Murine Renal Cell Isolation: A Technique to Isolate and Generate Primary Culture of Renal Tubular Epithelial Cells
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kankeronderzoek
0 weergaven • 3:21 min • April 30th, 2023
To isolate renal tubular epithelial cells or TECs, begin by taking a freshly isolated mouse kidney in a Petri dish. Peel off the renal capsule - the thin outer layer surrounding the kidney - and remove the medulla or the innermost part of the kidney, leaving the cortex containing the tubule and the tubular epithelial cells.
Mince the remaining kidney parts into small pieces and incubate them in a warm digestion buffer containing the enzyme collagenase. Collagenase breaks down the collagen protein that holds the renal tissues together, releasing the renal tubules and the renal cells into suspension.
Filter the suspension to remove undigested kidney tissues. Next, add pre-chilled culture media to the filtrate. The lower temperature neutralizes collagenase and stops further tissue digestion. Centrifuge the filtrate at low speed to allow the denser tubules and tubular cells to settle while other cell types and impurities remain suspended.
Remove this undesired supernatant fraction and add culture media to resuspend the pellet. Seed the suspension in a collagen-coated culture dish and incubate. The free tubular cells attach firmly to the collagen while the tubules remain suspended. Sub-culture to remove the unattached tubules and obtain the primary culture of tubular epithelial cells.
To process the harvested kidneys, first, remove the renal capsules and medulla. Then, mince both kidneys into tiny pieces and incubate them in 10 milliliters of a digestion buffer in a 37 degrees Celsius oven with gentle rotation for 5 minutes.
After the digestion, remove any undigested tissues by passing the buffer through a 70-micron filter. After collecting the digested tissue, add 10 milliliters of culture media to stop the digestion. Next, centrifuge the filtered tissue suspension at 50 x g for 5 minutes to pellet the tubular cells. Then, transfer the supernatant to a new tube, add 5 milliliters of culture media, and repeat the centrifugation to collect any remaining tubular cells.
Now, resuspend the first pellet in 20 milliliters of culture media and centrifuge it at 50 x g for 5 minutes to further purify the collected cells. Dispose of the supernatant. Then, resuspend both pellets in 10 milliliters of culture medium. Next, count the living cells using Trypan Blue staining. Then, seed up to 10 million cells onto a 60-millimeter collagen-coated dish and let the tubular cells attach overnight.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren van renale tubulaire epitheelcellen (TECs) uit muisnieren. Het proces omvat weefseldigestie, filtratie en celkweektechnieken om een primaire kweek van TECs te verkrijgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Nefrologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Renale tubulaire epitheelcellen zijn cruciaal voor de nierfunctie.
- De isolatie van TEC's is essentieel voor het bestuderen van nierziekten.
- Collagenase wordt veelvuldig gebruikt voor weefseldigestie.
- Correcte kweekcondities zijn noodzakelijk voor celadhesie en groei.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor het isoleren van TEC's uit muisnieren.
- Om onderzoek naar renale celbiologie en pathologie te faciliteren.
- Om het begrip van de nierfunctie en ziekte-mechanismen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van muisnierden en verwijdering van de nierkapsels en het merg.
- Vertering van nierweefsel met collagenase in een warme buffer.
- Filtratie om onverteerd weefsel te verwijderen en centrifugatie om cellen te pelletteren.
- Kweek van geïsoleerde TECs in met collageen gecoate schaaltjes.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare renale tubulaire epitheelcellen.
- Vestiging van primaire culturen met aangehechte tubulaire cellen.
- Demonstratie van effectieve celtelling met behulp van Trypan Blue-kleuring.
- Het protocol levert hoogwaardige TEC's op voor verdere experimenten.
Conclusies
- De beschreven methode is efficiënt voor het isoleren van TEC's uit muisnieren.
- De geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor diverse biologische assays.
