;halo&#39;) op de kolonie site. Hoewel een kwantitatieve meting van de enzymatische activiteit kan niet worden bepaald door deze methode, hebben we ontdekt dat Halo grootte correleert met een totale enzymatische activiteit in de cel. Verdere karakterisering van de individuele positieve klonen zal bepalen, ten opzichte van eiwitten fitness. Traditionele bacteriële hele cel CMC / CR-activiteit assays 13 te betrekken gieten agar met CMC op kolonies, die onderworpen is aan kruisbesmetting, of incuberen culturen in CMC agar putten, die minder vatbaar is voor grootschalige experimenten. Hier hebben we melding van een verbeterde protocol dat de bestaande wassen methoden 14 voor cellulase activiteit verandert: de cellen gekweekt op CMC agar platen zijn voorafgaand aan de CR vlekken verwijderd. Ons protocol vermindert kruisbesmetting en is zeer schaalbaar, waardoor de snelle screening van duizenden klonen. Naast de H. jecorina enzymen, hebben we uitgesproken en gescreend endoglucanase varianten uit de Thermoascus aurantiacus en Penicillium decumbens (getoond in Figuur 2), wat suggereert dat dit protocol is van toepassing op enzymen uit een reeks van organismen.

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit in<em&gt; E. coli.</em&gt; De methode is gebaseerd op een eenvoudige visuele uitlezing van substraat degradatie, vereist geen enzymen zuivering, en is zeer schaalbaar. Dit maakt het mogelijk om een ​​snelle screening van grote bibliotheken van enzym varianten.

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase-enzymen (endoglucanasen, cellobiohydrolasen en &beta;-glucosidasen) hydrolyseren cellulose tot component-suikers, die op hun beurt kunnen worden omgezet ...

In deze high-throughput screening naar fungal endoglucanase-activiteit in E. coli wordt de gangbare microbiële kleurstof Congo Rood gebruikt om de enzymatische afbraak van carboxymethylcellulose te visualiseren door cellen die groeien op een vast medium. Eerst worden de cellen getransformeerd met een endoglucanase-bibliotheek en selectief geplaatst voor enkelvoudige kolonies. Vervolgens worden individuele klonen gepickt en gedurende de nacht gekweekt in 96-wells platen. Daarna wordt een enzymatische screening uitgevoerd door replica-plating op CMC-platen met IPTG om de expressie van endoglucanase te induceren.Ten slotte worden de actieve klonen gepikt van de masterplaat die bewaard is bij -80 °C. Deze assay levert eenduidige resultaten op in de vorm van degradatiezones op de plek van de kolonie, waarbij de grootte van de halo correleert met de enzymatische activiteit en een kwalitatieve beoordeling van de relatieve eiwitfitness mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de overlay-methode, is dat het high-throughput analyse mogelijk maakt met een zeer laag percentage fout-positieven.Voeg 25 gram LB-groeimedium, 15 gram agar en 1,5 gram carboxymethylcellulose-substraat toe aan één liter gedestilleerd water en steriliseer dit in een autoclaaf. Nadat het medium is afgekoeld, worden de juiste antibiotica en IPTG toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 micromolar. Giet vervolgens telkens 200 milliliter medium in vijf grote vierkante petrischalen of bio-assay trays en laat de platen volledig drogen.Genereer eerst een bibliotheek van endoglucanasetische katalytische domeinen in een geschikte vector, zoals PET 22 B plus van Novagen. Genereer eerst een bibliotheek van endoglucanasetische katalytische domeinen in een geschikte vector, zoals PET 22 B plus van Novagen, die de T7-promotor met een lac-operator en een PAL-LV-signaalsequentie bevat voor targeting naar het periplasma. Transformeer de endoglucanasetische bibliotheek in E. coli-stam BL 21 DE3 en plaat dit voor enkele kolonies met behulp van glasperlen; incubeer de transformatie overnacht bij 37 °C. Inoculeer vervolgens met steriele tandenstokers klonen in 96-wells platen.Vul deep well plates met 400 µL LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 250 RPM. Voeg nu steriel glycerol toe aan de overnight culturen in de 96-well platen voor langdurige bewaring bij -80 °C.Dit wordt de masterplaat waarbij een 96-pins stempel wordt gebruikt; replicaat de overnight-culturen op de screeningsplaten die IPTG en CMC bevatten voor elke screeningsplaat. Stempel vijf sets overnight-culturen, label deze en incubeer ze bij kamertemperatuur totdat er zichtbare kolonies zijn gevormd. Ga door met het spoelen van de plaat met gedestilleerd water totdat alle sporen van de kolonies zijn verwijderd.Giet net genoeg 0,5% Congo-rood over de gewassen plaat om deze te bedekken en incubeer maximaal 15 minuten bij kamertemperatuur. Giet de kleurstof af met een ruime hoeveelheid één molar natriumchloride en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het natriumchloride om de halo's van CMC-degradatie zichtbaar te maken.Select met een steriele tandenstoker actieve enzymen van de masterplaat voor verdere karakterisering. In dit voorbeeld werden expressievectoren voor endo-glucanase gegenereerd in pET-22b(+) onder controle van de T7-promotor met een lac-operator. De resulterende BL21-kolonies die endo-glucanase tot expressie brachten, werden vervolgens gescreend op de productie van CMC-degradatiehalo's. Na wassen en ontwikkelen met Congo-rood kunnen klonen op deze screeningplaten doorgaans worden geïdentificeerd als inactief, zwak actief of sterk actief, op basis van de grootte van de degradatiezones.Hier is de identificatie van actieve enzymen robuust en reproduceerbaar. Het is belangrijk om de screeningsplaten correct te labelen om de positieve klonen in de masterplaat juist te kunnen identificeren.

high-throughput-screening-fungal-endoglucanase-activity-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Source: Kim, H. et. al., Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a genetic screening method to detect enzyme expression using metagenomic fosmid libraries and chromogenic substrates. Flow cytometry identifies and isolates single cells producing colored products, enabling high-throughput selection of active enzyme-expressing cells.

Detection of Target Enzyme Expression in Genetically Modified Bacterial Cells

In this video, we demonstrate a high throughput assay for carbohydrate-active enzyme screening using insoluble chromogenic polymer hydrogel substrates. The enzyme degrades these substrates into a soluble colored product that can be quantified by measuring the color intensity of the product.

Chromogenic Polymer Hydrogel-Based Enzyme Screening Assay: A High Throughput Method to Screen the Carbohydrate-Active Enzymes Using Synthetic Substrates

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Eiwit co-expressie is een krachtige alternatief voor de reconstitutie in vitro van eiwitcomplexen, en helpt bij het uitvoeren van biochemische en genetische tests in vivo. Hier rapporteren we over het gebruik van eiwit co-expressie in Escherichia coli om eiwitcomplexen te verkrijgen en om de mutatiefrequentie van cellen af te stemmen.

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer een kosteneffectieve high-throughput methode om endoglucanase-activiteit te screenen in Escherichia coli met visuele aflezing via Congo Red. Deze aanpak elimineert enzymzuivering en versnelt het screenen van uitgebreide enzymvariantbibliotheken.

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli

Meer video's verkennen