Name: Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie van menselijke eilandjes van Langerhans uit pancreasweefsel van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomie ondergaan. Deze methode maakt functioneel onderzoek naar diabetes mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen onze vele collega&#39;s die hulp, advies en kritische inbreng van de verschillende stadia van het project bedanken. De productie van deze video artikel werd ondersteund met middelen van het Duitse ministerie voor Onderwijs en Onderzoek (BMBF) aan het Duitse Centrum voor Diabetes Onderzoek (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) en het Academisch Ziekenhuis Carl Gustav Carus aan de Technische Universiteit Dresden. Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen uit het zevende van de Europese Gemeenschap kaderprogramma (FP7/2007-2013) voor het Innovative Medicine Initiative onder subsidieovereenkomst n ° 115005.

1. Alvleesklierweefsel collectie in de operatiekamer <ol><li> De chirurg voert een gedeeltelijke resectie van de alvleesklier. </li><li> Na het plaatsen van de alvleesklier model in een doos op ijs, direct afleveren bij de patholoog. </li></ol> 2. Weefsel selectie voor eilandje isolatie <ol><li> De patholoog kiest weefsel dat verschijnt zacht en gezond, met behoud van het beschadigde weefsel voor diagnostische doeleinden. Fibrotische weefsel en exemplaren met minder dan 2 g bruikbaar weefsel zijn uitgesloten van eilandje isolement. </li><li> Dompel de pancreas weefsel in Euro Collins Solution en leveren op het ijs naar het laboratorium. </li></ol> 3. Isolatie van menselijke eilandjes <ol><li> Weeg de pancreas weefsel, dan plaats deze in een 10 cm schotel. </li><li> Doe 150 ml RPMI media in een 500 ml kolf. </li><li> In een kolf van 250 ml, de voorbereiding van de verteringsenzymen oplossing door het combineren van 130 ml RPMI-medium met 100 mg / ml DNase en 20 ml van 5mg/ml Liberase RI. Trek 10 ml van deze oplossing in een spuit aan de pancreas weefsel te injecteren. </li><li> Injecteer de spijsverteringsenzym oplossing in de pancreas weefsel, met als doel homogeen opgerekt het. Als dit wordt voorkomen door fibrose, zal de spijsvertering waarschijnlijk mislukken. Vervolgens gehakt het weefsel in de ~ 4 mm 3 stuks op ijs. </li></ol> 4. Menselijke pancreas spijsvertering circuit <ol><li> Monteer de spijsvertering circuit zoals weergegeven in figuur 1. De stromingsrichting in de Ricordi kamer is aan de onderzijde en uit aan de bovenkant van de kamer. </li><li> Voeg de resterende spijsverteringsenzym oplossing om de kolf van 500 ml tot een totaal volume van 300 ml en plaats een thermometer. </li><li> Breng de pancreas weefsel in de kamer, steek de mesh (poriëndiameter: 600 pm) en drie Siliciumnitride Marbles (diameter: 15 mm), sluit de kamer en start de pomp met de stroom ingesteld op 140 ml / min. </li><li> Wanneer de temperatuur van het circuit 37 ° C bereikt, start de timing en periodiek monsters om te bepalen wanneer de spijsvertering te stoppen te nemen. Kleuring met dithizone (2 mg / ml) kunnen microscopische visualisatie van eilandjes binnen de verteerd weefsel 4. </li><li> Zodra de eilandjes worden gescheiden van het omringende weefsel acinaire, snel stoppen met de spijsvertering door het plaatsen van het verwarmingselement op het ijs en het toevoegen van 200 ml koud wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) naar het circuit. </li><li> Verzamel het eilandje oplossing in 250 ml conische buizen zoals het komt uit de steekproef buis. Ga verder tot het circuit is leeg. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De menselijke pancreas spijsvertering circuit De menselijke pancreas spijsvertering circuit bestaat uit een Ricordi kamer met mesh (poriëndiameter: 600 pm) en drie siliciumnitride knikkers (diameter: 15 mm). Uitstroom uit de kamer is gedreven om het weefsel collectie kolf door de peristaltische pomp (140 ml / min). Pijlen geven de stroomrichting. Een optimale temperatuur voor enzymatische vertering wordt onderhouden door onderdompeling van de verwarmingsspiraal in een 37 ° C waterbad. 