Name: Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Leer hoe je functionele hepatocyten genereert uit menselijke embryonale stamcellen met een efficiëntie van 90%. Deze methode biedt een onuitputtelijke bron voor leveronderzoek en geneesmiddelentoxiciteitstests.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr Hooi werd ondersteund door een RCUK Fellowship, dr. West werd ondersteund door de afdeling Heelkunde, Dr Medine werd ondersteund door een subsidie ​​van de BHF Core Fund, werd de heer Baltasar Lucendo-Villarin ondersteund door een MRC PhD Studenship. Dr Zhou werd ondersteund door een beurs van de Chinese regering.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben een eenvoudig, homogeen en zeer reproduceerbaar in vitro model om schaalbare niveaus van menselijke HLCS te genereren. Ons model is gevalideerd door een aantal externe samenwerkende laboratoria. We routinematig karakteriseren van stamcellen afgeleid HLCS het gebruik van onze in-house gereedschapskist van de ontwikkelings-markers en de lever specifieke functionele assays (waarvan de meeste in de handel verkrijgbaar). De kritische stappen in ons proces zijn: het behoud van stamcellen pluripotentie, de m...

Matrigel coating platen en flacons <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> Weefselkweek platen (6 goed, 12 goed, Corning, Verenigd Koninkrijk) </li><li> Weefselkweek kolf (25 cm2 geventileerd, Corning, Verenigd Koninkrijk) </li></ol> hESC Onderhoud <ol><li> Muis embryonale fibroblasten geconditioneerde medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA); bewaren bij -20 ° C. </li><li> BSA-oplossing (50 ml, Sigma Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> Human basic fibroblast groeifactor (100 ug, Peprotech, USA); bewaren bij -20 ° C. </li></ol> Passage hESC &#39;s met collagenase <ol><li> Confluent goed of flesje hESC &#39;s. </li><li> Matrigel gecoate putten of flesjes in voorkomend geval. </li><li> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij kamertemperatuur. </li><li> Collagenase IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> Muis embryonale fibroblasten geconditioneerde medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Human basic fibroblast groeifactor (100 ug, Peprotech, USA). </li></ol> Differentiatie van hESC &#39;s de lever endoderm <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Activin A (2 ug, Peprotech, USA); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Recombinant muis Wnt3a (2 ug, R &amp; D Systems, USA); bewaren bij -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Niet-essentiële aminozuren (100 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> β-mercapto-ethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij kamertemperatuur </li><li> Leibovitz L-15 kweekmedium (500 ml, Sigmeen Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> Tryptose fosfaat bouillon (100 ml, Sigma Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij 4 ° C. </li><li> Foetale bovine serum, warmte geïnactiveerd (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Hydrocortison 21-hemisuccinaat (100 mg, Sigma Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Insuline (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> L-Glutamine (100 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Ascorbinezuur (25 g, Sigma Aldrich, Verenigd Koninkrijk); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Human HGF (10 ug, Peprotech, USA); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Recombinant humaan Oncostatin M (OSM) (50 ug, R &amp; D Systems, USA); bewaren bij -20 ° C. </li><li> Spuit gedreven filter unit 0,22 micrometer (Millipore, Verenigd Koninkrijk) </li></ol> Karakterisering van hESC afgeleid Verminderde Endoderm Immunokleuring <ol><li> Fosfaatbuffer zoutoplossing (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk); store bij kamertemperatuur. </li><li> PBST, PBS opgemaakt met 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, Verenigd Koninkrijk). </li><li> Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, VK) is gemaakt in PBS, op te slaan -20 ° C. </li><li> Glycerol (Sigma-Aldrich, VK), op te slaan bij kamertemperatuur. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, VK), op te slaan bij kamertemperatuur. </li><li> Ethanol </li><li> Serum (ABD Serotech, Verenigd Koninkrijk), bewaren bij -20 ° C. </li><li> Tweede antilichaam, Alexa fluoroforen (Molecular Probes, Invitrogen, Verenigd Koninkrijk). </li><li> Mowiol 4-88 (Polysciences Inc, USA) is samengesteld in Tris HCL en glycerol volgens instructies van de fabrikant. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, het Verenigd Koninkrijk) wordt toegevoegd aan de Mowiol oplossing bij een 1:1000 verdunning. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Primaire antilichamen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigeen * </td><td> Type </td><td> Leverancier </td><td> Verdunning </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Muis Monoklonale </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-cadherine </td><td> Muis Monoklonale </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-foetoproteïne </td><td> Muis Monoklonale </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Muis Monoklonale </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Muis Monoklonale </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Secundaire antilichamen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-muis FITC-conjugaat </td><td> Geit Monoklonale </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. De antilichamen gebruikt worden voor hESC afgeleid lever endoderm immunokleuring, de gebruikte concentraties, de soort ontwikkeld in en de bedrijven ze zijn gekocht. Functionele analyse van de lever Endoderm en Normalisatie (per mg eiwit) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits en luminometer (Promega, USA). </li><li value="1"> Witte vlakke bodem 96 goed testplaat (BD Biosciences, Verenigd Koninkrijk). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Verenigd Koninkrijk). </li><li> Transparante 96 goed testplaat (Iwaki, Verenigd Koninkrijk) </li></ol>