- Dit protocol kan bijdragen aan de vooruitgang van renaal onderzoek en therapeutische strategieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
De isolatie van primaire renale tubulaire epitheelcellen maakt mechanische risicoreductie bij de validatie van nefrologische targets mogelijk door een ziekterelevant systeem te bieden voor functionele assays. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door directe analyse van de tubulaire pathofysiologie en de effecten van verbindingen op de renale epitheliale functie. De methode faciliteert translationele continuïteit vanaf de targetidentificatie tot aan de preklinische evaluatie van nier-specifieke mechanismen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele analyse van renale tubulaire pathways en target engagement mogelijk in een context van primaire cellen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor het beoordelen van targetmodulatie en cellulaire fenotypes.
- Strategische waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targets door directe meting van epitheliale responsen op farmacologische perturbaties.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een gezuiverde epitheliale populatie die geschikt is voor high-throughput extracellulaire flux- en moleculaire profilering.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde primaire cellen op die geschikt zijn voor miniaturisering en automatisering van assays.
- Strategische waarde: Maakt betrouwbare compound-screening mogelijk in een fysiologisch relevant renale celmodel.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vestigt een ziekterelevant systeem voor het modelleren van niertubulaire beschadiging en herstelmechanismen.
- Operationele waarde: Ondersteunt preklinische effectiviteits- en veiligheidsprofielering in een primaire, mens-relevante celcontext.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door mechanistische read-outs van renale targetmodulatie te verschaffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De geïsoleerde tubulaire epitheelcellen dienen als een fundamenteel, assay-klaar systeem dat de brug slaat tussen doelwitvalidatie en functionele screening en preklinische beoordeling bij de ontdekking van nefrologische geneesmiddelen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen voor tubulus-specifieke targets en padmodulatie in primaire cellen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare cellulaire read-outs voor het profileren van het effect van verbindingen.
- Analytica: Maakt meting van metabole flux, levensvatbaarheid en signaleringsoutputs mogelijk om structuur-activiteitsrelaties te bepalen.
- Translationeel onderzoek: Biedt continuïteit van target hit naar preklinisch model door het behoud van het epitheliale fenotype en de functie.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een schaalbaar platform voor primaire cellen dat toepasbaar is op meerdere renale targets en modaliteiten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door de afhankelijkheid van geïmmortaliseerde cellijnen te verminderen en de fysiologische relevantie te vergroten.
- Operationele waarde: Levert een gestandaardiseerde, schaalbare celpreparatie die compatibel is met multi-well formats en geautomatiseerde verwerking.
- Strategische waarde: Verbetert de prioritering van de portfolio door vroege functionele validatie in een nierspecifiek systeem.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door target-interactie te koppelen aan epitheliale functionele uitkomsten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie van primaire cellen, weefseldigestie en steriele kweektechnieken.
- Afhankelijk van de controle over de collagenase-activiteit en collagen-gecoate oppervlakken voor een betrouwbare aanhechting van epitheelcellen.
- Vereist gestandaardiseerde celtelling en levensvatbaarheidsbeoordeling om consistentie tussen experimenten te waarborgen.
- Aanpassing aan menselijke weefsels of weefsels uit ziektemodellen kan optimalisatie van de digestie- en scheidingsparameters vereisen.
- Opbrengst en zuiverheid worden beïnvloed door de weefselkwaliteit en de duur van de enzymatische digestie, wat procesbewaking noodzakelijk maakt.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Microdissection van primaire renale weefsel segmenten en integratie met nieuwe steiger-vrije constructie technologie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Een efficiënte zeven methode te isoleren Intact Glomeruli van de nier van volwassen ratten
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en cultuur van primaire neuronen en Glia van volwassen rat urineblaas
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Ontwikkeling van primaire culturen van menselijke niertubulaire epitheelcellen in monolagen en driedimensionale omstandigheden
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van primaire menselijke proximale tubule-epitheelcellen en hun gebruik bij het maken van een microfysiologisch model van de proximale niertubuli
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 29 augustus 2026