Onderzoeken van buitenste haarcel beweeglijkheid met een combinatie van externe Alternating elektrisch veld Stimulatie en High-speed Image Analysis

Het algemene doel van deze procedure is het introduceren van een betrouwbare methode om de motiele responsen van de buitenste haarcellen (OHC) te onderzoeken, waaronder elektromotiliteit, trage motiliteit en buiging bij akoestische frequenties. Dit wordt bereikt door eerst slaapbeenderen te oogsten van cavia's, muizen of andere zoogdieren, en de bulla te openen om de cochlea bloot te leggen. De tweede stap bestaat uit het onderdompelen van de cochlea in Lebovits L 15, het verwijderen van het apicale deel van de benige wand, het spiraalbandje en de stria vascularis, en het verwijderen van het Corti-orgaan.

Na een incubatie van vijf minuten van het Cortisch orgaan in één milligram per milliliter collagenase, wordt het met een Hamilton-spuit van 50 µL naar de registratiekamer overgebracht, waarbij de cellen worden gedissocieerd door ze herhaaldelijk door de naald te trekken. De registratiekamer wordt vervolgens naar de microscoop verplaatst voor celstimulatie met een extern wisselend elektrisch veld en videoregistratie van de motiele responsen van geïsoleerde buitenste haarcellen met een hogesnelheidscamera. Uiteindelijk kunnen de elektromotiliteit, langzame motiliteit en buiging bij akoestische frequenties van de buitenste haarcellen worden geëvalueerd via computerondersteunde beeldanalyse.

Begin deze procedure door de slaapbeenderen te oogsten van cavia's, muizen of andere zoogdiermodellen. Open vervolgens de slaapbeenderen met een nipper. Om het slakkenhuis bloot te leggen, verwijdert u voorzichtig het overtollige bot terwijl u de benige wand van het slakkenhuis intact houdt, en dompelt u het vervolgens onder in livi L 15.

Open onder de microscoop de apicale regio van de cochlea. Verwijder de dryer, de VASIs en het spiraal ligament met de punt van een scalpelblad, een micropuntpincet of een fijne pincet. Verwijder het Corti-orgaan uit de scala modiolaris met de pincet.

Plaats vervolgens het slakkenhuis in 1 mg/mL collagenase bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Indien haarcellen uit de basale windingen van het slakkenhuis nodig zijn, verwijdert u met de pincet de benige schaal die de basis van het slakkenhuis bedekt en scheidt u de spiraal van het slaapbeen met behulp van het scalpelmes. Voordat u het Cortisch orgaan verwijdert, brengt u het Cortisch orgaan over naar de registratiekamer met een Hamilton-spuit van 50 µL. Dissocieer vervolgens de cellen door ze door de naald te trekken.

Hier is het diagram van de externe generator voor het wisselend elektrisch veld en de verbindingen met het systeem voor beeldvastlegging, de regelcircuits en de software die speciaal is geïmplementeerd in de technische kern van het House Ear Institute. De experimentele opstelling die in dit experiment is gebruikt, bestaat uit een Axia vert 1 3 5 TV omgekeerde microscoop met een alternatief LED-gebaseerd verlichtingssysteem en twee elektronische micromanipulatoren. Er zijn drie camerarapporten op de microscoop, een PC-gestuurde ultra-high-speed phototron, fast cam X 10 24 PCI-camera in de teleport, die een hoge resolutie heeft en beelden vastlegt met hoge frequenties tot 100.000 FPS.

De beelden van de hogesnelheidscamera worden direct op de pc-monitor geobserveerd. Een aanvullende conventionele CCD-camera in de oculairpoort is verbonden met een monitor met hoge resolutie. Een gangbare digitale fotocamera in de voorpoort maakt het mogelijk om stilstaande beelden vast te leggen; de zelfgeschreven software die op dezelfde pc draait, regelt de trigger van de hogesnelheidscamera, het verlichtingssysteem en de externe houder voor het wisselende elektrische veld.

De twee elektroden bestaan uit twee zilverdraden met een diameter van 0,25 millimeter en een tipafstand van 0,8 millimeter op een elektrische micromanipulator. Kalibreer vervolgens het elektrische veld met behulp van een externe elektrode. Deze elektrode meet het elektrisch potentiaal op verschillende punten, waardoor een kaart van het elektrische veld wordt gegenereerd.

