Multi-electrode array Opnamen van neuronale Lawines in organotypische culturen
August 1st, 2011
Een krachtige manier om de neuronale lawines, dat wil zeggen schaal-invariant spatio-temporele activiteit uitbarstingen, indicatief van kritieke toestand dynamiek in cortex te bestuderen. Lawines ontstaan spontaan in de ontwikkeling van oppervlakkige lagen van gekweekte hersenschors, die voor de lange termijn metingen van de activiteit mogelijk maakt met vlakke geïntegreerde multi-elektrode arrays (MEA) onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden.
Het doel van dit experiment is om de zelforganisatie van gezonde hersenactiviteit in neuronale lawines te bestuderen, het kenmerk van dynamische kritische toestand in de cortex. Dit wordt bereikt door een coronaal gelaagd cortexsnijpje samen te brengen met een middenhersensnijpje, wat ontwikkelingsbelangrijke dopaminerge inputs naar de cortex biedt. Als tweede stap wordt de Cortex-middenhersenco-cultuur gekweekt op een multi-elektrodenarray, wat multi-site stimulatie en registratie van neuronale activiteiten in de cultuur mogelijk maakt.
Vervolgens laten we de co-cultuur plat vallen, uitbreiden en hechten aan het MEA-oppervlak gedurende de eerste één tot twee weken in een speciaal ontworpen incubator, die de cultuur door een cyclus van blootstelling aan normale lucht en cultuur laat gaan. Vloeibare resultaten worden verkregen die de spontane zelforganisatie van ruimtelijk-tijdelijke lokale veldpotentiaaluitbarstingen in neuronale lawines laten zien. Gebaseerd op MEA-opnames en offline lawineanalyse die de machtswet in lawinegrootte identificeert.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals gedissocieerde culturen, is de aspect van systemen en neurowetenschap. We kunnen veel hersengebieden samen co-cultiveren en deze multi-regioculturen vestigen een hersenorganisatie die correct is op grote schaal, zoals corticale lagen en projectiesystemen. Toepassingen van deze techniek gaan verder dan alleen het bestuderen van neuronenlawines.
Bijvoorbeeld kunnen we stimulus in reactie op het netwerkniveau bestuderen onder precies gecontroleerde in-vitro-omstandigheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de juiste toepassing van het plasma-trombinemengsel en het positioneren van het weefsel op de MEA moeilijk te leren is. Deze stappen vereisen goed timing, de juiste temperatuurgradiënt en het vermijden van direct contact met het delicate MEA-oppervlak.
Om een steriele, afsluitbare glazen kamer voor opnames voor te bereiden, snijd eerst glascilinders met schroefdraad met een Teflon-kunststof dop, ongeveer twee millimeter vanaf de onderkant van de draad. Deze zijn nodig voor een veilige en strakke sluiting van de cultuurkamer. Reinig vervolgens de glasringen door ze drie keer met water te spoelen, en vervolgens vijf minuten te koken in 200 proof ethylalcohol.
Laat deze drogen en een siliconenoplossing is vereist om de glasringen aan het MEA-oppervlak te bevestigen. Gebruik een Cell Guard 180 4 siliconenkit en meng 15 milliliter van delen A en B grondig. Laat het vervolgens 15 minuten staan om luchtbellen te verwijderen.
Scheiden de oplossing in één milliliter Eloqua en bewaar deze bij minus 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Lijm nu een glasring op de MEA door één milliliter siliconen op 23 graden Celsius op te nemen in een spuit met een naald met een kleine gauge en het aan te brengen op het ongepolijste snijvlak van de glasring. Centreer vervolgens de glasring op de MEA en breng een extra laag siliconen aan rond de buitenkant van de ring voor een sterkere afdichting.
Laat dit een tot twee uur uitharden op ongeveer 60 graden Celsius op een hot plate. Steriliseer vervolgens de MEA-kamer en kamerdeksels onder laminaire flow-kap door drie keer in gedeïoniseerd water te spoelen en vervolgens drie keer met 70% alcohol voor de laatste spoeling. Laat de kamer 10 minuten in de alcohol staan.
