Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 3:35 min • April 30th, 2023
In vertebrate kidneys, the nephrons consist of multiple glomeruli - a dense network of blood vessels - which play a primary role in the filtration of waste from the body.
To isolate glomeruli, begin by taking a freshly dissected mouse kidney. Use forceps to peel off the renal capsule from the kidney and place the clean kidney in a new culture dish. Now, position the dish over ice to avoid kidney degradation. Mince the kidney into small pieces.
Next, resuspend the minced kidney pieces in a suitable buffer solution. Filter the tissue suspension through a large-sized mesh filter and collect the flowthrough in a fresh dish. Repeat this step a few more times while progressively decreasing mesh size every time, till glomeruli dissociate from the kidney fragments.
Finally, wash the filter with the desired culture media to collect the smaller entrapped glomeruli while the kidney fragments remain in the filtrate. Transfer the glomeruli onto an ultra-low attachment plate. Visualize the plate using an inverted light microscope.
With the help of a micropipette, capture a single glomerulus and transfer it to a fresh well. Supplement the well with culture media and use the isolated glomerulus for further analysis.
After freeing the kidneys as outlined in the text manuscript, hold the kidney with the surgical forceps and use another pair of forceps to pull off the renal capsules. After this, place the kidneys into the wells of a 6-well culture plate that each contain 2 milliliters of HBSS and place the culture plate on ice.
Next, transfer the kidneys to a 100-millimeter Petri dish and use two scalpels to mince them into small pieces that are approximately 1 to 2 millimeters. Keep the minced kidney pieces wet with HBSS.
Next, place the kidney pieces on top of a 300-micrometer metal sieve and press the kidney through the sieve using the plunger from a 20-milliliter syringe. Repeatedly rinse the sieve with HBSS in between and use a serological pipette to collect the flow-through and transfer it to a clean Petri dish.
Use a scalpel to scrape off everything that remains in the bottom of the sieve and transfer it to the collected kidney homogenate. Rinse the kidney homogenate through a 75- and a 53-micrometer sieve with HBSS. Then, wash both sieves with HBSS to remove all of the smaller structures.
Collect the kidney structures and material that remain in the sieves by washing the upper surface of each with DMEM supplemented with 20% fetal calf serum and transfer the material to the wells of a 6-well ultra-low attachment microplate.
Bring the ultra-low attachment microplate to an inverted light microscope and use a 20-microliter pipette to collect single encapsulated and/or decapsulated glomeruli.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van glomeruli uit muisnieren, die essentieel zijn voor het bestuderen van de nierfunctie en pathologie. Het proces omvat zorgvuldige dissectie, fijnmaaien en filtratie van nierweefsel om zuivere glomeruli te verkrijgen voor verdere analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Nefrologie
- Celbiologie
- Renale fysiologie
Achtergrond
- Glomeruli zijn cruciale structuren in de nier die verantwoordelijk zijn voor de bloedfiltratie.
- Inzicht in de glomerulaire functie is essentieel voor de aanpak van nierziekten.
- Het isoleren van glomeruli maakt gedetailleerde studie van hun cellulaire en moleculaire eigenschappen mogelijk.
- Huidige methoden voor het isoleren van glomeruli kunnen complex zijn en vereisen precisie.
Doel van de studie
- Het bieden van een gedetailleerd protocol voor het isoleren van glomeruli uit muurnieren.
- Het faciliteren van onderzoek naar nierfunctie en ziektemechanismen.
- Het verbeteren van het begrip van de glomerulaire biologie door middel van verbeterde isolatietechnieken.
Gebruikte methoden
- Dissectie van muisnieren en verwijdering van de nierkapsels.
- Fijnmaken van het nierweefsel tot kleine fragmenten.
- Sequentiële filtratie door gaasfilters om glomeruli te isoleren.
- Gebruik van cultuurmedium voor het behoud van de geïsoleerde glomeruli.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van glomeruli met minimale contaminatie door nierfragmenten.
- Visuele bevestiging van geïsoleerde glomeruli met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop.
- Vaststelling van een reproduceerbare methode voor de isolatie van glomeruli.
- Potentieel voor verdere analyse van geïsoleerde glomeruli in diverse experimentele opstellingen.
Conclusies
- De beschreven methode biedt een effectieve benadering voor het isoleren van glomeruli.
- Deze techniek kan helpen bij het bevorderen van onderzoek naar nierbiologie en pathologie.
- Toekomstige studies kunnen geïsoleerde glomeruli gebruiken voor diverse experimentele analyses.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het isoleren van intacte glomeruli uit muinnieren maakt mechanische risicoreductie bij de validatie van renale targets mogelijk door een gezuiverd systeem te bieden om signaalpaden van pariëtale epitheelcellen te onderzoeken. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door biologische ruis van contaminerende renale weefsels te verminderen, waardoor de reproduceerbaarheid van assays voor screening gericht op signaalpaden wordt verbeterd. De techniek sluit aan bij translationele biomarkeronderzoeken in de nefrologie en biedt een ziekterelevant systeem voor de verfijning van preklinische modellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar glomerulus-specifieke pathways, zoals de activatie van pariëtale epitheelcellen, om renale targets te valideren met verminderde mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar isolatieprotocol dat variabiliteit door contaminatie met nierfragmenten minimaliseert, wat zorgt voor consistente read-outs van target engagement.
