Targeting bulbus olfactorius Neuronen gebruik van Gecombineerd In Vivo Elektroporatie en Gal4-Based Enhancer Trap zebravis Lines

Deze methode illustreert hoe de combinatie van temporeel en ruimtelijk discrete in vivo elektroporatie met transgene lijnen van zebravis selectief regio's van het ontwikkelende embryo kan targeten voor transgene expressie. Begin met cal TA vier transgene vissen die zijn verkregen via de enhancer trap-methode om genexpressie en celtypen van belang te beperken. In dit geval de ontwikkelende bulbus olfactorius op een specifiek tijdstip in de ontwikkeling; injecteer het GFP-reporterplasmid in vivo in het anterieure uiteinde van de voorhersenen en voer elektroporatie uit om de DNA-afgifte te faciliteren. Resultaten verkregen via in vivo fluorescentie-imaging wijzen op een precieze lokalisatie van het transgen op een specifiek tijdstip en in een specifiek proces van de ontwikkeling.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de injectie van plasmiden in het eencellige stadium, is dat de expressie gericht is op specifieke celtypen binnen een bepaald gebied van de ontwikkelende hersenen. Gebruik de transgene zebravislijn, gecreëerd via een gemedieerde enhancer-trapmethode, om de expressie van zowel de transcriptiefactor calt A four als het reportereiwit M cherry in specifieke regio's van de ontwikkelende hersenen aan te sturen. Zet paringscombinaties op van volwassen vissen die heterozygoot zijn voor het transgene insert met wild-type vissen om ongeveer 50% transgene nakomelingen te verkrijgen.

Behandel de transgene embryo's nu met 100 micromolar fenylthioureum (PTU), beginnend zes tot acht uur na bevruchting om pigmentvorming te blokkeren en fluorescentie-imaging te vergemakkelijken. Breng de embryo's 24 tot 28 uur na bevruchting over naar eiwater zonder PTU en identificeer onder een fluorescentiemicroscoop de transgene embryo's aan de hand van de expressie van M-cherry in de myochloor. Bereid een 0,5% oplossing van laagsmeltende agarose voor in electroporatiebuffer plus TRIS, en laat de oplossing vervolgens equilibreren.

Plaats in een incubator van 34 tot 37 °C een grote druppel, ongeveer 500 µL van de agro-oplossing, in het midden van een Petri-schaal van 60 millimeter. Verwijder met een fijne pincet het chorionmembraan van de transgene embryo's. Breng de bevrijde embryo's gedurende twee minuten over naar een Petri-schaal met electroporatiebuffer en 0,02% tricaine-anesthesie.

Breng nu zes tot acht geanestheseerde embryo's over naar de voorbereide druppel aros met behulp van afgeknipte Michael-loader pipetpunten. Positioneer de embryo's zodanig dat ze allemaal in dezelfde richting wijzen en in een verticale rij zijn uitgelijnd. Fixeer de embryo's in deze positie door de aros te laten stollen met een grote petrischaal met twee tot drie millimeter ijs.

Vul het schaaltje met electroporatiebuffer plus trica, zodat de oplossing de gestolde aros-druppel volledig bedekt. Bereid het gezuiverde GFP-expressieplasmid voor injectie voor met fenolroodkleurstof. Maak nu micro-injectiepipetten met behulp van een micro-loader pipetpunt.

Voeg één tot twee µL DNA-plasmide-oplossing toe aan de injectiepipet, monteer de geladen pipet vervolgens in de pipethouder van het drukinjectiesysteem en zet deze vast. Verwijder luchtbellen uit de geladen pipet door deze kort en krachtig door een ondergedompelde kim wipe te steken, totdat de drukpulsen zorgen voor de afgifte van de rode DNA-oplossing, met de pipet gericht naar het anterieure uiteinde van de ontwikkelende hersenen. Injecteer de plasmide-DNA-oplossing in de ventrikels van de ontwikkelende hersenen via drukinjectie.

Force het DNA in de nabijheid van de toekomstige bulbus olfactorius. Injecteer het DNA totdat de rode kleurstof duidelijk zichtbaar is aan het voorste uiteinde van het ventrikel van de voorhersenen. Ga onmiddellijk over tot de electroporatiestap om diffusie en verdunning van het DNA te voorkomen.

Stel de SD nine stimulator zo in dat er enkelvoudige electroporatiepulsen van 5 milliseconde worden gegenereerd bij 70 volt. Positioneer de elektroden zodanig dat de positieve elektrode zich naast het binnenste uiteinde van het embryo bevindt, terwijl de negatieve elektrode posterieur aan de kop van het embryo is geplaatst.

Activeer handmatig acht electroporatiepulsen met één enkele knop van de SD nine stimulator. Scheid elke puls door één seconde. Laat de embryo's ten minste 10 minuten herstellen.

Gebruik nu een fijne pincet om voorzichtig de omtrek van de embryo's te volgen, waarbij direct contact met de embryo's zelf wordt vermeden. Bevrijd vervolgens de embryo's uit de agar. Plaats de embryo's terug in het eierwater en bewaar deze bij 28 degrees Celsius tot aan de analyse van de GFP-expressie.

Breng de embryo's gedurende enkele minuten over naar eiauwter met 0,02% trica-anesthesie, zoals eerder gedaan, maar nu in het midden van een kleinere Petri-schaal van 35 millimeter. Voeg een grote druppel 0,5% oplossing van laagsmeltende agarose en eiauwter met trica toe. Plaats nu één gesedeerde embryo in deze druppel agarose met behulp van afgeknotte micropipetpuntjes.

Plaats het embryo rechtop om een dorsaal zicht op de ontwikkelende hersenen onder een rechtopstaande microscoop te vergemakkelijken. Laat de aro op ijs stollen en gebruik afgesneden micro loader tips om de oriëntatie van het embryo te handhaven. Vul tot slot de schaal met eiwater vermengd met trica, waarbij u er zeker van bent dat de oplossing de gestolde aro-druppel volledig bedekt.

Dit voorbeeld combineert de temporele resolutie van in vivo electroporatie met een celtypespecifieke expressie, gemedieerd door enhancer trap transgene lijnen, om de ontwikkelende bulbus olfactorius te targeten. De transgene enhancer trap lijn vertoont constitutieve expressie van m cherry en calt A vier in de ruitenhersenen, het cerebellum, vier hersenen en de bulbus olfactorius in embryo's op vijf dagen na bevruchting. Belangrijk is dat de GFP-exprimerende cellen vier dagen na electroporatie de typische axonale projecties van mitralcellen uit de bulbus olfactorius vertonen.

Deze vergelijking van signalen van M Cherry en de lagere belichting van GFP demonstreert dat cellichamen die GFP tot expressie brengen inderdaad gelokaliseerd zijn in de bulbus olfactorius met behulp van short hairpin RNA-constructen. Deze procedure kan ook worden gebruikt om verlies van functie te induceren in specifieke celtypen van de ontwikkelende hersenen.