Name: Inleiding tot de Ultrasound Gerichte microbellen Destruction Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer UTMD voor gerichte gentherapie in hart en lever met behulp van akoestische cavitation. Deze methode verhoogt transfectie-efficiëntie door plasmide-DNA af te geven via microbellenvernietiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Subsidies heeft opgenomen NHLBI HL080532, NHLBI HL073449, NCRR RR16453, en een AHA National Grant-in Aid Award (voor RVS). Een speciaal woord van dank is uitgebreid tot de afstand Course Design and Consulting (DCDC) groep, dcdcgroup.org, voor hun hulp met video productie en het Amerikaanse Ministerie van Onderwijs Grant Nee P336C050047 dat de DCDC opgericht.

1. Microbellen voorraad voorbereiding <ol><li> In 10 ml van PBS mix 200 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholine en 50 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylethanolamine met 1 g glucose. </li><li> Verwarm het mengsel in bad met kokend water 20-30 minuten, pipet mengen om de 5 minuten. </li><li> De oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden. </li></ol> 2. Microbellen Voorbereiding <ol><li> Neem een ​​250 ul van de bereide microbellen voorraad-oplossing en incubeer bij 40 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> De voorverwarmde microbelletjes oplossing wordt vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml microbuisjes die 50 ul van glycerol. </li><li> 1-2 mg gezuiverd plasmide DNA dat codeert voor een expressie-construct voor het gen van interesse (gezuiverd in dit voorbeeld door Qiagen Endotoxine gratis MegaPrep kit, Qiagen, Germantown, MD, met een optimale concentratie van 4mg/ml). 2.4) Fosfaat-gebufferde zoutoplossing wordt toegevoegd aan een eindvolume van 500 pi. Endotoxine vrij Qiagen maxipreps worden gebruikt, evenals steriele PBS om steriliteit te garanderen. </li><li> De lucht in de microbuisjes wordt dan vervangen door Octafluoropropane gas. </li><li> De microbuisjes wordt vervolgens krachtig geschud in een tandheelkundige amalgamator gedurende 20 seconden. </li><li> De subnatant die resten van DNA en buffer die niet is gebonden aan de microbellen wordt vervolgens zorgvuldig verwijderd en de microbelletjes laag is drie keer gewassen met steriel PBS tot losse DNA te verwijderen, en op ijs geplaatst tussen elke wasbeurt. We meestal het bereiken van een bindend rendement van 30-40%. Alle reagentia zijn steriel en zorg is gemaakt om besmetting te minimaliseren. </li><li> Het plasmide DNA-gebonden microbolletjes worden dan geplaatst op ijs gedurende maximaal twee uur tot gebruik. </li><li> De subnatant verwijderd van de microbuisjes na het mengen en de PBS wast, kan worden gebruikt om de concentratie van niet-gebonden DNA, en eveneens verbonden het bedrag gebaseerd op de bekende beginconcentratie te bepalen, door het meten van de optische dichtheid van deze oplossing bij een golflengte van 260nm met behulp van een spectrofotometer. </li></ol> 3. Kalibratie-apparatuur <ol><li> Voorafgaand aan het eerste gebruik, een 1 MHz cavitatie transducer moet gekalibreerd worden om een ​​goede mechanische index en pols herhaling te verzekeren. Een submergible 1 MHz, 13mm, ongerichte transducer is verbonden met een 20 MHz Functie / Arbitrary Waveform Generator door middel van een eindversterker. </li><li> De transducer is geplaatst in een plastic container vol water, direct gericht op een hydrofoon, die is op een 500 MHz oscilloscoop aangesloten via een heffing versterker. </li><li> Golfvorm, frequentie, amplitude, burst cyclus, en de kracht versterking allemaal worden aangepast aan de juiste duty cycle en mechanische index optimaal zijn om de microbellen caviteren te verkrijgen. Voor dit bijzondere experiment, hebben we gekalibreerd het systeem een ​​mechanische index gelijk aan ~ 1,3 bij 1 MHz. </li></ol> 4. Microbellen Levering &amp; UTMD <ol><li> Voorafgaand aan de levering en microbellen UTMD, C57BL / 6 muizen werden verdoofd met 100mg/kg ketamine en xylazine 5mg/kg door middel van IP-injectie. </li><li> Microbellen aflevering werd intraveneus toegediend via een directe injectie in de linker ventrikel van het hart of door staartader katheterisatie. Voor de directe cardiale injectie wordt een volume tot 100 ul van het plasmide DNA-loaded microbellen oplossing ingespoten via een naald van 30 gauge ingevoegd op de voorste 4e intercostale ruimte onder ultrasone visualisatie in de linker ventrikel van het hart. </li><li> De microbellen oplossing bolus als gevolg van de linker interventriculaire injectie wordt gevisualiseerd met behulp van Visual Sonics '38 MHz hoge frequentie ultrasoon transducer geplaatst in een stilstaande positie op de borstkas van de muis in een lange-as bekijken met behulp van VisualSonics' Vevo 2100 Imaging