Blootstel de kamer en het interieur van het deksel vervolgens gedurende 10 minuten aan UV-licht. Steriliseer bij 120 graden Celsius gedurende 45 minuten. Laat deze na sterilisatie drogen.
Bekleed nu het MEA-oppervlak binnen de cultuurkamer met poly D-lysine. Nieuwe MEA's zoals gebruikt in dit experiment zijn nogal lipofiel, dus bekleed door herhaalde druppel. Aspirate de oplossing van het elektrodenrooster.
Bevestig het deksel om de MEA-kamer te verzegelen voor opslag en toekomstig gebruik. Deze procedure levert cortex- en VTA-secties voor ongeveer 12 co-cultuur en moet worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap onder steriele omstandigheden met behulp van gezonde een tot twee dagen postnatale dieren, de totale tijd voor weefselverzameling mag minder dan een uur zijn. Begin na de onthoofding met het verwijderen van de hersenen door eerst twee laterale schaarsneden te maken om de huid van de hoofdhuid te verwijderen.
Verwijder vervolgens en open de schedel met fijne oogscharen, waarbij één sagittale middenlijnsnede wordt gemaakt op één coronale snede bij de cortex-cerebellumverbinding. Draai alle vier deze schedelkleppen terug om de hersenen bloot te leggen. Snijd vervolgens frontaal door de reukbol met een aangescherpte spatel.
Breng vervolgens de spatel elk kwartier onder de hersenen. Til de hersenen voorzichtig uit de schedel en laat ze in gekoeld gaze glijd. Oplossing voor snelle koeling en tijdelijke opslag.
Herhaal de bovenstaande procedure voor nog twee hersenen. Om VTA-weefsel te verkrijgen, breng de hersenen over op een steriele droge petrischaal. Verwijder eventueel overtollig vocht door elke hersenen zijwaarts ongeveer een centimeter te laten glijden met een kleine spatel.
Gebruik vervolgens een scheermes om de hersenstammen te verwijderen door een coronale verticale snede te maken ter hoogte van het cerebellum. Plak vervolgens een agarblok op een montageschijf voor mechanische stabilisatie van de hersenen tijdens de snijproceduur. Plaats vervolgens een dunne lijn superlijm, een paar millimeter voor het agarblok op de schijf, maar vermijd dat de lijm het agar raakt met behulp van een kleine spatel.
Breng en monteer elke hersenen met de frontale pool naar beneden. Zorg ervoor dat de frontale polen aan de montageschijf zijn vastgelijmd en dat de ventrale kanten zonder lijmresten op het agar aanraken. Dit zorgt voor een goede mechanische stabilisatie tijdens het snijden en een gemakkelijke verwijdering van de gesneden plakken.
Dompel vervolgens de montageschijf met de gemonteerde hersenen voorzichtig onder en zet deze vast in een vibram-schaal gevuld met gekoeld gaze-oplossing. Snijd vervolgens met een zorg
Overzicht
Deze studie onderzoekt de zelforganisatie van neuronale lawines in de cortex, indicatief voor dynamische kritieke toestand. Door gebruik te maken van een co-cultuur van cortex en middenherfsnedes op multi-elektrode arrays, legt het onderzoek spontane neuronale activiteit vast over tijd.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Elektrofysiologie
- Neuronale dynamica
Achtergrond
- Neuronale lawines zijn schaalinvariante uitbarstingen van activiteit.
- Ze weerspiegelen dynamische kritieke toestand in de cortex van de hersenen.
- Inzicht in deze dynamischa kan inzicht bieden in hersenorganisatie.
- Multi-elektrode arrays maken gedetailleerde opname van neuronale activiteit mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om de zelforganisatie van hersenactiviteit in neuronale lawines te onderzoeken.
- Om een co-cultuursysteem te gebruiken voor het bestuderen van interacties tussen hersengebieden.
- Om de voordelen van multi-regioculturen te beoordelen ten opzichte van gedissocieerde culturen.
