Waarom is fixatie met paraformaldehyde noodzakelijk vóór negatief kleuren?

Paraformaldehyde vormt crosslinks tussen eiwitten en nucleïnezuren om de morfologie van exosomen tijdens de monstervoorbereiding te behouden. Deze stabilisatie voorkomt structurele instorting of aggregatie bij blootstelling aan zware metaalkleuringen. Gefixeerde exosomen behouden hun natuurlijke ultrastructuur voor een nauwkeurige TEM-visualisatie.

Hoe verbetert uranylacetaat het contrast bij de beeldvorming van exosomen?

Uranylacetaat bindt aan membraaneiwitten en lipiden, waardoor een elektronendichte afzetting rond de grens van het exosoom ontstaat. Dit creëert een donkere omtrek tegenover het lichtere interieur, wat het beeldcontrast bij TEM verhoogt. De differentiële elektronenverstrooiing maakt een duidelijke visualisatie van de vorm en grootte van het exosoom mogelijk.

Wat is het doel van het glow-ontladen van het EM-rooster vóór het laden van het monster?

Glow discharge maakt het grid-oppervlak hydrofiel, waardoor de adsorptie van de exosoom-suspensie wordt verbeterd. Dit zorgt voor een uniforme distributie en hechting van exosomen aan het grid voor consistente beeldvorming. Een correcte grid-preparatie vermindert monsterverlies en verbetert de reproduceerbaarheid.

Waarom wordt overtollig uranylacetaat na het kleuren verwijderd?

Het verwijderen van overtollige kleurstof voorkomt achtergrondruis die de grenzen van exosomen in TEM-beelden zou kunnen maskeren. Wassen met water en droogdeppen met filterpapier zorgt ervoor dat alleen de gebonden kleurstof overblijft. Deze stap is cruciaal voor het verkrijgen van contrastrijke, interpreteerbare beelden.

Hoe beïnvloedt de droogtijd de beeldkwaliteit van negatief gekleurde exosomen?

Door het raster 10 minuten bij kamertemperatuur te laten drogen, wordt een volledige verdamping van de vloeistof gegarandeerd zonder de neerslag van de kleurstof te verstoren. Te vroege beeldvorming kan leiden tot verschuiving van de kleurstof of artefacten op het raster. Correct drogen stabiliseert het monster voor een consistente TEM-acquisitie met hoge resolutie.

Negative Staining of Purified Exosomes: A Procedure to Visualize Exosome Morphology Using Transmission Electron Microscopy

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kankeronderzoek

0 weergaven • 3:10 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To perform negative staining of exosomes - nanosized, spherical vesicles - begin by taking a suitable electron microscopy grid. Prep the grid using a glow-discharger. This process makes the grid surface hydrophilic for better adhesion of samples.

Simultaneously, take a suspension of purified exosomes in a tube. Supplement the tube with paraformaldehyde - a sample fixative - and incubate. Paraformaldehyde penetrates the exosomes and cross-links the proteins and nucleic acids. This step is vital for preserving the morphology of exosomes.

Now, load the exosome suspension onto the pre-prepared grid and incubate to allow adsorption to occur. Next, add a few drops of uranyl acetate, a heavy metal stain, over the grid. Uranyl ions bind to the membrane proteins and lipids, forming a deposit around the exosome boundary.

Last, wash the grid in water to remove the excess stain. Allow the grid to dry and image using Transmission Electron Microscopy or TEM.

When an electron beam strikes the exosomes, the stain surrounding the specimen scatters more electrons. Exosomes being less electron-dense, allow the beam to pass through. These differently scattered electrons are captured by the imaging system to form a high contrast image.

Negatively stained exosomes appear lighter, with a dark boundary around them.

In order to perform negative staining, fix the purified exosomes following isolation with 1 milliliter of 2% paraformaldehyde for 5 minutes. Treat thin formvar/carbon film coated 200 mesh copper EM grids with glow discharge for 1 minute. Then, load 5 to 7 microliters of the exosome suspension solution on a grid and incubate it for 1 minute. If the concentration of exosome is too high, dilute the concentration to an appropriate level.

Gerelateerde video's

0 Bekeken

Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026

Negative Staining of Purified Exosomes: A Procedure to Visualize Exosome Morphology Using Transmission Electron Microscopy

Overzicht

Belangrijkste studiecomponenten

Wetenschappelijk vakgebied

Achtergrond

Doel van de studie

Gebruikte methoden

Belangrijkste resultaten

Conclusies

Veelgestelde vragen

Relevantie voor de industrie

Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D

Vroege ontdekking & targetvalidatie

Screening & Assayontwikkeling

Translationeel & Preklinisch Onderzoek

Integratie van pipeline en workflow

Operationele & Bedrijfsimpact

Overwegingen bij de implementatie

Veelgestelde vragen over biofarmacie

Het visualiseren van Eiwitten en macromoleculaire complexen door Negative Stain EM: van Grid Voorbereiding op Image Acquisition

Geoptimaliseerd Negatieve kleuring: een High-throughput protocol voor de behandeling Kleine en Asymmetric Protein Structure door Electron Microscopy

Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

Visualization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles Using Transmission Electron Microscopy

Sectioning, Staining and TEM Imaging of Embedded Exosomes: A Protocol To Visualize the Structural Features of Exosomes Using TEM

Gold Immunostaining of Exosomal Sections: A Technique to Visualize Diagnostic Markers in Exosomal Lumen

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie