Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

Het algemene doel van deze procedure is om productiecellijnen voor biologische stoffen met klonalititeit en hoge productiviteit te ontwikkelen. Dit wordt bereikt door eerst de gastheercel te transfecteren met DNA dat het gen van belang codeert. De volgende stap in de procedure is het isoleren van hoog producerende klonen door factsortering, gevolgd door documentatie van kolonievorming door de kloonselectiebeeldvormer.

De laatste stap is het screenen en selecteren van hoogproductieve klonen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die antilichaamproductie in continue en gevoede batchculturen laten zien via reverse-phase HPLC.Video. Demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de factsortering en pcan 80 dgl stappen moeilijk te leren zijn omdat er een complexe setup bij deze procedures betrokken is, de volgende wetenschappers uit een laboratorium zullen deze procedures demonstreren voor transfectie van de gastheerceleffect, sorteer Jason Sanders voor documentatie van kolonievorming en Russell Kan voor tecan bemonstering.

En Eliza Om deze procedure te beginnen zaai je een dag voor transfectie de gastheercellen in een celcultuurfles in 15 milliliters groei.Medium. Bewaar de cellen in een 37 graden Celsius, 7,5% koolstofdioxide incubator op de volgende dag, bereid de transfectiecomplexen voor, verdun eerst acht microgram DNA in 800 microliters groeimedium zonder serum in een steriele microcentrifugebuis voorzichtig gemengd. Verdun vervolgens 40 microliter lip in 800 microliters groeimedium zonder serum in een polystyreen buis.

Voeg het verdunde DNA toe aan het verdunde Lipofectamine. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de gastheercellen voor te bereiden op transfectie. Verwijder het groeimedium van de cellen en vervang het door 6,4 milliliters groeimedium zonder serum.

Voeg 1,6 milliliters van de transfectiecomplexen toe aan de fles. Meng voorzichtig door de fles te schudden. Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator gedurende zes uur.

Na zes uur, voeg acht milliliters groeimedium toe aan de fles en bewaar het bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator overnacht op de volgende dag. Verwijder het medium door aspiratie en voeg vers groeimedium toe aan de fles. Bewaar de cellen weer overnacht na de overnachtelijke incubatie.

Vervang het groeimedium door selectie.Medium. Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator gedurende twee tot drie weken. Twee tot drie weken na transfectie zijn de cellen klaar voor klonen door middel van flowcytometrie geactiveerde celsortering, losgeklopte cellen uit de fles en centrifugeer bij 800 RPM gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Resuspendeer de cellen in selectiemedium, aangevuld met 2% bovine serumalbumine. Voeg vervolgens fluorescent gelabeld anti-human IgG antilichaam toe. Voeg een verdunning van één tot 20 toe, incubeer op ijs gedurende 15 tot 30 minuten en was vervolgens tweemaal met koud PBS, resuspendeer cellen in één XPBS in een polypropyleen buis.

Een voorbeeld van gekleurde cellen wordt getoond in deze afbeelding voor aseptische sorteer op een BD fax aria bereid een 96-well celcultuurplaat die 200 microliter selectiemedium in elke put bevat. Laad de buis met cellen aspergisch en analyseer op de BD facts. Aria, registreer de resultaten voor gekleurde en ongekleurde cellen respectievelijk.

Stel de gates en instellingen in om enkele cellen met de gewenste fluorescentiekleuringsprofiel in de 96-wellplaat te sorteren, bewaar de plaat in een 37 graden Celsius incubator gedurende twee weken op dag nul, dag drie, dag zeven en dag 13 na factsortering documenteer kolonievorming in de 96-wellplaat op een kloonselectiebeeldvormer om te zorgen voor de selectie van klonen afkomstig van een enkele cel om te screenen en selecteren voor hoogproductieve klonen. Documenteer eerst de monsterpositie in de ontvangende 96-well assayplaat. Gebruik vervolgens een robotisch vloeistofbehandelingssysteem om aliquoten van 20 microliter supernatant over te brengen in elke put van de 96-well assayplaat, antilichaamproductie in de monsters wordt geanalyseerd door een sandwich.

Human IgG detecterend ELI SA op het vloeistofbehandelingssysteem op de volgende manier. Eerst worden de monsters en een standaard geladen op vooraf gecodeerde bio coat anti-human IgG assayplaten. De platen worden gedurende twee uur bij kamertemperatuur bewaard, gevolgd door drie PBS wasbeurten.

Vervolgens immuno pure goat anti-human IgG. HRP wordt toegevoegd aan de platen bij een verdunning van één op 2000 en de platen worden een uur bij kamertemperatuur bewaard. Na één uur worden de platen driemaal met PBS gewassen en vervolgens wordt het A BTS substraat toegevoegd.

Ten slotte worden de platen gelezen op een plate reader met behulp van absorptie bij 405 nanometer voor detectie. Met behulp van deze geautomatiseerde platform werd gevonden dat het oppervlakteantilichaamniveau, weerspiegeld door kleuring met fluorescent gelabeld anti-human IgG, correleerde met de antilichaammogelijkheid van de cel. Zoals hier voor de top twee klonen die werden gegenereerd uit de celpopulatie met hoge oppervlakteantilichaamexpressie, varieerde de specifieke productiviteit van 50 tot 70 picogram per cel per dag.

In tegenstelling daarmee was de antilichaammogelijkheid ongeveer 20 picogram per cel per dag voor de top twee klonen die werden gegenereerd uit de celpopulatie met lage oppervlakteantilichaamexpressie. Bovendien zijn cellijnen ontwikkeld door factsortering stabieler met betrekking tot antilichaamproductie dan die welke werden gekloond door middel van handmatige beperkende verdunning. De specifieke productiviteit van de top kloon kloon één, gegenereerd door handmatige beperkende verdunning, daalde van ongeveer 30 PCD tot ongeveer 10 PCD na cultivering gedurende 80 celverdubbeling.

Aan de andere kant was de top subkloon, gegenereerd door fax sortering kloon twee, in staat om de specifieke productiviteit rond de 20 PCD te handhaven gedurende ten minste 100 celverdubbeling. Identificatie van de transgenintegratieplaats in het celchromosoom door fluorescente in situ hybridisatie toonde aan dat kloon één een gemengde populatie