- Translationele waarde: Genereert gezuiverde glomeruli die geschikt zijn voor het kweken van ziekterelevante celuitgroei, wat hypothesetesting in een gecontroleerd ex vivo systeem faciliteert.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert intacte ingekapselde en gedekapsuleerde glomeruli die de natuurlijke architectuur behouden, wat een betrouwbare beoordeling mogelijk maakt van de effecten van verbindingen op het gedrag van glomerulaire cellen.
- Operationele waarde: Produceert glomeruli die compatibel zijn met ultra-low attachment plates, waardoor de kweekcondities worden gestandaardiseerd voor schaalbare screening-workflows.
- Translationele waarde: Ondersteunt de assay-gereedheid voor downstream-toepassingen zoals geneesmiddelentesten en ziektemodellering door contaminatievrije glomerulaire preparaten te leveren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vestigt een ziekterelevant systeem om glomerulaire pathofysiologie te bestuderen, waardoor ontdekkingsbevindingen worden verbonden met preklinische validatie in muismodellen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale analyse van geïsoleerde glomeruli onder gecontroleerde kweekcondities mogelijk, wat de consistentie van gegevens in preklinische studies verbetert.
- Translationele waarde: Faciliteert de afstemming van biomarkers door moleculaire profilering van pariëtale epitheelcellen in een gezuiverde glomerulaire context mogelijk te maken.
Integratie van pipeline & workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm door gezuiverde glomeruli te leveren voor target-validatie-assays, die leiden tot lead-identificatie via padspecifieke readouts, en ondersteunen de preklinische continuïteit via gestandaardiseerde glomerulaire preparaten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het toetsen van hypothesen over glomerulaire routes door glomeruli te isoleren zonder tubulaire contaminanten, waardoor doelspecifieke mechanismen worden verduidelijkt.
- Screening: Levert glomeruli die geschikt zijn voor kwantitatieve cellular outgrowth assays, wat de reproduceerbaarheid in screeningscampagnes voor verbindingen verbetert.
- Analytiek: Maakt visualisatie en acquisitie van enkelvoudige glomeruli mogelijk via geïnverteerde microscopie, wat discrete eenheden oplevert voor gestandaardiseerde moleculaire of fenotypische read-outs.
- Translationeel onderzoek: Verbindt geïsoleerde glomeruli met preklinische continuïteit door een gezuiverd systeem te leveren voor het evalueren van doelmodulatie in een nier-relevante context.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform dat toepasbaar is op meerdere glomerulaire doelwitten en ziektemodellen, waardoor redundante protocolontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door het elimineren van storende signalen van niet-glomerulaire nierweefsels.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie door sequentiële filtratie- en wasstappen, wat de reproduceerbaarheid van glomerulaire preparaten tussen verschillende laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door het mogelijk maken van vroege risicoreductie van renale doelwitten in een fysiologisch relevant systeem.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door duidelijkere mechanistische resultaten te leveren vanuit geïsoleerde glomerulaire systemen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microschirurgische dissectie en steriele weefselbehandeling om de integriteit van glomeruli tijdens de isolatie te bewaren.
- Afhankelijk van toegang tot gegradeerde maasfilters (300-, 75-, 53-micrometer) en culturenplaten met lage hechting voor effectieve scheiding en kweek.
- Noodzaak tot gestandaardiseerde HBSS- en DMEM-gebaseerde buffers tussen teams om een consistente glomeruli-opbrengst en levensvatbaarheid te garanderen.
- Omvat aanpassingen bij het toepassen van het protocol op verschillende muizenstammen of ziektemodellen die de grootte of fragiliteit van de glomeruli beïnvloeden.
- Beperkt door de noodzaak van handmatige selectie van glomeruli onder de microscoop, wat de doorvoersnelheid bij screening van grote volumes kan beperken zonder integratie van automatisering.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Single-channel Analyse en Calcium Imaging in de podocytes van de Vers geisoleerde glomeruli
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van de Glomeruli en In Vivo Labeling van glomerulaire cel oppervlakte-eiwitten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Extracting Intact Kidney from Mouse: A Technique to Obtain Kidney Without Renal Capsule from Murine Models
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Murine Renal Cell Isolation: A Technique to Isolate and Generate Primary Culture of Renal Tubular Epithelial Cells
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Beoordeling van de nierfunctie in muismodellen van glomerulaire ziekte
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van voorwaardelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen van de muis met fluorescerende mitochondriën
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026