System. Alle spuiten en naalden zijn steriel, het verzekeren van de meest steriele omgeving mogelijk voor deze injecties. </li><li> Onmiddellijk na de injectie, is microbellen vernietiging uitgevoerd voor ~ 5 minuten met een tweede, kleinere lage frequentie 1,0 MHz transducer hield direct over de gewenste orgaan, gericht op vernietiging van deze regio. In dit voorbeeld werd de echografie toegediend aan de lever, bij een pulsherhalingsfrequentie van 1,0 MHz, met een mechanische index gelijk aan ongeveer 1.3-1.5, en pols herhaling periode van 100 ms voor elke 20 cycli. Als alternatief kan de pols worden gated aan de ECG van de muis (niet getoond in dit experiment) om een ​​uitbarsting van drie frames van ultrasound, elke 4-6 cardiale cycli. We krijgen een grotere efficiëntie van de transfectie met protocollen die de capillaire bed te laten vullen met bubbels tussen de uitbarstingen van echografie. </li></ol> 5. Alternatief Levering Wijze We hebben ervoor gekozen om de interventriculaire injectie te wijten aan de complexiteit van de procedure te markeren, maar in veel gevallen, zoals langdurige infusie van microbellen, een staart ader inprojectie is de voorkeur. Voor de staart-ader methode van microbellen levering, de muis is verdoofd op dezelfde manier. Een spuit met het plasmide DNA-gebonden microbellen is aangesloten op een 27 gauge naald / staartader katheter. De staart ader katheter wordt ingebracht in het distale derde deel van zowel de rechter of linker laterale aderen die langs de staart van de muis. De spuit met de microluchtbelletjes is geplaatst in een infusiepomp die automatisch beheert een uniform ingestelde volume van de oplossing gedurende een vooraf ingestelde tijd. We meestal trekken 200-300μl met een snelheid van 3ml/hour. Gebruik van dieren Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met goede dieren praktijk zoals gedefinieerd door de relevante nationale en / of lokale dierenwelzijn lichamen, en alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de bevoegde commissie (Universiteit van Hawaii Institutional Animal Care en gebruik Comite, goedkeuring nummer 07-100 -3). Geschikte anesthesie (ketamine / zylazine) werd gebruikt en analgetica (Bupivicaine en Buprenorfine) beschikbaar waren, maar niet vereist. 6. Representatieve resultaten: De effectiviteit van de UTMD-gemedieerde plasmide DNA levering kan worden geëvalueerd door middel van een verscheidenheid van methoden, afhankelijk van de genen gecodeerd in het construct, zoals, maar niet beperkt tot, luciferase in vivo beeldvorming, B-gal ex vivo kleuring, en / of immunohistology. In het bijzonder in vivo bioluminescentie beeldvorming maakt het mogelijk om te controleren op de aanwezigheid en de duur van genexpressie in serie in muizen getransfecteerd met een plasmide dat codeert voor een bioluminescente reportergen (luciferase). De Xenogen In vivo Imaging System (IVIS) (Remklauw Life Sciences, Hopkinton, MA) wordt gebruikt voor bioluminescente beeldvorming. Foto's zijn meestal gemaakt van alle muizen de eerste dag na UTMD gemedieerde transfectie en wordt herhaald om de drie tot vier dagen tot bioluminescente genexpressie is niet meer visueel waarneembaar door middel van het systeem (figuur 1). Ter voorbereiding muizen voor bioluminescente beeldvorming, muizen krijgen eerst een IP-injectie van de luciferase reporter probe D-luciferine (Remklauw Life Sciences) en worden dan verdoofd ~ 3 minuten later. Biodistributie van de D-luciferin substraat is toegestaan ​​om door te gaan voor ~ 10 minuten voordat het dier is geplaatst in de IVIS beeldvorming kamer en een full body scan foto wordt genomen. Tijdens de overname worden de fotonen van de vuurvlieg luciferase / D-luciferine fotochemische reactie gemeten. Figuur 1 illustreert ook soortgelijke IVIS bioluminescente beeldvorming van de lever na UTMD, en Figuur 2 is een epifluorescentie (100X) beeld van de getransfecteerde lever met behulp van een anti-luciferase primaire antilichaam (Sigma-Aldrich) en AlexFluor-568 geconjugeerd secundair antilichaam (Invitrogen) . Het is duidelijk te zien dat de UTMD bemiddelde transfectie lever heeft niet alleen de endotheelcellen aangetast, maar de hepatocyes ook. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Xenogen / IVIS beeldvorming van hart-UTMD behandelde muizen (A) Negatieve controle Muis:.. Plasmide + PBS gevolgd door hart-gerichte UTMD, (B) Behandeling Muis: Plasmide + Microbelletjes, gevolgd door hart-gerichte UTMD, en (C) Behandeling Mouse : Plasmide + Microbelletjes, gevolgd door de lever gericht UTMD. <img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Immunohistochemie van de lever UTMD (anti-luciferase in rood). (A) Plasmide zonder UTMD, en (B) Plasmide met UTMD. Confocale beeld (100X); kernen zijn DAPI blauw gekleurd.

