Een High-throughput geautomatiseerd platform voor de ontwikkeling van Manufacturing Cell Protein Therapeutics Lines voor

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van productiecellijnen voor biologische geneesmiddelen met clonaliteit en een hoge productiviteit. Dit wordt bereikt door eerst de gastheercel te transfecteren met DNA dat het gen van belang codeert. De volgende stap van de procedure is het isoleren van hoogproducerende klonen via FACS, gevolgd door documentatie van de kolonievorming met behulp van de CloneSelect Imager.

De laatste stap is het screenen en selecteren van zeer productieve klonen. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die antilichaamproductie in continue en fed-batchculturen aantonen via reverse phase HPLC. De demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor sortering en pcan 80 dgl moeilijk aan te leren zijn vanwege de complexe opstelling die bij deze procedures komt kijken. De volgende wetenschappers uit een laboratorium zullen deze procedures demonstreren voor transfectie van de gastheercel-effect, Jason Sanders voor de sortering en documentatie van kolonievorming en Russell Kan voor Tecan-bemonstering.

Om deze procedure te starten, zaai één dag voor de transfectie de gastcellen uit in een kweekfles met 15 milliliters groeimedium. Incubeer de cellen in een incubator op 37 degree Celsius en 7,5% carbon dioxide. Bereid de volgende dag de transfectiecomplexen voor: verdun eerst acht micrograms DNA in 800 microliters serumvrij groeimedium in een steriele microcentrifugebuis en meng dit voorzichtig. Verdun vervolgens 40 microliters lip in 800 microliters serumvrij groeimedium in een polystyreenbuis.

Voeg het verdunde DNA toe aan de verdunde Lipofectamine. Meng voorzichtig en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om de gastheercellen voor te bereiden op transfectie. Verwijder het groeimedium van de cellen en vervang dit door 6,4 milliliters groeimedium zonder serum.

Voeg 1,6 milliliters van de transfectiecomplexen toe aan de kolf. Meng voorzichtig door de kolf te schudden. Incubeer de cellen gedurende zes uur bij 37 °C in een CO2-incubator.

Voeg na zes uur acht milliliter groeimedium toe aan de kolf en incubeer dit de volgende dag gedurende de nacht bij 37 °C in een CO₂-incubator. Verwijder het medium door aspiratie en voeg vers groeimedium toe aan de kolf. Incubeer de cellen na deze nachtelijke incubatie opnieuw een nacht.

Vervang het groeimedium door selectiemedium. Incubeer de cellen gedurende twee tot drie weken bij 37 °C in een CO₂-incubator. Twee tot drie weken na transfectie zijn de cellen klaar voor klonering via flowcytometrie-geactiveerde celstorting (FACS). Los de cellen uit de kolf en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij 800 RPM bij 4 °C.

Resuspendeer de cellen in selectiemedium, aangevuld met 2% bovine serumalbumine. Voeg vervolgens fluorescentie-gelabelde anti-humane IgG-antilichamen toe. Voeg een verdunning van 1:20 toe, incubeer op ijs gedurende 15 tot 30 minuten en was daarna tweemaal met koud PBS; resuspendeer de cellen in 1 XPBS in een polypropyleenbuis.

Een voorbeeld van gekleurde cellen wordt in deze afbeelding getoond voor aseptische sortering op een BD FACS Aria. Bereid een 96-wellscellkweekplaat voor die 200 µL selectiemedium per well bevat. Laad de buis met cellen aseptisch en analyseer deze op de BD FACS Aria; leg de resultaten voor respectievelijk gekleurde en ongekleurde cellen vast.

Stel de gates en instellingen in om enkelvoudige cellen met het gewenste fluorescentiekleuringsprofiel in de 96-wells plaat te sorteren; incubeer de plaat gedurende twee weken in een incubator bij 37 °C. Documenteer op dag nul, dag drie, dag zeven en dag 13 na het sorteren de colony-vorming in de 96-wells plaat met een clone select imager om te garanderen dat de geselecteerde klonen afkomstig zijn van een enkele cel, om zo zeer productieve klonen te screenen en te selecteren. Documenteer eerst de monsterpositie in de ontvangende 96-wells assayplaat. Gebruik vervolgens een robotisch vloeistofbehandelingssysteem om aliquoten van 20 µL supernatant over elke well van de 96-wells assayplaat te overbrengen; de antilichaamproductie in de monsters wordt geanalyseerd via een sandwich-ELISA.

Menselijk IgG detecterende ELI SA op het vloeistofbehandelingssysteem op de volgende wijze. Eerst worden de monsters en een standaard geladen op voorgecodeerde bio coat anti-menselijk IgG assayplaten. De platen worden twee uur geïncubeerd bij kamertemperatuur, gevolgd door drie PBS-wasbeurten.

Vervolgens wordt immuno pure geit anti-menselijk IgG-HRP aan de plaatjes toegevoegd in een verdunning van 1:2000 en worden de plaatjes gedurende één uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na één uur worden de plaatjes drie keer gewassen met PBS, waarna het ABTS-substraat wordt toegevoegd.

Ten slotte worden de platen uitgelezen in een platenlezer met behulp van absorbentie bij 405 nanometer voor detectie. Met dit geautomatiseerde platform werd vastgesteld dat het oppervlakte-antilichaamniveau, weerspiegeld door kleuring met fluorescentie-gelabelde anti-menselijke IgG, correleert met de antilichaamproductiviteit van de cel. Zoals hier getoond voor de twee beste klonen gegenereerd uit de celpopulatie met een hoge oppervlakte-antilichaamexpressie, varieerde de specifieke productiviteit van 50 tot 70 picograms per cel per dag.

In contrast, was de antilichaamproductiviteit ongeveer 20 picogram per cel per dag voor de twee beste klonen die waren gegenereerd uit de celpopulatie met een lage oppervlakte-antilichaamexpressie. Bovendien zijn cellijnen die via FACS-sortering zijn ontwikkeld stabieler wat betreft de antilichaamproductie dan cellijnen die via handmatige limiterende verdunning zijn gekloond. De specifieke productiviteit van de beste kloon (kloon één), gegenereerd door handmatige limiterende verdunning, daalde van ongeveer 30 PCD naar ongeveer 10 PCD na kweek gedurende 80 celverdubbelingen.

Aan de andere kant was de beste subkloon, gegenereerd door FACS-sortering van kloon twee, in staat om de specifieke productiviteit rond de 20 PCD te handhaven gedurende ten minste 100 celdelingen. Identificatie van de integratieplaats van het transgen in het celchromosoom via fluorescentie in situ hybridisatie toonde aan dat kloon één een gemengde populatie is van fenotype A en fenotype B. In tegenstelling hiermee leek de via FACS gesorteerde kloon een homogenere populatie te zijn, waarbij 99,5% van de cellen fenotype A vertoonde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe productiecellijnen worden ontwikkeld voor de productie van therapeutische eiwitten.