5. Wassen na-vergisting <ol><li> Centrifugeer de 250 ml conische buizen met daarin het eilandje oplossing bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de eilandje pellet in wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) en distribueren in gelijke fracties aan 50 ml conische buizen. (Optioneel:. Verdeel in extra conische buizen te verbeteren wassen) Centrifugeer bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Gooi supernatant voorzichtig los pellets door handmatige schudden. </li></ol> 6. Zuivering op een Ficoll helling <ol><li> Resuspendeer de pellet met Ficoll media bij een dichtheid van 1,125 g / ml, pH 7,4 en langzaam 10 ml porties van Ficoll media overlay met een dichtheid van 1,080, 1,060 en 1,037 g / ml. </li><li> Centrifugeer de Ficoll gradiënten bij 2400 rpm, 4 ° C gedurende 20 minuten. </li></ol> 7. Islet Verzamelen en Cultuur <ol><li> Na het centrifugeren, kunnen verschillende weefsel componenten worden onderscheiden door hun verdeling in het verloop. </li><li> Gooi de bovenste laag bestaat uit vet en bindweefsel. </li><li> Voorzichtig oogst van de eerste laag van het eilandje aggregaten bij de 1,037-1,060 g / ml interfase. Deze laag bevat de meest pure geïsoleerde eilandjes. Gescheiden in te zamelen fracties voor een efficiënte isolatie. </li><li> Verzamel de tweede, minder zuivere fractie van eilandje aggregaten op de 1.060-1.080 g / ml interfase. </li><li> Verdun de Ficoll gradiënt door de toevoeging van wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) aan elke conische buis tot een totaal volume van 50 ml. Centrifugeer bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant door afzuigen. Wees voorzichtig als de pellet zou kunnen verliezen als gevolg van de Ficoll verloop. </li><li> Was de pellets wie wassen media (900 ml RPMI 1640 met 5,5 mM glucose en 10% FBS) en gecentrifugeerd bij 1000 rpm, 4 ° C gedurende 5 minuten. Herhaal dit met behulp van eilandje cultuur media </li><li> Resuspendeer de eilandjes in cultuur media en plaats ze in de incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 24-48 uur voordat verdere verwerking. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met behulp van ons protocol, kunnen menselijke eilandjes worden geïsoleerd van de pancreas weefsel afkomstig van een gedeeltelijke pancreatectomy. Het succes van dit protocol is gebaseerd op de zorg die gedurende een paar kritische punten. Voor het behoud van beta-levensvatbaarheid van de cellen, is het essentieel dat het monster snel worden vervoerd op het ijs naar het laboratorium. Daarnaast moet de duur van het weefsel spijsvertering empirisch worden geoptimaliseerd op basis van de graad van weefsel fibrose en de enzymatische activiteit van de media. Dit geldt ook voor de mate van mechanische kracht handmatig toegepast op de Ricordi kamer. Dus om een ​​goede eilandje opbrengst te verkrijgen, is het protocol best uitgevoerd door een toegewijde wetenschapper of technisch assistent. Eerste falen is de norm, tenzij het team is al ervaren in eilandje isolement. Er zijn belangrijke verschillen tussen onze eilandje isolatie-protocol en de standaard mens eilandje isolatie-methode: 1) Hoewel we gebruiken alvleesklierweefsel onderworpen aan een aantal uren van ischemie tijdens de chirurgische procedure, wordt het direct verwerkt op de site. Dit is in tegenstelling tot pancreata geëxplanteerd van hersendode donoren voor de pancreas / eilandjestransplantatie, die ischemische blijven voor een aantal uren tijdens de toewijzing en levering aan het eilandje isolatie faciliteit. 2) We injecteren collagenase direct in de pancreas weefsel, terwijl het standaard protocol is om het te gieten in de alvleesklier blokkeert. 