<ol><li>Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+can+repeatedly+direct+highly+specific+plasmid+expression+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart.</a> Circulation. 108, 1022-1026 (2003).</li>
<li>Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+ultrasound+targeted+microbubble+destruction%3A+a+review+of+non-cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ultraschall+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications.</a> Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+pancreatic+islets+in+vivo+by+ultrasound-targeted+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy.</a> Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).</li>
<li>Miao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhances+gene+delivery+of+human+factor+IX+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid.</a> Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).</li>
<li>Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+non-viral+gene+delivery+of+human+vascular+endothelial+growth+factor+improves+revascularisation+and+restoration+of+euglycaemia+after+human+islet+transplantation+into+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver.</a> Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).</li>
<li>Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiographic+destruction+of+albumin+microbubbles+directs+gene+delivery+to+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium.</a> Circulation. 101, 2554-2556 (2000).</li>
<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+Compositions%2C+Properties+and+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Sci+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications.</a> Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).</li>
<li>Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+enhances+AAV-mediated+gene+transfection+in+human+RPE+cells+in+vitro+and+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo.</a> Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).</li>
<li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+medical+imaging%3A+current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li>
<li>Newman, C. M., Bettinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+ultrasound+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer.</a> Gene Ther. 14, 465-475 (2007).</li>
<li>Vancraeynest, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+injury+induced+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction%3A+evidence+for+the+contribution+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia.</a> Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).</li>
</ol>

UTMD vertegenwoordigt een nieuwe benadering voor gen-levering. Als een platform technologie kan worden gecombineerd met een van de vele mogelijke gentherapie-strategieën, om een ​​groot aantal bioactieve moleculen bij een hoge mate van weefsel specificiteit gewenst is te leveren. De belangrijkste biologische beperking van de techniek is de lage efficiëntie van transfectie. Een andere belangrijke overweging is de toegankelijkheid van de doelorgaan aan echografie, die duidelijk kan worden verminderd door in te grijpen bot...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / apparatuur </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-5911 </td><td> onderdeel van de microbellen lipide shell </td></tr><tr><td> 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylethanolamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3275 </td><td> onderdeel van de microbellen lipide shell </td></tr><tr><td> glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5400 </td><td> gedachte aan de microbellen te stabiliseren </td></tr><tr><td> fosfaat-gebufferde zoutoplossing </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5368 </td><td></td></tr><tr><td> glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5516 </td><td> verondersteld om microbellen te voorkomen dat coalescentie </td></tr><tr><td> Octafluoropropane gas </td><td> Airgas </td><td> N / A </td><td> inert gas worden gebruikt in klinische toepassingen </td></tr><tr><td> VialMix tandheelkundige amalgamator </td><td> Bristol-Myers Squibb </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 1 MHz, 13mm, ongerichte transducer </td><td> Olympus </td><td> A303S-SU </td><td></td></tr><tr><td> 20 MHz Functie / Arbitrary Waveform Generator </td><td> Agilent </td><td> 33220A </td><td></td></tr><tr><td> Eindversterker </td><td> Krohn-Hite Co </td><td> Model 7500 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrofoon </td><td> Bruel en Kjaer </td><td> Type 1803 </td><td></td></tr><tr><td> Laad Versterker </td><td> Bruel en Kjaer </td><td> Type 2634 </td><td></td></tr><tr><td> 500 MHz oscilloscoop </td><td> LeCroy </td><td> 9354L </td><td></td></tr><tr><td> VisualSonics &#39;Vevo 2100 Imaging System met 34 MHz transducer </td><td> VisualSonics </td><td> 2100 </td><td></td></tr><tr><td> 27G een inch staartader katheters </td><td> VisualSonics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Genie Plus infuuspomp </td><td> Kent Wetenschappelijke </td><td> GENIE </td><td></td></tr></tbody></table>

inleiding tot de ultrasound gerichte microbellen destruction techniek

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactieve moleculen, zoals negatief geladen plasmide DNA vectoren die coderen voor een gen van interesse, worden toegevoegd aan de kationische schelpen van lipide microbellen contrastmiddelen 7-9. Bij muizen deze vector-dragende microbellen kan intraveneus of direct worden toegediend aan de linker ventrikel van het hart. In grotere dieren die ze kunnen ook worden toegediend via een katheter intracoronaire. De nalevering uit de circulatie tot een doelorgaan vindt plaats door akoestische cavitatie op een resonantiefrequentie van de microbellen. Het lijkt waarschijnlijk dat de mechanische energie opgewekt door de microbellen vernieling leidt voorbijgaande porie formatie in of tussen de endotheelcellen van de microvasculatuur van de beoogde regio 10. Als gevolg van deze sonoporatie effect, is de transfectie-efficiëntie in en over de endotheelcellen verbeterd en transgen-coderende vectoren worden gestort in het omliggende weefsel. Plasmide DNA dat in de circulatie wordt snel afgebroken door nucleasen in het bloed, die verder de kans van de levering reduceert tot niet-gesoniceerd weefsels en leidt tot zeer specifieke target-orgaan transfectie.

Echografie Gerichte microbelletjes Destruction (UTMD) kan worden gebruikt om site-specifieke levering van bioactieve moleculen, waaronder therapeutische genen direct, hun organen toegankelijk is voor echografie, zoals het hart en de lever doel<sup&gt; 1-6</sup&gt;.