Gebruikte methoden
- Co-cultuur van coronale cortex en middenherfsnedes op multi-elektrode arrays.
- Langdurige monitoring van neuronale activiteit in een gecontroleerde omgeving.
- Analyse van lokale veldpotentiaal uitbarstingen om lawinekarakteristieken te identificeren.
- Voorbereiding van steriele kweekkamers en weefselsnedes onder laminaire stromingsomstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Spontane neuronale lawines werden waargenomen in het co-cultuursysteem.
- Machtswetverdelingen werden geïdentificeerd in lawinegrootten.
- De techniek maakte nauwkeurige controle van experimentele omstandigheden mogelijk.
- Demonstreerde de haalbaarheid van het bestuderen van netwerkniveaureacties in vitro.
Conclusies
- De co-cultuurmethode biedt een robuust platform voor het bestuderen van neuronale dynamica.
- Het versterkt het begrip van kritisch gedrag in de cortex.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot verschillende aspecten van netwerkneurowetenschap.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the self-organization of neuronal activity into scale-invariant avalanches provides a mechanistic window into cortical criticality, a state hypothesized to optimize information processing. This in vitro co-culture model enables reproducible observation of avalanche dynamics under controlled conditions, supporting target validation and assay development in neuroscience drug discovery. The approach de-risks mechanistic hypotheses by linking network-level electrophysiological phenotypes to underlying cellular and molecular pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying spontaneous network bursting patterns that reflect cortical excitation-inhibition balance.
- Operational Value: Enables functional validation of molecular targets through perturbation of avalanche size distribution and critical exponent.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that shift network dynamics away from criticality, indicating potential functional impact.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares disease-relevant neuronal networks for downstream compound screening by establishing baseline avalanche statistics.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative readouts (avalanche size, duration, power law exponent) suitable for high-content electrophysiological screening.
- Platform Value: Leverages multi-electrode array technology for scalable, reproducible monitoring of spatiotemporal activity across dozens of sites.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains laminar cortical organization and dopaminergic innervation, enhancing disease relevance for neuropsychiatric disorder models.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical workflows by providing a stable, long-term culture system for chronic compound exposure studies.
- Predictive Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating in vitro avalanche modulation with in vivo network biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically supporting electrophysiological phenotyping in neuronal networks.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether genetic or pharmacological perturbations alter the scale-free organization of cortical activity.
- Screening: Delivers assay-ready networks with reproducible LFP burst statistics, enabling reliable compound effect detection across concentrations.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables (avalanche size distribution, critical exponent, branching parameter) for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through preserved cortical layering and midbrain-cortical projections relevant to dopamine-dependent pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform applicable to multiple target classes and disease areas involving network dysfunction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement by linking molecular interventions to emergent network criticality.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through sterile chamber preparation, controlled tissue plating, and automated LFP thresholding.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early biomarkers of network dysfunction, reducing late-stage attrition due to unanticipated cognitive or behavioral effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by quantifying how compounds affect fundamental cortical dynamics rather than isolated synaptic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue dissection, plasma-thrombin bonding, and multi-electrode array handling under laminar flow.
- Dependent on specialized instrumentation including multi-electrode arrays, environmental incubators with humidity cycling, and electrophysiology recording systems.
- Necessitates cross-team standardization of avalanche detection algorithms, threshold settings, and binning parameters for reproducible analysis.
- Involves adaptation considerations when extending to disease models or human iPSC-derived cortical cultures to maintain laminar development.
- Limited by the technical challenge of maintaining long-term culture stability and preventing electrode fouling over multi-week recording periods.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:09
Preparation of a Glass Chamber with Integrated Microelectrode Arrays (MEA)
5:00
Cortex and Ventral Tegmental Area (VTA) Tissue Dissection
8:46
Mounting Cortex and VTA Tissue Slices on the MEA
11:20
Electrophysiological Recording of Spontaneous and Stimulus-Evoked Neural Activity
13:38
MEA Recording Results
15:31
Conclusion