3) We scheiden de eilandjes met behulp van een discontinue Ficoll gradiënt in plaats van het verzamelen van de eilandjes van een continue Ficoll verloop met een COBE cel processor. In gevallen waarin de chirurgische specimen is te fibrotische of schaars voor het isoleren van een voldoende aantal eilandjes, kan weefsel nog steeds worden opgehaald door laser capture microdissectie (LCM) 10. Hierdoor kunnen genexpressie data terug te vorderen van vrijwel elke exemplaar, ook al is het eilandje isolatie mislukt of de opbrengst is zeer laag. Helaas, LCM produceert geen levende cellen voor functionele studies en het bedrag is meestal onvoldoende voor proteoomanalyse. Zo kan met behulp van LCM parallel met onze spijsvertering collagenase-protocol om de eilandjes te halen als de meest effectieve manier om chirurgisch exemplaren verwerken. Bij het verzamelen van weefsel voor eilandje isolatie van gedeeltelijke pancreatectomies, is het belangrijk om zorgvuldig onderzoeken van de patiënt klinische geschiedenis en metabole toestand. Een gedeeltelijk pancreatectomized patiënt kan worden beïnvloed door het type 3c diabetes, dat wil zeggen diabetes secundair aan de alvleesklier aandoening die leidt tot een operatie 6. Onder de 43 deelnemende patiënten die deze operatie onderging in onze afdeling in 2010, 32 waren niet-diabetische, 5 werden beïnvloed door diabetes type 2 en 6 hadden het type 3c diabetes. Deze gegevens komen overeen met eerdere studies wijzen op een gestoorde glucose metabolisme en diabetes bij een groot deel van de patiënten die lijden aan alvleesklierkanker of chronische pancreatitis 6. Wij rekening gehouden met diabetes te zijn van primaire oorsprong als het was gediagnosticeerd ten minste een jaar voorafgaande aan het begin van de symptomen leidt tot pancreatische operatie hebben ondergaan 7. De niveaus van antilichamen tegen eilandje autoantigenen moet ook worden gemeten om een eventuele auto-immune oorsprong van de diabetes acht te evalueren. Omdat een patiënt die pancreatectomy kunnen last hebben van niet-gediagnosticeerde diabetes of glucose-intolerant zijn, moeten alle niet-diabetische patiënten krijgen een orale glucose tolerantie test voorafgaand aan het pancreatectomy 9.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><th> Uitrusting </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml serologische pipet (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml serologische pipet (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml serologische pipet (CELLSTAR) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10 ml spuit </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50 ml spuit </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 ml spuit </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 Naald Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 Naald </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 Naald Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 cm celcultuur schotel 2x2 mm raster </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 cm weefselkweek schotel </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 cm Gemakkelijk vast te houden petrischaal </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml flesje </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml Erlenmeyer kolven </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500 ml Erlenmeyer kolven </td><td> Schott Duran </td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250 ml Schroefdop conische bodem Centrifuge Tube </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon conische buis </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask Niet-behandelde </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 pm) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 um poriegrootte, 45 mm nek-formaat, 500 ml volume) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Densitometer (Densito 30px) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Snel PES Filter Unit 0,2 micrometer </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Verwarming Coil </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Typ pomp PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi kamer (metalen gaas met 600 um porie-diameter) </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> Model 50-U-01, Serial 0503-001 </td></tr><tr><td> Voorbereiding Stand </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-ringen </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> OR-50-U-01 </td></tr><tr><td> Siliciumnitride Marbles (15 mm set van 9) </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Silicium Tubing </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Chirurgische tang </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Chirurgische schaar (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Waterbad OLS 200 </td><td> Verlenen </td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th> Reagentia </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Collagenase -&gt; Liberase RI (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-glucose </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNase I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum (FBS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Foetaal Bovine Serum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-hydroxyethyl) - 1-piperazinyl)-ethansulfons ‰ Ure (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 M </td><td> klinische apotheek, ziekenhuis </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine (100x) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate watervrij </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 [-] D-Glucose [+] L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI Medium 1640 [+] L-Glutamine </td><td> PAA Laboratories </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Media en Oplossingen Dithizonoplossing <ul><li> Los 100 mg DTZ in 10 ml DMSO en verdund in 40 ml PBS </li><li> Steriele filter de oplossing (0,22 pm) </li></ul> Enzymoplossing <ul><li> Los 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (zonder supplementen) </li><li> Los 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (zonder supplementen) </li><li> Steriele filter de oplossing (0,22 pm) en houd het enzym op het ijs </li></ul> Was de media (1000ml/5.5mM Glucose) <ul><li> Los 100 ml FBS (warmte geïnactiveerd) </li><li> Voeg 450 ml RPMI 1640 (geen glucose) </li><li> Voeg 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose) </li><li> Steriele filter de oplossing (0,22 pm) </li></ul> Eilandje cultuur media (500ml / 5,5 mM glucose) <ul><li> Los 10 ml 1M HEPES (pH 7,4) </li><li> Voeg 50 ml FBS </li><li> Voeg 5 ml penicilline / streptomycine (100x) </li><li> Voeg 2,75 ml 1 M glucose-oplossing </li><li> Voeg 432,25 ml RPMI 1640 (geen glucose) </li><li> Steriele filter de oplossing (0,22 pm) </li></ul> Euro Collins Solution <ul><li> 4083 g kalium waterstoffosfaat </li><li> 70,0 g glucose </li><li> 2237 g kaliumchloride </li><li> 14,80 g kalium monohydrogenphosphate </li><li> 1680 g natriumwaterstofcarbonaat </li><li> 40 ml elektrolytoplossing (E 154) </li><li> pH 7,4 </li><li> Voeg gedestilleerd water tot 2000 ml </li><li> Steriele filter de oplossing (0,22 pm) </li></ul> Ficoll Stock Solution <ul><li> Voeg 1000 ml van Euro Collins Oplossing voor 500 g Ficoll </li><li> Voeg 8,94 g HEPES </li><li> Roer overnachting tot Ficoll is opgelost </li><li> pH 7,4 </li><li> Meet de dichtheid </li></ul> Ficoll Verlopen <ul><li> Bereken de hoeveelheid FBS, Euro Collins Solution en Ficoll Stock oplossing volgens de dichtheid </li><li> Combineer de drie oplossingen en meet de dichtheid met een densitometer </li><li> Voeg Euro Collins Solution of Ficoll Stock Oplossing totdat de dichtheid wordt aangepast </li><li> Steriele filter de oplossing (0,22 pm) en bewaar bij 4 ° C </li></ul>

isolatie van de mens eilandjes van gedeeltelijk pancreatectomized patiënten