Inleiding tot de Ultrasound Gerichte microbellen Destruction Techniek

Bij UTMD worden bioactieve moleculen, zoals negatief geladen plasmide-DNA-vectoren die een gen van belang coderen, toegevoegd aan de kationische schillen van lipiden...

UTMD staat voor ultrasound targeted microbubble destruction. UTMD kan worden gebruikt om de plaatsspecifieke afgifte van bioactieve moleculen te sturen, waaronder therapeutische genen naar organen die bereikbaar zijn via echografie, zoals het hart en de lever. Bij UTMD worden bioactieve moleculen, zoals negatief geladen plasmide DNA-vectoren die een gen van belang coderen, toegevoegd aan de kationische schillen van lipidemicrobubble-contrastmiddelen; de vectorgebonden microbubbles kunnen intraveneus of direct in de linker ventrikel van het hart worden toegedient.Bij grotere dieren kunnen ze ook worden toegediend via een intracoronaire katheter, met of zonder verblijfstijd. De daaropvolgende overdracht vanuit de circulatie naar een doelorgaan vindt optimaal plaats via akoestische cavitatie bij een resonantiefrequentie van de microbellen. Het is waarschijnlijk dat de mechanische energie die vrijkomt bij de destructie van de microbellen leidt tot tijdelijke porievorming in of tussen de endotheelcellen van de microvasculatuur in het doelgebied.Als gevolg van dit sauna-parion-effect wordt de transfectie-efficiëntie in en door de endotheelcellen verhoogd en kunnen transgeen-coderende vectoren worden afgezet in het omliggende weefsel van belang. Plasma-DNA dat in de circulatie achterblijft, wordt snel afgebroken door nucleasen in de bloedmicrobellenpreparatie. Een aliquot van een bereide microbellen-stockoplossing bestaande uit glucose-fosfaatgebufferde zoutoplossing, diolglycerol-3-fosfatidylcholine en diolglycerol-3.Fosfatidylethanolamine wordt eerst 15 minuten geïncubeerd bij 40 °C. De opgewarmde microbel-oplossing wordt vervolgens overgebracht naar een microbuisje van 1,5 ml met glycerol en tussen één en twee milligram gezuiverd plasma-DNA dat een expressieconstruct voor het gen van interesse codeert. Fosfaatgebufferde zoutoplossing wordt toegevoegd tot een eindvolume van 500 µL.De lucht in de microcentrifugebuis wordt vervolgens vervangen door octafluorpropaangas. De microcentrifugebuis wordt daarna 20 seconden krachtig geschud in een dentale amalgamator. Kalibratie van de apparatuur vóór het eerste gebruik: de UTMD-cavitatietransducer van 1 MHz moet worden gekalibreerd om een juiste mechanische index en pulsherhaling te garanderen.Een ondergedomeerde transducer van 1 MHz is via een vermogensversterker verbonden met een golfvormgenerator. De transducer bevindt zich in een plastic bak gevuld met water en is direct gericht op een hydrofoon, die via een ladingsversterker is aangesloten op een oscilloscoop. De frequentie, amplitude, burstcyclus en vermogensversterking van de golfvorm kunnen allemaal worden aangepast om de juiste duty cycle en mechanische index te verkrijgen die optimaal zijn voor het caviteren van de microbellen. In deze opstelling hebben we het systeem gekalibreerd op een mechanische index van ongeveer 1,3 bij een microbeltoediening van 1 MHz en UTMD voorafgaand aan de microbeltoediening en U-T-M-D-C 57 BL. Zes muizen worden geanestheseerd met 100 mg/kg ketamine en 5 mg/kg xylazine via een IP-injectie.Toediening van microbubbels geschiedt intraveneus