Inleiding tot de Ultrasound Gerichte microbellen Destruction Techniek

UTMD staat voor ultrasound targeted microbubble destruction. UTMD kan worden gebruikt om de plaatsspecifieke afgifte van bioactieve moleculen te sturen, waaronder therapeutische genen naar organen die bereikbaar zijn via echografie, zoals het hart en de lever. Bij UTMD worden bioactieve moleculen, zoals negatief geladen plasmide DNA-vectoren die een gen van belang coderen, toegevoegd aan de kationische schillen van lipidemicrobubble-contrastmiddelen; de vectorgebonden microbubbles kunnen intraveneus of direct in de linker ventrikel van het hart worden toegedient.

Bij grotere dieren kunnen ze ook worden toegediend via een intracoronaire katheter, met of zonder verblijfstijd. De daaropvolgende overdracht vanuit de circulatie naar een doelorgaan vindt optimaal plaats via akoestische cavitatie bij een resonantiefrequentie van de microbellen. Het is waarschijnlijk dat de mechanische energie die vrijkomt bij de destructie van de microbellen leidt tot tijdelijke porievorming in of tussen de endotheelcellen van de microvasculatuur in het doelgebied.

Als gevolg van dit sauna-parion-effect wordt de transfectie-efficiëntie in en door de endotheelcellen verhoogd en kunnen transgeen-coderende vectoren worden afgezet in het omliggende weefsel van belang. Plasma-DNA dat in de circulatie achterblijft, wordt snel afgebroken door nucleasen in de bloedmicrobellenpreparatie. Een aliquot van een bereide microbellen-stockoplossing bestaande uit glucose-fosfaatgebufferde zoutoplossing, diolglycerol-3-fosfatidylcholine en diolglycerol-3.

Fosfatidylethanolamine wordt eerst 15 minuten geïncubeerd bij 40 °C. De opgewarmde microbel-oplossing wordt vervolgens overgebracht naar een microbuisje van 1,5 ml met glycerol en tussen één en twee milligram gezuiverd plasma-DNA dat een expressieconstruct voor het gen van interesse codeert. Fosfaatgebufferde zoutoplossing wordt toegevoegd tot een eindvolume van 500 µL.

De lucht in de microcentrifugebuis wordt vervolgens vervangen door octafluorpropaangas. De microcentrifugebuis wordt daarna 20 seconden krachtig geschud in een dentale amalgamator. Kalibratie van de apparatuur vóór het eerste gebruik: de UTMD-cavitatietransducer van 1 MHz moet worden gekalibreerd om een juiste mechanische index en pulsherhaling te garanderen.

Een ondergedomeerde transducer van 1 MHz is via een vermogensversterker verbonden met een golfvormgenerator. De transducer bevindt zich in een plastic bak gevuld met water en is direct gericht op een hydrofoon, die via een ladingsversterker is aangesloten op een oscilloscoop. De frequentie, amplitude, burstcyclus en vermogensversterking van de golfvorm kunnen allemaal worden aangepast om de juiste duty cycle en mechanische index te verkrijgen die optimaal zijn voor het caviteren van de microbellen. In deze opstelling hebben we het systeem gekalibreerd op een mechanische index van ongeveer 1,3 bij een microbeltoediening van 1 MHz en UTMD voorafgaand aan de microbeltoediening en U-T-M-D-C 57 BL. Zes muizen worden geanestheseerd met 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine via een IP-injectie.

Toediening van microbubbels geschiedt intraveneus via een directe injectie in de linker ventrikel van het hart of via catheterisatie van de staartvene, waarbij de directe cardiale injectie later zal worden gedemonstreerd. Een volume tot 100 µL van de met plasma-DNA geladen microbubbeloplossing wordt geïnjecteerd in de linker ventrikel van het hart via een naald van 30 gauge, die onder echografische visualisatie wordt ingebracht in de vierde anterieure intercostaalruimte. De bolus van de microbubbeloplossing als gevolg van de linker interventriculaire injectie wordt gevisualiseerd met een hoogfrequente echografie-transducer van Visual Sonics, die in een stationaire positie op de thorax van de muis is geplaatst in een long-axis weergave.

Direct na de injectie wordt gedurende ongeveer vijf minuten de destructie van microbubbels uitgevoerd met een tweede, kleinere laagfrequente transducer van 1,0 megahertz, die direct boven het doelorgaan wordt gehouden om de destructie in deze regio te richten. Het ultrageluid wordt op de lever toegediend met een pulsrepetitiefrequentie van 1,0 megahertz met een mechanische index van ongeveer 1,3 tot 1,5, en een pulsrepetitieperiode van 100 milliseconden per 20 cycli, of de puls kan worden gesynchroniseerd met het ECG van de muis tot een burst van drie frames ultrageluid elke vier tot zes hartcycli. Voor de methode van microbubbeltoediening via de staartvene wordt de muis op dezelfde wijze geanestheseerd als bij een spuit met het plasmide.

DNA-gebonden microbellen zijn verbonden met een 27 gauge naaldstaartvenecatheter. De staartvenecatheter wordt ingebracht in het distale derde deel van de rechter- of linker laterale venen die langs de staart van de muis lopen. De spuit met de microbellen wordt geplaatst in een infusiepomp die automatisch een uniform, vooraf ingesteld volume van de oplossing over een vooraf ingestelde tijdsperiode toedient.

Bioluminescentie-analyse van UTMD: de effectiviteit van de via UTMD gemedieerde aflevering van plasmide-DNA kan worden geëvalueerd via verschillende methoden, afhankelijk van de genen die in het construct zijn gecodeerd. In het bijzonder is in vivo bioluminescentie-imaging een methode waarmee de aanwezigheid en duur van genexpressie kan worden gemonitord bij muizen die zijn getransfecteerd met het plasmide dat een bioluminescentie-reportergen zoals luciferase codeert.

Het Enogen in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt voor bioluminescentie. Beelden worden doorgaans van alle muizen genomen op de eerste dag na UTMD-gemedieerde transfectie en worden elke drie tot vier dagen herhaald tot de expressie van het bioluminescentiegen niet langer visueel detecteerbaar is via het systeem. Om de muizen voor te bereiden op bioluminescente beeldvorming, ontvangen de muizen eerst een IP-injectie van de luciferase-reporterprobe Lucifer.

De muizen worden vervolgens geanestheseerd. Ongeveer drie minuten later krijgt de biodistributie van het Lucifer-substraat ongeveer 10 minuten de tijd voordat het dier of de dieren in de Xeno Gen-beeldkamer worden geplaatst en er een volledige lichaamsscan wordt gemaakt; tijdens de acquisitie worden de fotonen bepaald die vrijkomen bij de Luciferase-Lucifer fotochemische reactie nadat elke afbeelding is verkregen.

Met behulp van het Xeno in vivo imaging-systeem wordt de systeemsoftware gebruikt om het zichtbare luminescente interessegebied te meten en te kwantificeren.