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Onderzoek naar de pathogenese van diabetes type 2 en eilandjes van Langerhans een storing werden gehinderd door de beperkte beschikbaarheid van type 2 diabetes eilandjes van orgaandonoren 2. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van menselijke pancreas weefsel verkregen van type 2 diabetes en niet-diabetische patiënten die hebben ondergaan gedeeltelijke pancreatectomy te wijten aan verschillende pancreatische ziekten (goedaardig of kwaadaardig pancreas tumoren, chronische pancreatitis, en de galbuis of twaalfvingerige darm tumoren) . Alle betrokken patiënten gaven hun toestemming voor deze studie, die ook was goedgekeurd door de lokale ethische commissie. De chirurgische monsters werden direct geleverd aan de patholoog die zacht en gezond verschijnen alvleesklierweefsel geselecteerd voor eilandje isolatie, behoud van het beschadigde weefsel voor diagnostische doeleinden. Wij vonden dat meer dan 1000 eilandjes te isoleren, we moesten beginnen met ten minste 2 g van de pancreas weefsel. Ook essentieel om ons protocol was om zichtbaar opzwellen het weefsel bij het injecteren van de enzym-bevattende media en vervolgens gehakt naar spijsvertering door het verhogen van de oppervlakte. Tot verlenging van de toepasbaarheid van ons protocol om af en toe een geval waarin een grote hoeveelheid (&gt; 15 g) van de menselijke pancreas weefsel beschikbaar is onder andere, gebruikten we een Ricordi kamer (50 ml) om het weefsel te verteren. Tijdens de spijsvertering, hebben we de hand schudde de Ricordi kamer 3 met een intensiteit die door model varieerden naargelang het niveau van weefsel fibrose. Een discontinous Ficoll gradiënt werd vervolgens gebruikt om de eilandjes te scheiden van acinaire weefsel. We merkten dat het weefsel pellet moet klein genoeg zijn om homogeen te worden gesuspendeerd in Ficoll medium met een dichtheid van 1,125 g / ml. Na isolatie, we gekweekt de eilandjes onder stress vrije omstandigheden (geen schudden of rotatie) met 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende ten minste 48 uur om hun functioneel herstel te vergemakkelijken. Wijdverbreide toepassing van ons protocol en de toekomst verbetering in staat kan stellen het tijdig oogsten van grote hoeveelheden van de menselijke eilandjes van diabetische en klinisch afgestemd zonder diabetes, sterk oprukkende diabetes type 2-onderzoek.

Ons protocol leverde een gemiddelde van ~ 500 eilandjes per gram pancreas weefsel, hoewel dit sterk varieerde tussen de voorbereidingen grotendeels als gevolg van verschillen in fibrose en collagenase activiteit. We bereikten&gt; 90% zuiverheid eilandje door eerst kleuring met Dithizone tijdens het weefsel verwerking, dan selectieve oogst ze 24 uur na isolatie. Voor het bepalen van de kwaliteit van het gezuiverde eilandjes, testten we voor 25 mM glucose-gestimuleerde insuline secretie onder statische omstandigheden, gedurende 2 uur. We vonden insuline vergelijkbaar met die van eilandjes verkregen uit ECIT eilandje isolement en transplantatiecentra. Als eilandjes geïsoleerd van gedeeltelijk pancreatectomized pancreata zijn niet bedoeld voor eilandjestransplantatie, de beoordeling van de totale IEQ werd niet beschouwd als een kritische factor te zijn. Belangrijk is dat onze methode ons in staat om eilandjes te isoleren voor functionele studies van 25 gedeeltelijke pancreatectomized patiënten tussen 2005 en 2008 5. Deze eilandjes werden geanalyseerd op glucose-gestimuleerde insuline secretie en specifieke eiwit-expressie door western blotting en immunohistochemie. Eilandjes geïsoleerd van gedeeltelijk pancreatecomized pancreata kan ook worden gebruikt om gen-en eiwit-expressie profielen, ultrastructurele uiterlijk en functionele reacties van niet-diabeten en diabetes eilandjes te vergelijken. Omdat er meer patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy dan dat er orgaandonoren, kan ons protocol staat genoeg monsters en gegevens moeten worden verzameld voor robuuste statistische analyse.

Het aanbod van type 2 diabetes eilandjes voor onderzoek ontoereikend is. Hier delen we ons protocol voor het isoleren van eilandjes van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomy. Deze aanpak is een unieke locatie voor het verkrijgen van eilandjes van type 2 diabetes en klinisch afgestemd zonder diabetes in voldoende aantallen voor basis-en klinische studies.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Onderzoeken naar de pathogenese van diabetes type 2 en disfuncties van de eilandjes van Langerhans zijn belemmerd door de beperkte beschikbaarheid van type 2 ...

