Sectioning, Staining and TEM Imaging of Embedded Exosomes: A Protocol To Visualize the Structural Features of Exosomes Using TEM
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 2:32 min • April 30th, 2023
Exosomes are nanosized, spherical vesicles enclosed by a lipid bilayer containing DNA, RNA, and protein molecules present inside the lumen.
To visualize the exosome structure using transmission electron microscopy, or TEM, begin by taking an exosome block - a solid matrix block containing the embedded exosomes. Using an ultra-microtome, obtain ultrathin sections of the exosome block.
Collect the exosome section on a suitable grid and allow it to adhere to the surface. The grid provides stable support to the exosome specimen for subsequent staining steps.
Next, position the grid over a drop of uranyl acetate - a heavy metal stain - and incubate for the desired duration. Uranyl ions interact with lipids, proteins, DNAs, and RNAs present in the exosomes.
Subsequently, stain the exosome section with lead citrate, which also binds to the exosomal biomolecules. Lead citrate weakly binds to the pre-bound uranyl ions and enhances the contrast against background during imaging.
Observe the doubly stained exosomes using TEM. TEM focuses the electron beam on the exosome sample. Stained regions in the exosome scatter electrons more strongly in comparison to the unstained regions.
The objective aperture filters these highly scattered electrons. Thus, exosomes containing stained biomolecules appear darker than the background.
Using an ultra-microtome, prepare sections with a thickness of 60 nanometers. Place the sections on a nickel grid and double stain some of them with 2% uranyl acetate for 20 minutes, followed by lead citrate for 10 minutes. Next, place the stained section into a transmission electron microscope and view the sample using 80 kV and follow automatic settings for the exposure time. With an exosome image in view, acquire and save the image using the microscope's software.
Overzicht
Dit artikel bespreekt de visualisatie van exosomen met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Er wordt gedetailleerd ingegaan op de preparatie- en kleuringsprocessen die nodig zijn om het contrast van exosomale structuren voor beeldvorming te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biofysica
Achtergrond
- Exosomen zijn nanogrote blaasjes die betrokken zijn bij intercellulaire communicatie.
- Ze bevatten diverse biomoleculen, waaronder DNA, RNA en eiwitten.
- Transmissie-elektronenmicroscopie is een krachtig instrument voor de visualisatie van cellulaire structuren.
- Kleuringstechnieken zijn essentieel voor het verbeteren van het beeldcontrast bij TEM.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het prepareren van exosomen voor TEM-beeldvorming.
- Om de effecten van verschillende kleuringsmethoden op de visualisatie van exosomen aan te tonen.
- Om het belang van de structuur van exosomen in biologisch onderzoek te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van exosoomblokjes met behulp van een ultramicrotoom.
- Kleuring met uranylacetaat en loodcitraat.
- Observatie met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 kV.
- Beeldacquisitie en opslag met behulp van microscoopsoftware.
Belangrijkste resultaten
- Gekleurde exosomen verschijnen donkerder tegen de achtergrond in TEM-beelden.
- Ultradunne coupes van 60 nanometers zijn optimaal voor beeldvorming.
- Uranylacetaat en loodcitraat verbeteren het contrast effectief.
- Het protocol maakt een duidelijke visualisatie van exosomale structuren mogelijk.
Conclusies
- De beschreven methoden zorgen voor een betrouwbare visualisatie van exosomen.
- Kleuringstechnieken zijn essentieel voor het verbeteren van de beeldkwaliteit bij TEM.
- Dit protocol kan onderzoekers ondersteunen bij het bestuderen van de biologie van exosomen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Hoge-resolutie visualisatie van structurele kenmerken van exosomen middels TEM is cruciaal voor biofarmaceutisch onderzoek in een vroeg stadium, wat een precieze karakterisering mogelijk maakt van nanometrische blaasjes die betrokken zijn bij intercellulaire communicatie. Betrouwbare beeldvormingsprotocollen ondersteunen doelwitvalidatie en het verminderen van mechanistische risico's door de integriteit van exosomen en de biomoleculaire inhoud te bevestigen. Deze mogelijkheid versterkt het voorspellend vertrouwen op cruciale beslismomenten tijdens de ontdekkingsfase en informeert beslissingen over de triage van de portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van de exosoommorfologie mogelijk ter ondersteuning van inspanningen voor targetvalidatie.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door de aanwezigheid en structuur van exosomale biomoleculen te bevestigen.
- Ondersteunt het voorspellende vertrouwen in op exosomen gebaseerde hypothesen voor ziektebeelden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde beeldvormingsresultaten voor assay-ontwikkeling en systeemvalidatie.
- Waarborgt de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van exosoompreparaten over verschillende experimenten heen.
- Levert kwantitatieve structurele gegevens ter ondersteuning van downstream screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt de karakterisering van exosomen af op translationele biomarkerstrategieën wanneer exosomen worden gebruikt als ziekterelelevante indicatoren.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de integriteit en inhoud van de blaasjes te bevestigen.
- Vermindert het risico op het doorvoeren van slecht gekarakteriseerde exosoompreparaten naar preklinische studies.
Pipeline- & workflowintegratie
Dit op TEM gebaseerde protocol voor exosoom-imaging past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek en levert fundamentele gegevens voor targetvalidatie en assaygereedheid.
- Ontdekkingsbiologie: Bevestigt de structuur en biomoleculaire inhoud van exosomen, wat hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden ondersteunt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-resultaten voor de standaardisatie van assays.
- Analytica: Maakt meting van de grootte, morfologie en kleurintensiteit van exosomen mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming met biomarkerstrategieën wanneer exosomen worden ingezet als translationele read-outs.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een gestandaardiseerd imaging-protocol dat toepasbaar is over meerdere ontdekkingsprogramma's.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in exosoomonderzoek.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare imaging-outputs voor vergelijkbaarheid tussen teams.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte voortgang van exosoomgebaseerde programma's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door robuuste structurele gegevens vroeg in de pipeline te verschaffen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in ultramicrotomie, kleuring en de bediening van een TEM.
- Vereist toegang tot geavanceerde microscopie-instrumentatie en analytische infrastructuur.
- Maakt standaardisatie van snij- en kleuringsprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende exosoombronnen of modelsystemen.
- De monstervoorbereiding en de duur van de kleuring moeten worden geoptimaliseerd voor een consistente beeldkwaliteit.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Een methode voor het verkrijgen van seriële uiterst dunne secties van micro-organismen in transmissie-elektronenmicroscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Het snijden en drijvende methode voor paraffine-ingebedde weefsel voor het segmenteren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Negative Staining of Purified Exosomes: A Procedure to Visualize Exosome Morphology Using Transmission Electron Microscopy
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Correlatieve Confocal en 3D Electron Microscopy van een specifiek Sensory Cell
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van Quantum Dot Nanodeeltjes
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026