via een directe injectie in de linker ventrikel van het hart of via catheterisatie van de staartvene, waarbij de directe cardiale injectie later zal worden gedemonstreerd. Een volume tot 100 µL van de met plasma-DNA geladen microbubbeloplossing wordt geïnjecteerd in de linker ventrikel van het hart via een naald van 30 gauge, die onder echografische visualisatie wordt ingebracht in de vierde anterieure intercostaalruimte. De bolus van de microbubbeloplossing als gevolg van de linker interventriculaire injectie wordt gevisualiseerd met een hoogfrequente echografie-transducer van Visual Sonics, die in een stationaire positie op de thorax van de muis is geplaatst in een long-axis weergave.Direct na de injectie wordt gedurende ongeveer vijf minuten de destructie van microbubbels uitgevoerd met een tweede, kleinere laagfrequente transducer van 1,0 megahertz, die direct boven het doelorgaan wordt gehouden om de destructie in deze regio te richten. Het ultrageluid wordt op de lever toegediend met een pulsrepetitiefrequentie van 1,0 megahertz met een mechanische index van ongeveer 1,3 tot 1,5, en een pulsrepetitieperiode van 100 milliseconden per 20 cycli, of de puls kan worden gesynchroniseerd met het ECG van de muis tot een burst van drie frames ultrageluid elke vier tot zes hartcycli. Voor de methode van microbubbeltoediening via de staartvene wordt de muis op dezelfde wijze geanestheseerd als bij een spuit met het plasmide.DNA-gebonden microbellen zijn verbonden met een 27 gauge naaldstaartvenecatheter. De staartvenecatheter wordt ingebracht in het distale derde deel van de rechter- of linker laterale venen die langs de staart van de muis lopen. De spuit met de microbellen wordt geplaatst in een infusiepomp die automatisch een uniform, vooraf ingesteld volume van de oplossing over een vooraf ingestelde tijdsperiode toedient.Bioluminescentie-analyse van UTMD: de effectiviteit van de via UTMD gemedieerde aflevering van plasmide-DNA kan worden geëvalueerd via verschillende methoden, afhankelijk van de genen die in het construct zijn gecodeerd. In het bijzonder is in vivo bioluminescentie-imaging een methode waarmee de aanwezigheid en duur van genexpressie kan worden gemonitord bij muizen die zijn getransfecteerd met het plasmide dat een bioluminescentie-reportergen zoals luciferase codeert.Het Enogen in vivo beeldvormingssysteem wordt gebruikt voor bioluminescentie. Beelden worden doorgaans van alle muizen genomen op de eerste dag na UTMD-gemedieerde transfectie en worden elke drie tot vier dagen herhaald tot de expressie van het bioluminescentiegen niet langer visueel detecteerbaar is via het systeem. Om de muizen voor te bereiden op bioluminescente beeldvorming, ontvangen de muizen eerst een IP-injectie van de luciferase-reporterprobe Lucifer.De muizen worden vervolgens geanestheseerd. Ongeveer drie minuten later krijgt de biodistributie van het Lucifer-substraat ongeveer 10 minuten de tijd voordat het dier of de dieren in de Xeno Gen-beeldkamer worden geplaatst en er een volledige lichaamsscan wordt gemaakt; tijdens de acquisitie worden de fotonen bepaald die vrijkomen bij de Luciferase-Lucifer fotochemische reactie nadat elke afbeelding is verkregen.Met behulp van het Xeno in vivo imaging-systeem wordt de systeemsoftware gebruikt om het zichtbare luminescente interessegebied te meten en te kwantificeren.

