Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties
26 oktober 2011
Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.
Het algemene doel van het volgende experiment is om homogene niveaus van menselijke hepatocyten te produceren om menselijke leverbiologie in vitro te bestuderen. Dit wordt geïnitieerd door menselijke embryonale stamcellen of menselijke ESC's naar definitief endoderm te leiden met fysiologische stimuli die actief zijn in A en WINT drie A. Als tweede stap wordt definitief endoderm zeer efficiënt naar hepatisch endoderm geleid. Vervolgens wordt het uit menselijke ESC afgeleide hepatische endoderm in vitro gerijpt om functionele menselijke hepatocyten te produceren.
Resultaten uit PCR Western blotting, immunofluorescence, Eliza's en drugsmetabolisme geven aan dat deze methode hepatocyten afleidt van menselijke ESC's met een efficiëntie van ongeveer 90%. Met deze techniek kunnen we in theorie onuitputtelijke voorraden van primaire menselijke hepatocyten genereren, die appreciabele niveaus van menselijke leverfunctie vertonen. In de toekomst zal dit het nauwkeurig voorspellen van medicijntoxiciteit ten goede komen en menselijke leverondersteuning bieden. De truc is om zonnedifferentiatie en de kerndichtheid van menselijke cellen te stimuleren.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de kernceldichtheid essentieel is om een homogene celpopulatie te genereren. We hebben meer dan 15 personen op vier internationale locaties getraind om deze techniek met succes uit te voeren. Begin met een cultuur van menselijke embryonale stamcellen en vermenigvuldig op matrigel-gecoate platen met behulp van muis embryonale fibroblasten geconditioneerde media ORM cm aangevuld met basis FGF.
Het is belangrijk om de menselijke ESC's zorgvuldig te karakteriseren die voorafgaand aan hepatische differentiatie worden onderhouden. Bijvoorbeeld, deze cellen vertonen menselijke ESC-morfologie. Ze drukken ook de pluripotente stamcelmarkers OCT vier en nano uit in niveaus vergelijkbaar met de positieve controle H zeven menselijke ESC-lijn.
Bovendien zijn de menselijke ESC's positief voor SS EEA vier. Wanneer menselijke E ESC's 30 tot 60%co fluentie bereiken, vervang de ME CM door vers bereid differentiatiemedium. Om hepatische differentiatie te initiëren, moet het medium om de 24 uur gedurende drie dagen worden vervangen.
Na drie dagen krijgen cellen een driehoekige uiterlijk terwijl ze beginnen te differentiëren naar een endodermale fenotypus. Schakel het medium om naar SR DMSO differentiatie. Mediumcultuur gedurende vier tot vijf dagen.
Vervang het medium om de 48 uur. Na deze periode van vijf dagen zouden cellen een polygonale uiterlijk beginnen te krijgen die kenmerkend is voor hepatische cellen. Differentiatie van menselijke ESC naar hepatisch endoderm wordt gereflecteerd in een reeks van diepgaande morfologische veranderingen tegen de negende dag.
Bovendien neemt de expressie van Octa vier over de negen dagen durende tijdsperiode progressief af. Daarentegen nemen levertranscripten van een FP en albumine vanaf dag zeven toe. Ga door met het rijpen van de cellen en het handhaven van het hepatische fenotype in het laatste medium gedurende negen dagen met vers medium om de 48 uur.
Ten slotte controleer de gekweekte cellen door fasecontrastmicroscopie op geleidelijke morfologische veranderingen van een stekelige driehoekige vorm naar een karakteristieke levermorfologie met een polygonale uiterlijk om de hepatische endodermfunctie te evalueren. Voor cytochroom P vier 50 enzymatische activiteit, specifiek SIP drie A vier of SIP één A twee. Incubeer eerst dag 17.
Menselijke ESC-afgeleide hepatische endodermcellen met de specifieke substraat die reacties in triplicates uitvoeren. Vergeet niet om weefselcultuurmedia als een negatieve controle te gebruiken en incubeer gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius. Verzamel de supernatanten en meet de relatieve niveaus van basale enzymatische activiteit zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
Bereken nu voor elk monster de enzymatische activiteit per milligram eiwit zoals bepaald door A-B-C-A-S. A immunokleuring van typische culturen afgeleid door deze methode van in vitro rijping van hepatisch endoderm. Demonstreer homogene expressie van drie menselijke levermarkers, albumine een FP en ein.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u efficiënt menselijke en leerstamcellen kunt differentiëren tot hepatocyten. Eenmaal beheerst, kan deze techniek dagelijks worden uitgevoerd met een inzet van ongeveer twee en een half minuut per miljoen cellen. Het is erg belangrijk om morfologische veranderingen dagelijks te controleren tijdens het differentiatieproces.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel richt zich op het genereren van menselijk hepatisch endoderm uit menselijke embryonale stamcellen (ESCs). Het proces is erop gericht om functionele menselijke hepatocyten te produceren voor het bestuderen van de leverbiologie in vitro.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Stamcelbiologie
- Hepatocytendifferentiatie
- In Vitro Levermodellen
Achtergrond
- Menselijke embryonale stamcellen kunnen differentiëren tot verschillende celtypen.