Wanneer een enkele geïsoleerde uitwendige haarcel tussen de uiteinden van de elektroden wordt geplaatst, met de longitudinale as parallel aan het aangelegde wisselende elektrische veld, beweegt deze door te verlengen en te verkorten met dezelfde frequentie als het elektrische veld. Hier wordt bijvoorbeeld een cel getoond die wordt gestimuleerd bij 50 hertz en wordt opgenomen met 1000 frames per seconde. De volgende afbeelding toont een cel die wordt gestimuleerd bij vier kilohertz en wordt opgenomen met 18 000 frames per seconde.

Wanneer de cel loodrecht op het veld wordt geplaatst, kan een ander type buigingsrespons van de buitenste haarcel worden waargenomen en onderzocht. Deze cel buigt bijvoorbeeld wanneer hij wordt gestimuleerd bij 50 hertz met een elektrisch veld loodrecht op zijn lange as. Buitenste haarcellen kunnen vormveranderingen vertonen als reactie op niet-elektrische stimulatie.

Deze reactie wordt trage motiliteit genoemd en kan ook met deze techniek worden onderzocht. Selecteer verschillende stimulaties uit de vier verschillende protocollen. De eerste is een continue enkelvoudige frequentie.

Let op dat de stimulusmodus, frequentie, amplitude en golfvorm kunnen worden geselecteerd, welke worden aangegeven door rode cirkels in de zelfgemaakte besturingssoftware. Het tweede stimulatieprotocol is burst-enkelvoudige frequentie, waarbij de lengte van de bursts en de tussenpozen tussen de bursts aanpasbaar zijn. Het derde protocol is een lineaire sweep, waarbij de begin- en eindfrequenties aanpasbaar zijn.

Het vierde stimuleringsprotocol is multistimulatie, waardoor verschillende stimulatiemodi gecombineerd kunnen worden. Na het selecteren van de bijbehorende parameters configureert de besturingssoftware het systeem, waarna de operator met één klik op een knop op het computerscherm zowel de lichtgesynchroniseerde videoregistratie als de celstimulatie kan starten. In deze film vertonen de geïsoleerde uiterlijke haarcellen veranderingen in lengte of kromming wanneer ze worden gestimuleerd met een extern wisselend elektrisch veld dat respectievelijk parallel of transversaal staat ten opzichte van hun longitudinale as.

De responsen van de buitenste haarcellen worden offline geanalyseerd met de feature tracking-functie van de Pro Analysts-software; hier wordt een buitenste haarcel getoond die is gestimuleerd met een frequentie van 50 hertz en is opgenomen met 1000 frames per seconde. De software berekent frame voor frame de afstand tussen twee punten, zoals hier te zien is tijdens het inkorten van de cel. De afstand tussen de punten die zijn geselecteerd bij de apex (in rood aangegeven als cuticulaire plaat) en de basis van de cel (in groen aangegeven als basale pool) is kleiner en neemt toe bij celelongatie; de software voert een analyse frame voor frame uit van de veranderingen in de lengte van de buitenste haarcel.

Het paneel onderaan de afbeelding toont het spoor van de beweging. In dit voorbeeld is de totale veranderende lengte ongeveer 6,5 pixels. Hier is een voorbeeld dat aantoont dat de celrand kan worden gedetecteerd en dat het oppervlak van de optische sectie automatisch kan worden gemeten door de contour-trackingfunctie met pro analys-software.

In dit experiment worden polystyreen microsferen willekeurig aan de badoplossing toegevoegd en stevig aan het plasmamembraan gehecht. Verschillende microsferen kunnen gelijktijdig worden geselecteerd en de software kan ze vervolgens automatisch frame voor frame volgen. Op deze manier kunnen de cellen in secties worden verdeeld en kan de motiliteit van elke sectie onafhankelijk worden geëvalueerd.

Door de microsferen aan de laterale randen van de cel te selecteren, kunnen veranderingen in de lengte van elk segment en veranderingen in de hoek van één segment ten opzichte van het andere onafhankelijk worden geëvalueerd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Natuurlijk is er extra tijd nodig voor de offline analyse van de opgenomen video's. Met de juiste software kan deze analyse echter in ongeveer drie uur per video worden voltooid. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de motiele responsen van de buitenste haarcellen kunt onderzoeken, inclusief elektromotiliteit, langzame motiliteit en buiging bij akoestische frequenties.