robuuste generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen populaties

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Ondanks de vooruitgang in het modelleren van menselijke geneesmiddelen toxiciteit, veel stoffen niet tijdens klinische studies als gevolg van onverwachte bijwerkingen. De kosten van de klinische studies substantieel zijn, daarom is het essentieel dat meer voorspellende toxicologie schermen zijn ontwikkeld en vroeg ingezet in de ontwikkeling van geneesmiddelen (Greenhough et al., 2010). Humane hepatocyten vertegenwoordigen de huidige gouden standaard model voor het evalueren van drugs toxiciteit, maar zijn een beperkte hulpbron die variabele functie vertonen. Daarom zijn het gebruik van onsterfelijk gemaakte cellijnen en dierlijk weefsel modellen routinematig ingezet als gevolg van hun overvloed. Hoewel beide bronnen zijn informatief, worden ze beperkt door een slechte werking, soorten variabiliteit en / of instabiliteit in de cultuur (Dalgetty et al. 2009). Pluripotente stamcellen (PSC&#39;s) zijn een aantrekkelijk alternatief bron van menselijke hepatocyten achtige cellen (HLCS) (Medine et al. 2010). PSC&#39;s zijn in staat om zelfvernieuwing en differentiatie van alle somatische cellen soorten gevonden in de volwassen en daarmee vertegenwoordigeneen potentieel onuitputtelijke bron van gedifferentieerde cellen. We hebben een procedure ontwikkeld die eenvoudig, zeer efficiënt, vatbaar voor automatisering en levert functionele menselijke HLCS (Hay et al., 2008; Fletcher et al. 2008; Hannoun et al. 2010; Payne et al. 2011 en Hay et al. 2011). Wij geloven dat onze technologie zal leiden tot de schaalbare productie van HLCS voor drug discovery, ziekte modelleren, de bouw van extra-lichamelijke-apparaten en eventueel cell-based therapieën transplantatie.

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om homogene niveaus van menselijke hepatocyten te produceren om menselijke leverbiologie in vitro te bestuderen. Dit wordt geïnitieerd door menselijke embryonale stamcellen of menselijke ESC's naar definitief endoderm te leiden met fysiologische stimuli die actief zijn in A en WINT drie A. Als tweede stap wordt definitief endoderm zeer efficiënt naar hepatisch endoderm geleid. Vervolgens wordt het uit menselijke ESC afgeleide hepatische endoderm in vitro gerijpt om functionele menselijke hepatocyten te produceren.Resultaten uit PCR Western blotting, immunofluorescence, Eliza's en drugsmetabolisme geven aan dat deze methode hepatocyten afleidt van menselijke ESC's met een efficiëntie van ongeveer 90%. Met deze techniek kunnen we in theorie onuitputtelijke voorraden van primaire menselijke hepatocyten genereren, die appreciabele niveaus van menselijke leverfunctie vertonen. In de toekomst zal dit het nauwkeurig voorspellen van medicijntoxiciteit ten goede komen en menselijke leverondersteuning bieden. De truc is om zonnedifferentiatie en de kerndichtheid van menselijke cellen te stimuleren.Visuele demonstratie van deze methode is cruci

robust-generation-hepatocyte-like-cells-from-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel zal zich richten op het ontwikkelen van polymeer gecoate oppervlakken voor de lange termijn, stabiele cultuur van stamcellen verkregen menselijke levercellen.

Stabiliserende Hepatocellulaire Fenotype behulp Geoptimaliseerd Synthetic Surfaces

De hier gepresenteerde methode beschrijft een schaalbaar en Good Manufacturing Practice (GMP) -ready differentiatie systeem om menselijke hepatocyt-achtige cellen uit pluripotente stamcellen te genereren. Het dient als een kosteneffectief en gestandaardiseerd systeem menselijke hepatocyt-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast onderzoek humane lever genereren.

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een platform voor het identificeren van kleine moleculen voor de behandeling van de leverziekte. Een stapsgewijze beschrijving wordt gepresenteerd detailing how to onderscheiden iPSCs in cellen met hepatocyte kenmerken in 96-wells-platen, en gebruiken van de cellen om te screenen op kleine moleculen met potentiële therapeutische activiteit.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

Dit protocol beschrijft een semi-automatische aanpak voor de productie van de hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen in de indeling van een 96 goed plaat. Dit proces is snelle en kostenefficiënte, waardoor dat de productie van kwaliteit verzekerd batches van hepatocyte-achtige cellen voor fundamenteel en toegepast menselijke onderzoek.

Semi-automatische productie van Hepatocyte als cellen uit pluripotente stamcellen

Dit protocol Details een monolayer, serum-vrije methode voor het efficiënt genereren van hepatocyte-achtige cellen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 18 dagen. Dit omvat zes stappen als hpscs sequentieel differentiëren in tussenliggende celtypen zoals de primitieve streak, definitieve endoderm, posterieure foregut en lever Bud voor ouders voor het vormen van hepatocyte-achtige cellen.

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.

Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

Het doel van dit artikel is om een gestandaardiseerde aanpak te bieden om menselijke hepatische voorloperdifferentiatie van pluripotente stamcellen te induceren. De ontwikkeling van deze procedure met kant-en-klare mediaformuleringen biedt de gebruiker een gemakkelijk systeem om menselijke levercellen te genereren voor biomedisch onderzoek en vertaling.

Hepatische voorloperspecificatie van pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd differentiatiesysteem

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC's) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).

Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

Beschikbare differentiatiesystemen voor pluripotente stamcellen (PSC) naar functionele cellen worden momenteel belemmerd door problemen van ernstige variabiliteit van lijn tot lijn en van partij tot partij. Hier presenteren we, met cardiale differentiatie als belangrijkste voorbeeld, een protocol om het proces van PSC-differentiatie intelligent te monitoren en te moduleren op basis van beeldgebaseerde machine learning.

Een op live-cell beelden gebaseerde machine learning-strategie om pluripotente stamceldifferentiatie te monitoren

Leer hoe je functionele hepatocyten genereert uit menselijke embryonale stamcellen met een efficiëntie van 90%. Deze methode biedt een onuitputtelijke bron voor leveronderzoek en geneesmiddelentoxiciteitstests.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Meer video's verkennen