Hallo, ik ben Florian Al van de afdeling Chirurgie van de Technische Universiteit in Triton. Hi, ik ben Gregor Cher, ook van de afdeling Chirurgie van het Universitair Ziekenhuis in Grayston.Onderzoek naar de biologie en functie van het ooglid is dringend nodig om ons begrip van de ooglidfysiologie en de pathogenese van diabetes te verbeteren. Helaas zijn menselijke oogleden van zowel niet-diabetische patiënten als patiënten met diabetes type 2 zeer moeilijk te verkrijgen. De volgende videosequentie laat u een protocol zien voor het isoleren van menselijke oogleden van patiënten die een partiële pancreasoptimisatie hebben ondergaan.De zo verkregen eilandjes kunnen dienen als een in vitro-systeem voor functionele analyse. De chirurgische resectie van menselijk pancreasweefsel is de voorwaarde voor de isolatie van menselijke eilandjes. Wij maken gebruik van patiënten die een partiële resectie van de pancreas ondergaan vanwege specifieke pancreaspathologieën.Als bron van menselijk pancreasteweefsel maakt de chirurg een incisie in de pancreas en voert een partiële resectie uit. Vervolgens wordt het pancreasmateriaal op ijs geplaatst en naar de afdeling Pathologie gebracht. De patholoog bepaalt de hoeveelheid gezond ogend en zacht pancreasteweefsel die moet worden weggenomen.Voor de isolatie van de eilandjes zijn ten minste twee gram pancreatisch weefsel vereist. Het weefsel wordt in ucon-oplossing geplaatst en op ijs naar het laboratorium getransporteerd. De eerste stap in de faciliteit voor de isolatie van de eilandjes is het wegen van het pancreatische weefsel.Het monster wordt vervolgens in een schaal van 10 centimeter geplaatst. We hebben reeds één kolf van 500 milliliter klaargezet met 150 milliliter RPMI-medium en één kolf van 250 milliliter met 130 milliliter RPMI-medium. Vervolgens voegen we de verteringsenzymoplossing, bestaande uit één milliliter DNase en 20 milliliter collagenase, toe aan de kolf van 250 milliliter en trekken dit op in een spuit van 10 milliliter.Het gereinigde pancreaatweefsel wordt vervolgens uitgerekt door injectie van het enzymhoudende medium en in kleine stukjes gehakt om het oppervlak te vergroten en het digestieproces te vergemakkelijken. Deze hakstap is cruciaal, omdat uitrekking door injectie alleen geen adequate verspreiding van het enzym binnen het weefsel mogelijk maakt. Parallel hieraan hebben we het digestiecircuit geassembleerd.Zoals in deze figuur wordt getoond, is de stroomrichting in de geregistreerde kamer aan de onderzijde naar binnen en aan de bovenzijde naar buiten. Vervolgens voegen we het resterende enzymhoudende medium toe aan de 500 milliliter kolf tot een volume van 300 milliliter, en plaatsen we daarna de thermometer. De geregistreerde kamer bevat een metalen gaas met een poriediameter van 600 micrometer en vrije siliciumnitride knikkers met een diameter van elk 15 millimeter.We brengen het pancreasweefsel over naar de kamer, plaatsen het gaas, sluiten de kamer en starten de pomp met een snelheid van 140 milliliter per minuut. Zodra de temperatuur van het circuit 37 graden Celsius bereikt, beginnen we de digestietijd te meten. De gevulde kamer wordt handmatig geschud, afhankelijk van de weefselsamenstelling.Om het optimale tijdstip voor het stoppen van de digestie te bepalen, nemen we periodiek monsters, kleuren deze en controleren we de gescheiden oogleden onder de microscoop. Zodra de oogleden gescheiden lijken te zijn van het omliggende weefsel, stoppen we de digestie snel door de verwarmingsspiraal op ijs te plaatsen en 200 milliliter koud wasmedium aan het circuit toe te voegen. Daarna verzamelen we de ooglidoplossing door de monsterbuis in 250 milliliter falcon-buizen te plaatsen totdat het circuit leeg is.De volgende wasprocedure begint met een centrifugatiestap van 1000 RPM bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. In de volgende stap verwijderen we het supernatant, resuspenderen het ooglid-precipitaat in wasmedium en verdelen dit in gelijke fracties over de 50 milliliter falcons. Het wassen wordt voortgezet met een volgende centrifugatiestap van 1000 RPM bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Als optionele stap verdelen we het palet over extra falcon-buisjes naast de oorspronkelijke vier, afhankelijk van de grootte van het palet. Om het wassen te verbeteren, gooien we opnieuw het supernatant weg en maken we het palet voorzichtig los voor scheiding van het ooglid van het omliggende weefsel. De verschillende weefseldichtheden van de twee delen maken de toepassing van een fecale gradiënt mogelijk.Eerst resuspenderen we de pellet in fecale mediumdichtheid 1,1 25 gram per milliliter. De pellet moet klein genoeg zijn om een homogene resuspensie mogelijk te maken. Vervolgens brengen we hier langzaam fecale mediumdichtheden 1,0 81,0 60 en 1,0 37 overheen aan, met een volume van telkens 10 milliliter.Vervolgens centrifugeren we de gradiënten gedurende 20 minuten bij 2.400 RPM bij vier graden Celsius. Nu kunnen de verschillende componenten, gescheiden op basis van hun dichtheid in de fracties, worden onderscheiden. Eerst verwijderen we de bovenste laag, die bestaat uit vet en bindweefsel.De fractie die we nu opvangen, is de eerste laag van het ooglidaggregaat bij 1,037 en 1,06, die hoofdzakelijk de geïsoleerde oogleden bevat. Voor een efficiënte isolatie is het belangrijk om de fracties afzonderlijk op te vangen. Vervolgens vangen we de fractie van het tweede ooglidaggregaat op bij de interface van 1,060 en 1,080, die minder zuivere oogleden bevat dan de eerste laag.Vervolgens voegen we het wasmedium toe tot een totaalvolume van 50 milliliter om de fecale gradiënt te verdunnen en centrifugeren we dit bij 1000 RPM gedurende vijf minuten. Bij vier graden Celsius verwijderen we het supernatant via vacuümsuccie, aangezien het pellet zeer los kan zitten door de koude kleuring. Daarom moeten we de wasstap herhalen met ooglidcultuurmedium bij 1000 RPM gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.In de laatste stap resuspenderen we de menselijke oogleden in het kweekmedium en kweken we deze. De verzamelde oogleden worden in de incubator bij 37 °C gedurende 24 tot 48 uur gekweekt. Na deze kweekstap zijn de oogleden klaar voor verdere verwerking.Dit protocol stelt u in staat om menselijke eilandjes van cellen te isoleren uit pancreaspweefsel na een partiële pancreatectomie. Het snelle en gekoelde transport van het pancreaspweefsel naar de faciliteit voor eilandjesisolatie is essentieel om een betere celviabiliteit te behouden. Het isolatieteam moet er rekening mee houden dat het digestieproces een zeer dynamische procedure is.De duur van het digestieproces is sterk afhankelijk van de weefselsamenstelling. Denk hierbij bijvoorbeeld aan de graad van fibrose en de mate waarin enzymen voldoende in het pancreaasweefsel kunnen worden geïnjecteerd. De individuele aanpassing van de mechanische kracht binnen de gebruikte kamer en de lengte van het digestieproces zijn cruciaal voor een goede opbrengst aan eilandjes.

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel II: zuivering en cultuur van de menselijke eilandjes) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel II: Zuivering en cultuur van de mens Eilandjes

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Laser microdissectie is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen uit minieme hoeveelheden parenchym mogelijk maakt. Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische eilandjes van chirurgische preparaten worden gebruikt voor transcriptoom studies. Ons protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun collectie.

Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Hier geven we details over het uitvoeren van glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) via perfusie door het vaatstelsel van de muizen met een intacte alvleesklier als een aanvullende techniek om de endocriene pancreasfunctie te beoordelen met vermindering van mogelijke confounders.

Glucose-gestimuleerde insulinesecretie via perfusie door het vaatstelsel van muizen met een intacte alvleesklier

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer een protocol voor de isolatie van menselijke eilandjes van Langerhans uit pancreasweefsel van patiënten die een gedeeltelijke pancreatectomie ondergaan. Deze methode maakt functioneel onderzoek naar diabetes mogelijk.

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Meer video's verkennen