introduction-to-ultrasound-targeted-microbubble-destruction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Insonation van microbellen is een veelbelovende strategie voor tumor ablatie op kortere gemiddelde akoestische bevoegdheden, alsmede voor de gerichte toediening van geneesmiddelen. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van low duty cycle echografie pulserende strategieën en nanocarriers aan niet-thermische microvasculair ablatie en laadvermogen levering aan subcutane C6 glioma te maximaliseren.

Contrast Echografie doelgerichte behandeling van gliomen in Muizen via Drug-Bearing Nanodeeltje Levering en microvasculaire Ablation

Microbellen-gemedieerde focused ultrasound verstoring van de bloed-hersen barrière (BBB) ​​is een veelbelovende techniek voor niet-invasieve gerichte toediening van medicijnen in de...

MRI-geleide Verstoring van de bloed-hersen barrière met behulp van Transcraniële Focused Ultrasound in een ratmodel

This video describes a method of temporarily disrupting the blood-brain barrier (BBB) by creating transient openings using microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). These transient local BBB openings can eventually be used to deliver larger-sized drug molecules directly into the brain parenchyma.

Focus Ultrasound Based Microbubble Mediated Blood-Brain Barrier Opening: A Technique to Create Localized Transient Openings in Blood-Brain Barrier of Mouse by Sonoporation

Hier presenteren we een protocol om echografie microbellen contrastmiddelen in levende, geïsoleerde late zwangerschap stadium muizen embryo's te injecteren. Deze methode maakt de studie van perfusie parameters en vasculaire moleculaire merkers binnen het embryo met contrastmiddel hoogfrequente ultrasone beeldvorming.

Contrast Imaging in muis embryo&#39;s met behulp van hoge-frequentie Ultrasound

Het gepresenteerde experimentele protocol kan worden gebruikt om real-time metingen uit te voeren van cavitatieactiviteit in een celkweekapparaat met als doel onderzoek mogelijk te maken naar de voorwaarden die nodig zijn voor een succesvolle medicijnafgifte en/of andere bio-effecten.

Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Een snelle en betrouwbare techniek wordt voorgesteld om de vormoscillaties van een enkele, gevangen akoestische bel te regelen die is gebaseerd op coalescentietechniek tussen twee bellen. De steady-state, symmetrie-gecontroleerde bubbelvormoscillaties maken analyse mogelijk van de vloeistofstroom die wordt gegenereerd in de buurt van de belinterface.

Inductie van microstreaming door niet-bolvormige bubbeloscillaties in een akoestisch levitatiesysteem

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

De gepresenteerde protocollen kunnen worden gebruikt om de respons van fluorescerend gelabelde microbubbels te karakteriseren die zijn ontworpen voor toepassingen met echografie-geactiveerde medicijnafgifte, inclusief hun activeringsmechanismen en hun bio-effecten. Dit artikel behandelt een reeks in vitro en in vivo microscopietechnieken die worden uitgevoerd om de relevante lengte en tijdschalen vast te leggen.

Multi-timescale microscopiemethoden voor de karakterisering van fluorescerend gelabelde microbubbels voor echografie-getriggerde medicijnafgifte

Dit protocol schetst de fabricage van lipide microbubbels en een compatibele eenpots microbubbel radiolabelingmethode met zuiveringsvrije &gt;95% etiketteringsefficiëntie die de fysisch-chemische eigenschappen van microbellen behoudt. Deze methode is effectief in verschillende formuleringen van lipide-microbubbels en kan worden aangepast om radioactieve en/of fluorescerende microbubbels te genereren.

Microbellen fabriceren en labelen met fluorescerende en radioactieve tracers

Een cyclische druk bioreactor in staat om onderwerpen hartklep tissue om fysiologische en pathologische condities druk is ontworpen. Een LabVIEW programma stelt gebruikers in staat om de controle druk omvang, amplitude en frequentie. Dit apparaat kan gebruikt worden om de Mechanobiologie van hartklep tissue of geïsoleerde cellen te bestuderen.

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

Leer UTMD voor gerichte gentherapie in hart en lever met behulp van akoestische cavitation. Deze methode verhoogt transfectie-efficiëntie door plasmide-DNA af te geven via microbellenvernietiging.

Inleiding tot de Ultrasound Gerichte microbellen Destruction Techniek

Meer video's verkennen