- Definitief endoderm is een voorloper van hepatisch endoderm.
- Een efficiënte generatie van hepatocyten is cruciaal voor leveronderzoek.
- Huidige methoden zijn erop gericht de opbrengst van functionele hepatocyten te verhogen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het produceren van menselijke hepatocyten uit ESC's.
- Om de menselijke leverfunctie en het geneesmiddelenmetabolisme in vitro te bestuderen.
- Om een bron van primaire menselijke hepatocyten voor onderzoek te bieden.
Gebruikte methoden
- Het differentiëren van ESC's naar definitief endoderm met behulp van fysiologische stimuli.
- Efficiënte conversie van definitief endoderm naar hepatisch endoderm.
- In vitro rijping van hepatisch endoderm om hepatocyten te produceren.
- Gebruik van PCR, Western blotting, immunofluorescentie en ELISA voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- De methode behaalt een efficiëntie van ongeveer 90% bij het afleiden van hepatocyten.
- De gegenereerde hepatocyten vertonen significante menselijke leverfuncties.
- Deze techniek kan zorgen voor een onuitputtelijke voorraad hepatocyten.
- Potentiële toepassingen omvatten de voorspelling van geneesmiddeltoxiciteit en leverondersteuning.
Conclusies
- De studie presenteert een levensvatbare aanpak om functionele humane hepatocyten te genereren.
- Deze vooruitgang zou leveronderzoek en medicijntesten kunnen verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen verdere toepassingen van deze techniek verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Schaalbare productie van functionele menselijke hepatocyten uit pluripotente stamcellen pakt een kritieke flessenhals in de voorspellende toxicologie aan door een hernieuwbaar, menselijk relevant model te bieden voor vroege beoordelingen van de geneesmiddelveiligheid. Deze aanpak vermindert de afhankelijkheid van variabele primaire hepatocyten en niet-menselijke systemen, waardoor het translationele vertrouwen in preklinische leverveiligheidsgegevens wordt verbeterd. Efficiënte differentiatieprotocollen maken integratie in high-throughput screening-cascades voor lead-optimalisatie en mechanisch risicobeheer mogelijk.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar hepatocyt-specifieke pathways en metabole risico's binnen een menselijke cellulaire context.
- Operationele waarde: Biedt een consistent cellulair substraat voor het beoordelen van mechanismen van door verbindingen geïnduceerde hepatotoxiciteit.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert hepatocyt-achtige cellen met meetbare cytochroom P450-activiteit voor functionele metabole profilering.
- Operationele waarde: Ondersteunt assay-standaardisatie door een differentiatie-efficiëntie van hoge kwaliteit (~90%) en homogene expressie van markers (albumine, AFP, ENaC).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen stamcelbiologie en preklinische veiligheid door cellen te verkrijgen met aanzienlijke menselijke leverfunctie voor de identificatie van metabolieten.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale beoordeling van hepatocytrijping en stabiliteit in vitro mogelijk onder gedefinieerde kweekcondities.
Integratie van pijplijn & workflow
Deze methode positioneert de productie van hepatocyten afgeleid van menselijke ESC's als een schaalbare upstream-input voor discovery biology, assayontwikkeling en preklinische veiligheidsevaluatie, waardoor continuïteit wordt ondersteund vanaf doelvalidatie tot lead-optimalisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetests van leverspecifieke targets en metabole routes met behulp van een gedifferentieerd menselijk celmodel.
- Screening: Levert assay-klare hepatocyt-achtige cellen met reproduceerbare morfologie en markerexpressie voor het screenen van compound-bibliotheken.
- Analytica: Maakt kwantitatieve read-outs van geneesmiddelmetabolisme (bijv. CYP3A4, CYP1A2 activiteit) en leverfunctie mogelijk via ELISA, PCR en immunofluorescentie.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit naar preklinische modellen door een menselijk relevant systeem te bieden voor mechanische risicovermindering van hepatotoxische verbindingen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een differentieerbaar, protocolgestuurd celproductiesysteem dat toepasbaar is in meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen bij hepatoxiciteitsbeoordeling door middel van mens-relevante metabole functie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerd differentiatieprotocol met hoge efficiëntie en minimale handmatige tijd (~2,5 minuten per miljoen cellen).
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in leverveiligheidsprofielen te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van gegevens over het menselijke hepatocytmetabolisme.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek en differentiatietechnieken.
- Afhankelijk van gedefinieerde mediumcomponenten (bijv. basaal FGF, SR/DMSO) en extracellulaire matrix (Matrigel).
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de zaaidichtheid van cellen en de timing van mediumverversing.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten variabiliteit in de responsiviteit van ESC-lijnen en de efficiëntie van endoderminductie.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van functionele validatie (bijv. CYP-activiteit, albuminesecretie) om de hepatocytenrijping te bevestigen.
